肺のエンジニアリングのための手順

この手順の全体的な目標は、形態学的および生理学的に天然の肺組織に匹敵する培養物で肺組織を生成することです。これは、最初に成体のラットから心臓と肺を採取することによって達成されます。次のステップは、肺動脈と気管をカニューレ挿入し、カニューレ挿入された肺をバイオリアクターに接続して脱細胞化することです。

脱細胞化とすすぎの後、肺は無菌培養バイオリアクターに移され、着座の準備が整います。手順の最後のステップは、準備された細胞集団で肺の目的のコンパートメントに播種することです。最終的には、免疫蛍光顕微鏡法により、脱細胞化された細胞外マトリックスに、局所特異的な肺マーカーを発現する細胞が効率的に再増殖することを示す結果を得ることができます。

この技術が既存のin vitroで肺細胞を培養する方法と比較した場合の主な利点は、細胞が分化した表現型を長期間維持するため、生物学的に由来する3次元基質で数週間研究できることです。脱細胞化のためには、肺は血管カニューレを介してバイオリアクターキャップに接続され、キャップは脱細胞化装置に接続されます。肺の上のガラス瓶は、リングスタンドと付属のクランプで固定されています。

この時点で、細胞材料を除去して細胞外マトリックス足場を生成することができ、細胞材料で再増殖させることができます。この図に、人工肺組織の播種と培養のためのバイオリアクターの組み立てが示されています。気管カニューレのルアーロックコネクターは、気管リザーバーとメインチャンバーの間の呼吸ループに接続されています。

呼吸ループには、2つの一方向バルブが含まれています。媒体が肺に出入りする経路が異なるような位置。内皮細胞の播種のために、小さなリザーバーが一時的に灌流ラインに組み込まれます。

拍動ポンプは、リザーバーから肺の血管コンパートメントに細胞を運ぶために使用されます。血管灌流はローラーポンプを使用して行われます。培地は、取り付けられたカニューレを介して肺動脈に灌流され、肺血管系を通って肺静脈から直接メインバイオリアクターに流れ込み、そこで培地が灌流のために引き上げられます。

肺上皮は、呼吸ループに注射によって着座します。肺と気管リザーバーを含むメインチャンバーは、長期の肺培養に使用されます。肺が摘出され、動脈と気管が正しくカニューレ挿入されると、摘出されたばかりの肺は漏れることなく空気を保持する必要があります。

これは、液体に浸した状態で空気で膨らませることで確認できます。空気漏れを示す気泡があってはなりません。プロトコルを開始するには、肺がいっぱいになるまでニトロプレスナトリウム側を含むPBSで肺を膨らませますが、過度に膨らませないようにすぐに気管カニューレをキャップして、肺が膨らんだままになるようにします。

次に、水銀15ミリメートルで少なくとも15分間、PBSとSNPで肺を灌流します。その後、気管カニューレからストッパーを取り外して、肺が収縮できるようにします。必要に応じて、PBSとSNPによる15〜30分間の灌流を続けます。

PBSとSNPを補充して、滲出圧力が10〜15ミリメートルの水銀柱に維持されるようにします。長期の脱細胞化の手順を開始するために、バイオリアクターキャップを脱細胞化装置に接続します。次に、肺がキャップに接続されます。

YS形状のカニューレにリンクされたルアーロック接続を使用して、肺動脈カニューレが灌流ラインに接続し、気管カニューレが自由に浮く必要があります。組織の完全な脱細胞化を確実にするためには、システムに空気を入れないようにすることが重要です。動脈カニューレと気管カニューレの一方向弁は、チューブ内の逆流を可能にすることにより、チューブ内の気泡を取り除くのに役立ちます。

したがって、シリンジで気泡を取り除くことができるように、すべてのラインに空気が入っていないことを確認してください。脱細胞化溶液で灌流を開始します。脱細胞化溶液で灌流します。

500ミリリットルの溶液が肺を貫通するまで、最適な圧力は15ミリメートル水銀未満です。これには通常2.5時間かかります。流量は通常、最初は非常に遅く、2時間目には急速に増加して1分あたり約1ミリリットル以上になります。

灌流中に定期的に除去され、肺と気管カニューレを支えるのに十分な液体が残っていることを確認しながら、バイオリアクターから脱細胞化液を使用しました。脱細胞化液による灌流が完了したら、肺とバイオリアクターを組織培養フードに移します。臓器のすすぎを開始するには、脱細胞化液が入った500ミリリットルの瓶を取り外し、最大1リットルの滅菌PBSが入った滅菌瓶と交換します。

真空吸引またはシリンジを使用して、同じ方法で10〜15ミリメートルの水銀で血管系を介してラインにPBSを灌流する空気が流れていないことを確認します。脱細胞化に関しては、滅菌技術を使用して、バイオリアクターから廃物PBSを定期的に除去し、PBSジャーを交換または補充します。新鮮な滅菌PBSを使用して、少なくとも2.5リットルの滅菌PBSが肺に灌流されるまですすぎ続けます。

これには通常、脱細胞化プロセスの開始からすすぎが完了してから2日かかります。新鮮なPBSと10%FBSと10%ペン連鎖球菌を含む新しい滅菌バイオリアクターシステムに肺を移し、灌流ループ全体と気道ライン全体が液体で満たされていることを確認します。ここからは、拍動性ポンプを使用して、毎分5ミリメートルで肺を灌流します。

10%FBSと10%ペニシリンストレプトマイシンを含むPBSで一晩灌流することにより、肺細胞外マトリックス足場を滅菌します。このステップを完了した後、肺を摂氏37度のインキュベーターに1時間、または温度が平衡するまで移します。ベン・ネーズによる治療の準備として、次のステップはベン・ネーズによる肺の治療です。

各肺の残存DNAを除去するには、まず10ミリリットルのシリンジ1本にプレウォームベンナーゼバッファーのみを満たし、10ミリリットルのシリンジ1本に1ミリリットルあたり90ユニットを充填します。Ben NaseをBen Nase緩衝液で希釈。肺の灌流を止めます。

次に、肺に空気が注入されないようにしながら、ベンネーズバッファーで気道を膨らませます。肺が1分間収縮するのを待ちます。次に、Ben Nase溶液で肺を膨らませます。

繰り返しになりますが、ベンネーズで膨らませた後、肺に空気を入れないように注意してください。肺を灌流または換気なしで摂氏37度で1時間放置します。1 時間の終わりに、PBS と 10% FBS 10% ペニシリン ストレプトマイシン (すでにバイオリアクター内にあるストレプトマイシン) で灌流を再開し、翌日に一晩灌流を続けます。

すすぎと滅菌の後、長い細胞外マトリックス足場を細胞再増殖のために準備できます。P-B-S-F-B-Sベンゾを250ミリリットルの培養液と交換します。細胞を導入する前に少なくとも1時間ミディアムパフをし、細胞を播種する直前に新鮮な培地と交換します。

多くの細胞源は臓器の後退に利用できます。ここでは、上皮細胞集団の座席を示します。まず、所望の上皮細胞集団の細胞懸濁液15ミリリットルを含む注射器を調製する。

次に、気道リザーバーに80ミリリットルの培地を入れ、すべての換気ラインに空気が入っていないことを確認します。次に、バイオリアクターを摂氏37度の組織培養インキュベーターに置き、シリンジポンプを接続して換気します。15ミリリットルの細胞懸濁液を気管カニューレに注入することにより、単一の高速ボーラスを使用して細胞を肺に播種します。

メインバイオリアクターのエアフィルターがキャップされていることを確認してください。その後、すぐにシリンジポンプを使用して1回のゆっくりとした呼吸を開始し、毎分3ミリリットルでメインバイオリアクターから60ミリリットルの空気を引き出します。これは約20分間続きます。

A:その後約18時間、肺を静止させます。毎分約0.5ミリリットルでゆっくりと血管 ?? 流を開始します。.臓器培養中、灌流は通常、1分間に1〜3ミリリットルで行われます。

上皮培養中にローラーポンプを使用すると、換気は通常、1分間に1回の呼吸と5〜10ミリリットルの一回換気量で連続的に行われます。シリンジポンプを使用して、空気を周期的に引き抜き、バイオリアクターに注入して、メインチャンバー内の負圧と大気圧を交互に切り替えて呼吸に影響を与えます。換気中はバイオリアクターを気密に保つ必要があるため、換気を毎日一時停止し、メインチャンバー内の空気を交換する必要があります。

また、培地はおよそ3〜4日ごとに交換する必要があります。培養中、総量の約半分を毎回肺上皮と血管内皮を培養して交換する必要があります。バイオリアクターに取り付けられた足場内で、短時間でガス交換に参加できる肺組織を生成することができます。

ここでは、天然ラット肺の標準的なヘマット、トイン、およびエオイン染色を、脱細胞化ラット肺のHおよびe染色と比較するために示しています。最終的な脱細胞化された細胞外マトリックスは、細胞材料を完全に欠いており、天然の肺の肉眼的、微視的、および超構造的特性を保持する必要があります。h染色とe染色は、細胞の播種とその後の肺の培養に最適な条件であるすすぎが不十分な脱細胞化またはすすぎの結果として足場に付着した残留DNAの視覚化を可能にします。

また、バイオリアクターは、肺の5つの葉すべてによく分布した細胞を生成し、細胞外マトリックスの足場の約70%をカバーする必要があります。これらの画像は、免疫蛍光法で染色した場合の天然肺と再増殖した肺を比較したものです。主要な肺マーカーについては、培養細胞集団はクララ細胞分泌タンパク質、分泌タンパク質、分泌タンパク質C、アクアポリン5に陽性です。

目的のマーカーは赤で表示され、DAPI染色された核はすべてのパネルで青で示されています。脱細胞化から退縮までのこの手順をマスターすると、適切に実行すれば4〜5日で完了します。