ランダムコニカルチルト方式を使用したエキソソーム複合体の単粒子の電子顕微鏡再構成

本実験の全体的な目的は、ランダム円錐傾斜法を用いてエクソソーム複合体の三次元構造を得ることです。まず、タンパク質複合体の支持基板とするために、ホーリーカーボングリッド上にカーボンフィルムの薄層を堆積させ、次に染色剤を塗布します。試料と染色剤をグリッドに適用することで、試料を重金属塩で包み込みます。

次に、電子顕微鏡を用いて試料の傾斜ペアマイクログラフを撮影します。最終的に、ランダム円錐傾斜法を用いた画像解析に基づき、エクソソーム複合体の三次元構造を示す結果が得られます。一般的に、この手法に不慣れな方は、ランダム円錐傾斜法のための適切な試料調製や、その後の画像処理の手順に苦労することがあります。

試料評価のデモンストレーションがない状態で、等級判定および試料調製のステップを習得することは困難であるため、本手法の提示は極めて重要です。ランダム円錐傾斜法の原理では、電子顕微鏡内で試料の同一領域の顕微鏡写真を1ペア撮影する必要があります。1枚は試料を傾斜させない状態で撮影し、もう1枚は試料を50度から70度の角度で傾斜させて撮影します。コンピュータを用いて、デジタル化された顕微鏡写真のペアを並べて配置し、この実演では同一の粒子からの画像を選択します。

これらの画像は3次元座標の番号でマークされています。傾斜させていない粒子と、それに対応する傾斜させた粒子の画像は、傾斜軸の方向と傾斜角度によって互いに相関しています。傾斜させていない粒子の画像をアライメントすることで、方位角空間を埋める複数の傾斜粒子画像を用いて、傾斜させた粒子の画像を対応するasMuleの位置に導きます。これにより、逆投影アルゴリズムを用いて分子の3次元構造を再構成できます。まずグリッドを作製します。100 mLのガラスビーカーに0.45 gのポリビニルホルマル樹脂と90 mLのクロロホルムを加え、0.5%のform VAR溶液を調製します。

ドラフトチャンバー内で、ビーカーをアルミホイルで覆い、Formvar樹脂を溶解させます。小型のスターラーバーを用いてマグネチックスターラーで撹拌すると、樹脂の溶解に約15分かかります。その間に、あらかじめ洗浄済みの顕微鏡用ガラススライドをメタノールとキムワイプで清掃します。

クロロホルム中でフォームvar樹脂が完全に溶解した後、溶液の表面に50%グリセロールを1 mL加えます。添加するグリセロールの量を調整することで、ホーリーカーボンの孔密度を制御できます。

超音波ホモジナイザーのチップを溶液に浸します。深さ約1インチのところで最大出力を用い、1分間ソニケーションを行います。これにより、溶液形態のグリセロール液滴のエマルションが形成されます。ソニケーション時間を長くすると、ホーリーカーボンの孔径がより小さくなります。

この工程の後、溶液は乳白色になります。超音波洗浄後、直ちに清潔なガラススライドをエマルションの中に垂直に浸します。1秒後にスライドを取り出し、フィルターペーパーでスライドの底面を吸い取り、スライド表面に薄いプラスチックフィルムを形成させます。

クロロホルムが蒸発した後、光学顕微鏡でフィルム内の孔の密度とサイズを確認します。ここで説明した作製条件では、400メッシュのグリッドの各正方形に10〜20個、直径が3〜4 µmの孔が形成されるはずです。ガラススライドが乾燥したら、スライド表面にあるプラスチックフィルムの端を切り取ります。

スライドを水に垂直に浸し、蒸留水の表面にフィルムを浮かせてください。水面に浮かんだ薄膜は、光の反射を利用して斜めの角度から観察できます。400メッシュの銅グリッドの平滑面を下に向けて、1枚ずつフィルムの上に配置します。

紙片を用いて、グリッド付きのプラスチックフィルムを拾い上げます。紙を裏返しにして乾燥させてください。ペトリ皿の中で、紙をメタノールに浸して孔内の残留グリセロールを除去し、その後、自然乾燥させます。

カーボンエバポレーターを用いて、グリッドに約20 nanometersの厚さのカーボン層をコーティングします。このとき、蒸着時間を調整することで目的の厚さを制御します。厚さは、既知の厚さを持つカーボン層の灰色と比較して、カーボンの灰色を確認することで判断できます。

フォームバールを除去するため、カーボン層付きグリッドをガラス製ペトリ皿に入れたクロロフォームに30分間浸し、その後グリッドを乾燥させることで、自家製のホーリーカーボングリッドを作製します。次に、新しく劈開したマイカ表面に、厚さ約5 nmの薄いカーボン層を蒸着させます。その後、ホーリーカーボングリッドを蒸留水の下にあるフィルターペーパーの上に慎重に置きます。

自作の装置を用いて、マイカ表面にある薄いカーボンを水面に浮かべ、それをゆっくりとホーリーカーボングリッド上に転写させます。グリッドが載ったフィルターペーパーを回収し、乾燥させます。ドラフトチャンバー内で、新鮮な2%ギ酸ウロニル溶液を調製し、エクソソーム複合体のネガティブ染色を開始します。

記載の手順に従い、光への曝露を防ぐため、溶液チューブをアルミホイルで覆います。溶液は同日に使用してください。グロー放電装置を用い、カーボン格子全体に薄いカーボンをグロー放電させます。次に、ベンチ上に清潔なパラフィルムを置きます。パラフィルムの上に、ウラニルホルマート染色溶液を50 µLずつ3滴滴下します。希釈バッファーを用いて、エクソソーム複合体を約50 nMの濃度に希釈します。希釈したタンパク質4 µLを、グロー放電させた格子の上にピペットで滴下します。

サンプルをグリッド上に1分間静置し、その後、ピンセットでフィルターペーパーを用いて残留溶液を吸い取ります。すぐにグリッドを反転させ、1滴目の染色液の上に置き、グリッドを前後に数回動かして約10秒間すすぎます。この工程を3滴すべての染色液で繰り返し、最後のすすぎの後、染色液をさらに1分間グリッド上に静置させます。

次に、フィルターペーパーで染料を吸い取ります。グリッド表面に染料溶液を薄い層だけ残し、ドラフトチャンバー内でグリッドを乾燥させます。サンプルグリッドをサンプルホルダーにセットし、ホルダーをFEI TE nine 12電子顕微鏡に導入します。

低倍率でサンプルグリッドを確認し、染色の状態が最も良い正方形を探します。良好な正方形は、サイズが約1〜2 µmの孔が10個程度あり、その内部が濃く染色されているように見えます。FEIユーザーインターフェースの低線量モード（low dose mode）をオンにし、低線量モードでサーチフォーカスと露光位置を調整します。

サーチモードをフラクションモードに設定し、カメラ長を1.5 meterに設定します。フォーカスを150 K倍に設定し、露光を50 K倍、露光時間を1秒に設定します。通常、サーチモードと露光モードの両方でグリッド上の認識可能な特徴を用いてアライメントを行います。

サーチモードで染色の良好な孔を特定し、その位置を保存します。正方形のCCD写真を撮影します。試料を55度に傾け、もう一枚の写真を撮影します。

2枚の画像を比較し、2枚の顕微鏡写真におけるペアの孔を特定します。ステージを0度に傾け戻します。低線量キットを用い、探索モードで特定した各孔を、デフォーカス約-0.7 µmの高倍率で撮影します。

すべてのホールを撮影した後、同じ倍率のままステージを55度に傾けます。約−1.2 µmのデフォーカスで、傾斜させた試料の顕微鏡写真を撮影してください。自家製ホーリーカーボングリッドの不規則なパターンを用いて、低倍率の顕微鏡写真にあるパターンに基づき、対応する傾斜ペアの顕微鏡写真を特定します。

相関を助けるために、粒子が均等に分布し、粒子の周囲にハローがないマイクログラフの傾斜ペアを選択してください。粒子の周囲に明らかな染色のハローがあるマイクログラフは、データ処理の前に除外する必要があります。手順の中のプログラム設定から開始してください。

画像処理は、Emanパッケージのprocess 2Dを用いて実演します。画像形式を変更し、2Dアライメントを行うにはiMagic fiveパッケージを使用し、その後spiderパッケージを使用します。3D再構成およびリファインメントを行うために、GatanデジタルイメージのDM 3形式をspider画像形式に変換します。

process 2Dコマンドを使用して、粒子ペアを選択します。spiderプログラムパッケージに同梱されているウェブプログラムを使用すると、プログラムが自動的に粒子の座標を保存し、spiderスクリプトを用いて選択したすべての粒子をボックスアウトして抽出します。このスクリプトにより、傾斜のある粒子スタックと傾斜のない粒子スタックの両方が保存されます。

UN tilted particlesをIMAG five形式に変換します。EM two EMプログラムのバンドパスを用い、IMAG fiveのInCorp prepコマンドを使用してUN tilted particlesをフィルタリングし、マスクします。その後、centerコマンドを用いて、バンドパスマスクされた粒子をセンタリングします。IMAG fiveにおいて、IMAG fiveプログラムを自動的に実行するバッチスクリプトを使用し、粒子を均質なクラスに反復的にアラインおよび分類します。

次に、IMAG5のnames in classコマンドを使用して粒子のクラスルックアップテーブルを生成し、headerコマンドを用いて各粒子の配向に関する並進および回転値のプロットファイルを生成します。iMagic5において、EM2EMプログラムを使用して、アライメント済みの粒子をspider形式に変換します。その後、クラスルックアップテーブルをspiderドキュメントファイルに変換します。

各粒子の精合における並進および回転の値もSpiderドキュメントファイルに変換します。IMAG5で傾斜していない粒子に対して行ったのと同様に、傾斜した粒子のバンドパスフィルタリング、マスキング、および中心合わせを行い、中心合わせ済みの傾斜粒子用の新しいデータセットを作成します。IMAG5で生成されたマルチリファレンス精合ドキュメントと、Webプログラムで生成されたDCBファイルから、アングルドキュメントファイルを作成します。Spiderの逆投影スクリプトを使用して、各クラス平均に対する初期モデルを1つずつ取得します。

最後に、spiderスクリプトを用いて、すべての非傾斜粒子に対して初期ボリュームの投影リファインメントを行い、RCTにより最終ボリュームを算出します。これにより、エクソソームの再構成像が約50個得られました。これらのボリュームは、非傾斜粒子の50個のクラスの各粒子に対応する傾斜粒子から生成されています。

spiderパッケージで実装された逆投影法を用い、投影マッチングによる精査を行いました。これらのボリュームを初期モデルとして使用し、約18 Åの分解能でエクソソームの3Dボリュームを生成しました。これにより、複合体のさまざまな部位の原子モデルを3Dマップに組み込むことができます。このビデオを視聴することで、標本の良好なナラティブ・スタンディング・グリッドの作成から、マイクログラフの取得、そして画像解析技術を用いた再構成の取得に至るまで、RCTを用いて三次元再構成を行う方法について十分に理解できるはずです。ここで説明したプロトコルの他に、画像解析において最終的な再構成を得るための手法はいくつか存在します。

信頼性と正確性の高い再構成を行うために最も重要なステップは、十分に調製された標本を使用することです。