肺のエンジニアリングのための手順

本手順の全体的な目的は、形態学的および生理学的に生体肺組織に匹敵する培養肺組織を作製することである。まず、成ラットから心臓と肺を採取する。次に、肺動脈と気管にカニューレを挿入し、カニューレを挿入した肺を脱細胞化用バイオリアクターに接続する。

脱細胞化と洗浄の後、肺を滅菌培養バイオリアクターに移し、播種（seeding）の準備を行います。本手順の最終ステップは、準備した細胞群を肺の目的のコンパートメントに播種することです。最終的に、免疫蛍光顕微鏡観察により、脱細胞化された細胞外マトリックスに、領域特異的な肺マーカーを発現する細胞が効率的に再構築された結果を得ることができます。

この手法の既存のin vitro肺細胞培養法に対する主な利点は、細胞が分化した表現型を長期間維持できることであり、これにより、生物由来の3次元基質中で数週間にわたって研究することが可能になります。脱細胞化では、肺を血管カニューレ経由でバイオリアクタキャップに接続し、そのキャップを脱細胞化装置に接続します。肺の上にあるガラス瓶は、リングスタンドと取り付けられたクランプで固定されます。

この時点で、細胞成分を除去して細胞外マトリックススキャフォールドを作製することができ、そこに再び細胞を播種することが可能です。工学的に作製した肺組織の播種および培養のためのバイオリアクターの組み立てをこの図に示します。気管カニューレのルアーロックコネクタは、気管リザーバーとメインチャンバーの間の呼吸ループに接続されます。

呼吸ループには2つのワンウェイバルブが組み込まれています。これにより、培地が肺への流入時と流出時で異なる経路を辿るよう配置されています。また、血管内皮細胞を播種させるため、灌流ラインに小型のリザーバーが一時的に組み込まれています。

脈動ポンプを用いて、リザーバーから肺の血管区画へ細胞を輸送します。血管灌流にはローラーポンプを使用します。培地は装着されたカニューレを介して肺動脈に灌流され、肺血管系を流れて肺静脈からメインのバイオリアクターへと直接排出され、そこで灌流用に培地が吸い上げられます。

肺上皮を呼吸ループ内に注入して配置します。肺を含むメインチャンバーと気管リザーバーは、長期的な肺培養に使用されます。肺を摘出し、動脈と気管に適切にカニューレを挿入した後、摘出したばかりの肺は空気漏れなく空気を保持できる必要があります。

これは、液体に浸した状態で空気を注入することで確認できます。空気漏れを示す気泡が発生しないことを確認してください。プロトコルを開始するには、肺が十分に膨らみ、かつ過膨張にならない程度まで、ニトロプルシドナトリウムを含むPBSで肺を膨らませます。その後、すぐに気管カニューレにキャップをはめ、肺が膨らんだままの状態を維持します。

次に、15 mmHgの圧力で、PBSおよびSNPを用いて肺を少なくとも15分間灌流します。その後、気管カニューレのストッパーを取り外し、肺を虚脱させます。必要に応じて、PBSおよびSNPによる灌流をさらに15〜30分間継続してください。

PBSとSNPを補充し、灌流圧が10～15 mmHgに維持されるようにします。長期脱細胞化の手順を開始するために、バイオリアクターのキャップを脱細胞化装置に接続します。次に、肺をキャップに接続します。

Y字型カニューレに連結されたルアーロック接続を用いて、肺動脈カニューレを灌流ラインに接続し、気管カニューレは自由に浮かせた状態にします。組織を完全に脱細胞化させるためには、システム内に空気が混入しないようにすることが極めて重要です。動脈および気管カニューレに設けられたワンウェイバルブにより、チューブ内の逆流が可能となり、チューブ内の気泡を排除することができます。

したがって、シリンジを用いて気泡を除去し、すべてのラインに空気が混入していないことを確認します。脱細胞化溶液による灌流を開始します。脱細胞化溶液で灌流します。

500 millilitersの溶液が肺に灌流されるまで、最適な圧力は15 millimeters of mercury未満に維持します。これには通常2.5時間かかります。流量は、最初は通常非常に低く設定し、2時間目に約one milliliter per minute以上に急速に増加させます。

灌流中、バイオリアクターから使用済みの脱細胞化液を定期的に除去しますが、その際、肺と気管カニューレを維持するのに十分な液量が残るようにしてください。脱細胞化液による灌流が完了したら、肺とバイオリアクターを組織培養フードに移します。臓器の洗浄を開始するために、脱細胞化液が入った500 milliliterのジャーを取り外し、最大1 literの滅菌PBSが入った滅菌ジャーと交換します。

真空吸引またはシリンジを用いてライン内に空気が混入していないことを確認し、同様の方法で 10 ～ 15 mmHg の圧力で PBS を血管系に灌流させます。脱細胞化の際と同様に、無菌操作を用いてバイオリアクターから廃 PBS を定期的に除去し、PBS ジャーを交換または補充してください。新鮮な滅菌 PBS を用い、少なくとも 2.5 L の滅菌 PBS が肺に灌流されるまで洗浄を継続します。

脱細胞化プロセスの開始から洗浄が完了するまで、通常2日間かかります。肺を、新鮮なPBSに10%FBSおよび10%Pen strepを添加した新しい滅菌バイオリアクターシステムに移し、灌流ループ全体と気道ライン全体の両方に液体が満たされていることを確認してください。ここからは、脈動ポンプを使用して、5 mm/minで肺を灌流します。

10% FBSおよび10%ペニシリン・ストレプトマイシンを含むPBSを用いて一晩灌流し、肺細胞外マトリックススキャフォールドを滅菌します。この工程の完了後、肺を37 °Cのインキュベーターに移し、1時間または温度が平衡状態になるまで保持します。Ben Nase処理の準備として、次のステップで肺をBen Naseで処理します。

各肺の残留DNAを除去するために、まず10 milliliterシリンジ1本に予め加温したBen Naseバッファーのみを充填し、もう1本の10 milliliterシリンジにBen Naseバッファーで希釈した90 units per milliliterのBen Naseを充填します。肺への灌流を停止してください。

次に、肺に空気が注入されないように注意しながら、Ben Nase緩衝液で気道を膨らませます。1分間、肺を脱気させます。その後、Ben Nase溶液で肺を膨らませます。

再び、Ben Naseで膨らませた後、肺に空気が入らないよう注意してください。灌流や換気を行わずに、37 °Cで1時間静置します。1時間後、バイオリアクター内にあるPBSに10% FBSおよび10% ペニシリン・ストレプトマイシンを添加した溶液で灌流を再開し、翌日まで一晩灌流を継続します。

すすぎと滅菌後、長い細胞外マトリックススキャフォールドを細胞再播種に向けて準備します。P-B-S-F-B-S benzo溶液を250 millilitersの培養液に交換し、細胞を導入する前に少なくとも1時間灌流させ、細胞を播種する直前に新鮮な培養液に交換します。

臓器再生には多くの細胞源を利用できます。ここでは、上皮細胞集団を用いた播種について実演します。まず、目的の上皮細胞集団の細胞懸濁液 15 milliliters を入れたシリンジを用意します。

次に、気道リザーバーに80 millilitersの培地を満たし、すべての通気ラインから空気が除去されていることを確認します。その後、バイオリアクターを37 degrees Celsiusの組織培養インキュベーターに入れ、通気用のシリンジポンプを接続します。15 milliliterの細胞懸濁液を気管カニューレに注入し、単回急速ボーラス投与によって細胞を肺に播種します。

メインバイオリアクターのエアフィルターにキャップがされていることを確認します。その後、直ちにシリンジポンプを用いて、メインバイオリアクターから空気を3 mL/minの速度で60 mL吸引し、ゆっくりと1回の呼吸を行います。この操作には約20分かかります。

その後、肺を約18時間静置します。次に、約0.5 milliliters per minuteで緩やかな血管灌流を開始します。臓器培養中の灌流は、通常1 to 3 milliliters per minuteで行われます。

上皮培養においてローラーポンプを使用する場合、通常、換気は1分間に1回の呼吸速度、および5〜10 mLの一回換気量で連続的に行われます。シリンジポンプを使用する場合は、メインチャンバー内の圧力を陰圧と大気圧で交互に変化させることで呼吸を再現するため、空気を周期的に吸引および注入します。換気中にバイオリアクターの気密性を維持する必要があるため、換気は毎日一時停止し、メインチャンバー内の空気を交換する必要があります。

さらに、培地は約3〜4日ごとに交換する必要があります。培養中、肺上皮および血管内皮を培養することで、毎回全容量の約半分を交換します。バイオリアクターに装着されたスキャフォールド内で、短時間ながらガス交換が可能な肺組織を生成することができます。

脱細胞化されたラット肺のH&E染色と比較するため、ここに正常なラット肺の標準的なヘマトキシリン・エオシン染色を示します。最終的な脱細胞化細胞外マトリックスは、細胞成分が完全に除去されており、かつ正常な肺の肉眼的、顕微鏡的、および超微形態的特性を保持している必要があります。H&E染色により、脱細胞化や洗浄が不十分であった結果としてスキャフォールドに残留しているDNAを可視化することができ、細胞播種およびその後の肺培養に最適な条件を確認することが可能になります。

バイオリアクターにより、肺の5つの葉すべてに細胞が均一に分布し、細胞外マトリックススキャホールドの約70%が被覆される必要があります。これらの画像は、免疫蛍光染色を施した天然の肺と再細胞化した肺を比較したものです。主要な肺マーカーについて、培養された細胞集団はClara細胞分泌タンパク質（pro secretory protein C）およびAquaporin fiveに対して陽性を示しています。

すべてのパネルにおいて、目的のマーカーは赤色で、DAPI染色の核は青色で示されています。この手順に習熟すれば、脱細胞化から再細胞化まで、適切に行えば4〜5日間で完了させることができます。