ランダムコニカルチルト方式を使用したエキソソーム複合体の単粒子の電子顕微鏡再構成

次の実験の全体的な目標は、ランダム円錐傾斜法を使用してエキソソーム複合体の3次元構造を取得することです。これは、最初に炭素膜の薄層を聖なる炭素グリッド上に堆積させて、タンパク質複合体と染色のサポート基板を第2のステップとして作成することによって達成されます。試料と染色物はグリッドに塗布され、グリッドは試料を重金属塩に埋めます。

次に、電子顕微鏡検査を実施して、試料の傾斜顕微鏡写真のペアを取得します。最後に、エキソソーム複合体の三次元構造を示す結果が、ランダム円錐傾斜法を用いた画像解析に基づいて得られます。一般的に、この方法に不慣れな人は、ランダムコニカルチルト法の標本の適切な準備が難しい場合があり、Viewに続く画像処理の手順が難しいため、苦労するでしょう。

この方法のデモンストレーションは、サンプル評価の図解なしではグレードと試料の準備手順を学ぶのが難しいため、非常に重要です。ランダム円錐傾斜法の原理では、電子顕微鏡内で試料の同じ領域の一対の顕微鏡写真を撮影する必要があります。1枚の写真は傾斜していない位置で標本を撮影し、もう1枚の写真は50度から70度の角度で傾斜した標本を撮影しています コンピュータを使用して、デジタル化された顕微鏡写真のペアを並べて置き、同じ粒子からの画像を選択していますこの図

これらの画像は、3次元座標の数字でマークされています。傾いていない粒子とその傾いたパートナーの画像は、傾斜軸の方向と傾斜角度によって互いに相関しています。傾いていない粒子画像の整列は、方位角空間を埋める傾斜粒子の複数の画像を使用して、傾斜粒子の画像をaMule位置として対応するものにし、分子の三次元構造は、グリッドを最初に製造するために後方投影アルゴリズムを使用して再構築することができ、0.45グラムのポリビニルホルマル樹脂を添加して0.5%formのVAR溶液を準備し、 90ミリリットルのクロロホルムを100ミリリットルのガラスビーカーに。

ドラフトで、ビーカーをアルミホイルで覆い、フォームバーレジンを溶かします。8の小さな攪拌子と磁気攪拌で、樹脂が溶解するのに約15分かかります。その間、事前に洗浄された顕微鏡スライドガラスをメタノールとKimワイプで洗浄します。

フォーム後、var樹脂は完全に溶解します。クロロホルムでは、溶液の表面に50%グリセロールの1ミリリットルを加えます。添加されたグリセロールの量を調整すると、聖なる炭素の穴の密度に影響します。

超音波の先端を溶液に傾けます。約1インチの深さで、最大電力を使用して1分間超音波処理すると、グリセロール液滴のエマルジョンが溶液の形で作られます。より長い超音波処理は、聖なる炭素の穴のサイズを小さくします。

このステップの後、溶液は乳白色になります。超音波処理浸漬の直後に、きれいなガラスはエマルジョンに垂直にスライドします。1秒間、それらを取り出し、濾紙を使用してスライドの底を拭き取り、スライドの表面に薄いプラスチックフィルムを形成します。

クロロホルムが蒸発した後、光学顕微鏡でフィルムの穴の密度とサイズを確認します。ここで説明する準備条件では、直径が3〜4マイクロメートルの400メッシュグリッドの各正方形に10〜20個の穴が開けられます。スライドガラスが乾いたら、スライド面のプラスチックフィルムの端を切ります。

スライドを垂直に水に浸して、フィルムを蒸留水の表面に浮かせます。水面の薄膜は、光の反射に対してちらりと見える角度で観察することができます。400メッシュの銅グリッドを、グリッドの滑らかな表面を下に向けて1つずつフィルムに配置します。

グリッドが描かれたプラスチックフィルムを紙で拾います。紙を裏返して乾かします。ペトリ皿で、紙をメタノールに浸して穴に残っているグリセロールを取り除き、紙を風乾させます。

カーボンエバポレーターを使用して、グリッドをカーボンの層で約20ナノメートルの厚さにコーティングします。蒸発時間を使用して、希望の厚さに制御します。厚さは、既知の厚さの炭素層の灰色と比較した炭素の灰色によって決定することができる。

ガラスのペトリ皿にクロロホルムでカーボン層状のグリッドを30分浸してフォームvarフォームvarの除去を取り除き、続いてグリッドを乾燥させると自家製の聖なるカーボングリッドが得られます。次に、約5ナノメートルの厚さの炭素の薄層を、切断したばかりの雲母表面に蒸発させます。次に、聖なるカーボングリッドを蒸留水の下の濾紙に慎重に置きます。

自家製の装置で、雲母の表面から薄い炭素を水面に浮かべ、それをゆっくりと聖なる炭素グリッドに堆積させます。グリッドが貼られた濾紙を手に取り、乾かします。ヒュームフードで、新鮮な2%小便器ギ酸溶液を作ることにより、エキソソーム複合体の陰性染色を開始します。

書面による手順に記載されているように、溶液チューブをアルミホイルで覆います 光への露出を防ぐために、溶液も同じように使用する必要があります。デイグローは、グロー放電装置を使用して、完全にカーボングリッド上に1つの薄い炭素を放電します。次に、パーフィルの上に50マイクロリットルの小便器ギ酸染色液の液滴3個をベンチピペットでピペットに載せ、エキソソーム複合体を約50ナノモルの濃度に希釈し、希釈したタンパク質の4マイクロリットルの希釈バッファーピペットを使用して、グリッドが発光するまで

サンプルをグリッド上に1分間置いてから、ピンセットを使用して濾紙で残留溶液を吸い取ります。最初の汚れの液滴のすぐ上にグリッドを反転させ、グリッドを数回前後に動かして約10秒間すすぎます。最後のすすぎ後、3つの汚れ液滴のそれぞれについてこのプロセスを繰り返し、汚れをさらに1分間グリッドにとどめます。

次に、濾紙で汚れを拭き取ります。グリッド表面に汚れ溶液の薄い層を保持し、グリッドをドラフトで乾燥させます。サンプルグリッドをサンプルホルダーに置き、ホルダーをFEI TE nine 12電子顕微鏡に入れます。

低倍率でサンプルグリッドをチェックして、最適な染色された正方形を見つけます。良い正方形には、約1〜2マイクロメートルの寸法の12個の穴があり、その中に暗い汚れた領域があるように見えます。FEIユーザーインターフェースの低線量モードをオンにし、検索フォーカスを合わせて低線量モードで位置を露出させます。

カメラの長さが 1.5 メートルの分数モードに検索を設定します。フォーカスを150K倍率に設定し、露光時間を50K倍率に設定し、露光時間を1秒で測定します。通常、検索モードと露出モードの両方でグリッド上の認識可能なフィーチャを使用して、配置を実行します。

検索モードで染色の良い穴を見つけ、位置を保存します。正方形のCCD写真を撮ります。試料を55度に傾けて、別の写真を撮ります。

2つの画像を比較し、2つの顕微鏡写真に対になった穴を特定します。ステージを 0 度に傾けます。低線量キットを使用して、探索モードで特定された各穴の写真を高倍率で、約マイナス0.7マイクロメートルの焦点ぼ

すべての穴の写真を撮った後、同じ倍率でステージを55度に傾けます。傾いた標本の顕微鏡写真を、約マイナス1.2マイクロメートルの焦点ぼけで撮影します。自家製の聖なる炭素グリッドの不規則なパターンを使用して、低倍率顕微鏡写真のパターンに基づいて、対応する顕微鏡写真の傾斜ペアを特定します。

相関関係を高めるには、分布の均一な粒子と粒子の周囲にハローがないマイクログラフの傾斜ペアを選択します。周囲に明らかな汚れハローがある顕微鏡写真は、データを処理するために破棄する必要があります。プログラムのセットアップから開始します 手順で。

画像処理は、Emanパッケージのプロセス2Dを使用してデモンストレーションされます。画像形式を変更するには、iMagic 5パッケージで2Dアライメントを行い、スパイダーパッケージを行います。3D再構築と改良を行うには、DM3ガタンデジタル画像をスパイダー画像形式に変換します。

process 2Dコマンドを使用して、パーティクルペアをピックします。スパイダープログラムパッケージで配布されているWebプログラムを使用して、プログラムはスパイダースクリプトを使用して選択したすべてのパーティクルをボックスアウトするパーティクルの座標を自動的に保存します。スクリプトは、傾いたパーティクルスタックと傾いていないパーティクルスタックを保存します。

国連の傾斜粒子をIMAG 5形式に変換します。EM 2 EM プログラム バンド パスを使用して、IMAG 5 の InCorp prep コマンドを使用して UN 傾斜粒子をフィルタリングし、マスクし、バンド パス マスクされた粒子を中央に配置 中央コマンドを使用します。imag five では、IMAG 5 プログラムを自動的に実行するバッチ スクリプトを使用して、粒子を反復的に均質なクラスに整列および分類します。

次に、IMAG 5のMSA names in classコマンドを使用して、粒子のクラスのルックアップテーブルを生成し、headerコマンドを使用して各粒子のアライメントの平行移動と回転値のプロットファイルを生成します。iMagic 5では、EM two EMプログラムを使用して、整列した粒子をスパイダー形式に変換します。次に、クラスルックアップテーブルをスパイダードキュメントファイルに変更します。

各粒子のアライメントの平行移動と回転の値は、スパイダードキュメントファイルバンドパスフィルターにも変換され、IMAG 5の傾いていない粒子の場合と同様に、傾いた粒子をマスクして中央に配置し、中央に傾いた粒子の新しいデータセットを生成します。IMAG fiveから生成されたマルチリファレンスアライメントドキュメントとWebプログラムによって生成されたDCBファイルから、角度ドキュメントファイルを作成します。spider で後方投影スクリプトを使用して、クラス平均ごとに 1 つの初期モデルを取得します。

最後に、傾斜していないすべてのパーティクルに対してスパイダースクリプトを使用して初期ボリュームの投影リファインを実行し、RCTを使用して最終ボリュームを取得します。エクソソームの約50の再構成が得られています。ボリュームは、傾斜していないパーティクルの 50 クラスの各パーティクルに対応する傾斜パーティクルから生成されます。

スパイダーパッケージに実装されたバックプロジェクションを使用して、プロジェクションマッチングの改良が行われ、これらのボリュームを初期モデルとして使用し、表示されたエクソソームの3Dボリュームを約18アンの追加解像度で生成することで、複合体のさまざまな部分の原子モデルを3Dマップにダッキングすることができます。このビデオを見た後、RCTを使用して、標本の良好な物語立位グリッドの生成からピアツーピア顕微鏡写真への3次元再構成を取得する方法、そして最後に画像分析技術を使用して再構成を取得する方法について十分に理解できるはずです。ここで説明したプロトコル以外にも、画像解析で最終的な再構成を得る方法はいくつかあります。

信頼性の高い正しい再構成を得るための最も重要なステップは、十分に準備された標本で作業することです。