埋め込まれたエクソソームの切片化、染色、およびTEMイメージング:TEMを使用してエクソソームの構造的特徴を視覚化するためのプロトコル

エクソソームは、内腔内に存在するDNA、RNA、およびタンパク質分子を含む脂質二重層で囲まれたナノサイズの球形小胞です。

透過型電子顕微鏡(TEM)を使用してエクソソーム構造を視覚化するには、エクソソームブロック(埋め込まれたエクソソームを含む固体マトリックスブロック)を採取することから始めます。ウルトラミクロトームを使用して、エクソソームブロックの極薄切片を取得します。

エクソソームセクションを適切なグリッドに集め、表面に付着させます。グリッドは、その後の染色ステップのためにエクソソーム検体を安定してサポートします。

次に、グリッドを酢酸ウラニル(重金属の染色剤)の一滴の上に置き、所望の時間インキュベートします。ウラニルイオンは、エクソソームに存在する脂質、タンパク質、DNA、RNAと相互作用します。

続いて、エクソソーム部分をクエン酸鉛で染色し、クエン酸鉛もエキソソーム生体分子に結合します。クエン酸鉛は、事前に結合したウラニルイオンに弱く結合し、イメージング中のバックグラウンドとのコントラストを高めます。

TEMを使用して二重染色されたエクソソームを観察します。TEMは、電子ビームをエクソソームサンプルに集束させます。エクソソームの染色領域は、未染色領域と比較して電子をより強く散乱させます。

対物レンズの開口部は、これらの高度に散乱した電子をフィルタリングします。したがって、染色された生体分子を含むエキソソームは、背景よりも暗く見えます。

ウルトラミクロトームを使用して、厚さ60ナノメートルの切片を調製します。切片をニッケルグリッドに置き、一部を2%酢酸ウラニルで20分間二重染色し、続いてクエン酸鉛を10分間染色します。次に、染色切片を透過型電子顕微鏡に入れ、80 kV を使用してサンプルを観察し、露光時間の自動設定に従います。エクソソーム画像が表示された状態で、顕微鏡のソフトウェアを使用して画像を取得して保存します。