Name: 心原性誘導効率を定量化するために修飾されたマウス胚性幹細胞ベースのアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学ぶマウス胚性幹細胞を用いた心原性誘導効率の定量化法。Wnt/β-cateninとBMPシグナル伝達の重要な時間窓を特定し、心筋細胞分化の時間的制御を標準化します。再生医療研究に応用可能です。

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1。 96丸底マイクロタイタープレートを使用して胚様体（EB）形成<ol><li> LIFを添加したマウスES細胞培地で10cmの細胞培養プレート中のマウスES細胞を成長する。 </li><li> ES細胞は、（一般に50〜70％コンフルエントで）使用するための準備ができたら、ESのメディアを削除し、5ミリリットル滅菌PBSで細胞を1回すすいでください。 </li><li> 3〜5分間、37℃それぞれのプレートとプレートを、° Cに2ミリリットル0.05％トリプシン/ EDTAを追加、3ミリリットルESのメディアとのトリプシンEDTAはクエンチ。 </li><li> 3分間、1000rpmで50ミリリットルファルコンチューブやスピンに細胞を移す。 </li><li>上清を除去、およびEBメディア所望の量で再懸濁し細胞ペレット。 </li><li>細胞数をカウントし、EB培地で5 × 10 3細胞/ mlに細胞を希釈する。 </li><li>ラウンドウェルマイクロタイタープレート - 96の各ウェルに細胞を含むEBメディア100μlのを追加するには、マルチチャンネルピペットを使用してください。 </li><li>場所96 - インキュベーターに丸い穴マイクロタイタープレート。 </li></ol> 2。心臓発生のための重要なシグナル伝達経路の重要な時間窓の識別（S） <ol><li>各96など0日、1日目、2日、3日と4日目、井戸の等ハーフのような種々の時点でES細胞を含む96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに固有のシグナル伝達経路や車両制御の変調器を追加します。ウェルプレート（48ウェル）、治療の各々の開始時点に使用されます。 </li><li>別の停止時点ですべての48ウェル用EBメディアを変更することにより、変調器を洗浄する。例えば、0日目から始まるES細胞の二日間の治療を得るために、2日目で変調器を洗い流す。 48時間より長い治療のためには、希望する停止時点まで2日ごとに新鮮な変調器を添加したEBのメディアを変更してください。 </li><li> 7日後に顕微鏡下でEBの収縮を調べます。それぞれ別の処理時間のコースでEBSを契約の割​​合を得るには正のものとしてEBSを契約して井戸を得点する。 </li><li> ESの心臓発生の重要な時点は、車両のコントロールと比較して変調器に信号を送ることによって処理されたEBSを契約の割​​合が最も高いが含まれる時間枠です。 </li></ol> 3。ハング滴から作られたEBSで心臓発生のためのシグナリングのタイムウィンドウの検証<ol><li>蒸発を防ぐために、PBSの3-4 mlを加えることによってペトリ皿を準備します。 </li><li> 2.5x10 4細胞/ mlの最終細胞密度でES細胞を準備する手順1.1〜1.5に従ってください。 </li><li>簡単にアクセスするための細菌の皿に細胞混合物を注ぐ。マルチチャンネルピペットを使用して、反転蓋の上に20μlの滴（約500細胞を含む）に追加します。個々の液滴が触れないように注意してください。一般的に1つ蓋は80滴まで収めることができます。 PBSを含むシャーレ上の裏蓋を反転します。インキュベーターでEBを形成させるために24時間または48時間インキュベートする。 </li><li> EBのメディアとプールEBの2ふた新しいシャーレに3mlでそれぞれの蓋から液滴をぶら下げから形成されたEBをきれいに洗う。 10ミリリットルの合計体積にEBのメディアを追加します。 </li><li> 4日目で0.2％ゼラチンコートした6ウェルプレート上に懸濁液中の転送EBの。一般的に30にEBは各ウェルに転送されます。各ウェルの2ミリリットル最終容量を得るためにEBのメディアを追加します。 </li><li> 96ウェルプレートの実験から同定された期間でのシグナル伝達モジュレーターをインキュベートする。 </li><li>必要に応じて7日目と心臓発生後に顕微鏡下でEBの収縮を観察し、さらに、RT - PCR、免疫染色などによって特徴付けられ得る。 </li></ol>

<ol><li>Fukuda, K., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+as+a+source+of+regenerative+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes.</a> Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).</li>
<li>Foley, A. C., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+induction+by+Wnt+antagonists+depends+on+the+homeodomain+transcription+factor+Hex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex.</a> Genes Dev. 19, 387-396 (2005).</li>
<li>Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+biphasic+roles+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+cardiomyogenesis+and+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).</li>
<li>Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin%2C+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling%2C+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ハンギングドロップ法では、EB形成のためとin vitroにおける分化に使用される従来の方法であった。しかし、それは面倒ですし、物流の懸念のために実験的な柔軟性を制限します。実験者のスキルがハングしドロップとして成功したEBの形成と操作に不可欠なものと同じトークンによって、結果にも検証がより困難です。簡単な方法は、単一ステップのプロセスとして、丸底96ウェルプレートでEBSを形成することである。このフォーマットを標準化するためにin vitroでの分化に可能にし、EBの形成と下流の操作の容易さ（例えば、変調器の追加や削除）のために多くの実験条件に対応することができます。さらに、96ウェルプレートフォーマットは、マウスES細胞における効率的なスクリーニングツールとなるように最適化することができます。

<ul><li>マウスCGR8細胞が主に使用されています。 </li><li> ES培地：10％熱不活性化FBS、2mMのL -グルタミン、0.05 mM 2 - メルカプトエタノール、および200 U / mlのマウスLIFを添加したGMEMメディア。 </li><li> EB培地は20％熱不活化FBS、1.6 mMのL -グルタミン、0.08 mM 2 - メルカプトエタノール、および1X MEM非必須アミノ酸溶液とIMDMメディアを準備します。 </li></ul>

心原性誘導効率を定量化するために修飾されたマウス胚性幹細胞ベースのアッセイ

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

多能性幹細胞の分化は、しっかりと、複数のキーのシグナル伝達経路の時間的および空間的な調節によって制御されます。その理解へのハードルの一つは、分化の効率に重要なシグナル伝達事象の変化を相関させる様々な方法となっています。ここでは/ Wntシグナルβ-カテニンと心原性誘導時のBMPシグナルの活性化のための重要な時間枠を特定するためにマウス胚性幹（ES）細胞ベースのアッセイの使用について説明します。 96ウェルプレートフォーマットで胚体（EB）を契約のために得点することにより、我々はすぐに心原性効率性を定量化し、/ Wntシグナルβ-カテニンおよび特定の変調器の治療法は、次の時間経過におけるBMPシグナルの活性化のための重要な時間枠を識別することができます。ここで概説するプリンシパルは、単独で心臓の誘導に限定されるものではなく、他の多くの細胞系譜の研究に向かって適用することができます。さらに、96ウェルフォーマットでは、さらに高いスループット、より洗練された実験的な仮説のテストを可能にするために自動化されたアッセイとして開発される可能性があります。

我々は、/ Wntシグナルβ-カテニンと心原性誘導時のBMPシグナルの活性化のための重要な時間枠を識別するために、マウスES細胞ベースのアッセイの使用について説明します。方法は、確実に心原性効率を定量的に標準化されたプラットフォームを提供し、それが他の細胞系譜の研究に適用可能である。

多能性幹細胞の分化は、複数の主要なシグナル伝達経路の時間的および空間的な制御によって厳密に制御されています。一つのハードルは……

本実験の全体的な目的は、マウス胚性幹細胞の心筋細胞分化に必要な重要な時間的制御を特定することである。この目的を達成するため、まず96ウェル丸底プレートを用いて胚様体（EB）を形成し、第2ステップとしてEB形成を標準化する。その後、あらかじめ設定したタイムコースに従ってタンパク質または化学修飾因子をEBに添加し、検討対象となる経路の時間的制御を行う。次に、さまざまな信号変調スキームの誘導効率を決定するため、拍動するEBSを手动で定量します。拍動するEBSの形成率およびハンギングドロップ法による確認に基づき、心筋細胞分化における必須シグナル伝達経路の時間的要件を示す結果が得られます。ハンギングドロップ法のような既存の手法に対するこの技術の主な利点は、労力のかかる手順を標準化および簡略化し、定量のための直接的な読み取りを可能にすることです。この手法は、目的の細胞型への分化を誘導する必須のシグナル伝達経路の特定など、幹細胞生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手順を開始するには、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor）を添加したマウスES細胞培地を用い、10 centimeterの細胞培養プレートでマウス胚性幹細胞（ES細胞）を培養します。ES細胞が50〜70%のコンフルエンスに達した時点で、使用可能な状態となります。ES培地を除去し、5 mLの滅菌PBSで細胞を1回洗浄します。各プレートに0.05% trypsin EDTAを2 mL加え、37 °Cで3〜5分間インキュベートします。次に、1プレートあたり3 mLのES培地を加えてtrypsin EDTAを失活させ、細胞を50 mL遠心チューブに移します。1000 rpmで3分間遠心分離します。遠心後、上清を除去し、任意の量のEB培地で細胞ペレットを再懸濁します。細胞数を計測し、細胞密度を5×10³ cells/mLに希釈します。マルチチャンネルピペットを用い、細胞を含むEB培地100 µLを96穴丸底マイクロタイタープレートの各ウェルに分注します。必要な96穴プレートの枚数は、実験の条件数およびタイムポイントによって異なります。心臓形成における主要なシグナル伝達経路の重要な時間窓を特定するため、96穴丸底マイクロタイタープレートを、加湿された37 °C、5% CO2インキュベーター内に設置します。特定のシグナル伝達経路のモジュレーターをES細胞に添加します。96ウェル丸底プレートの各ウェルに、培地で希釈したシグナル伝達モジュレーターを様々なタイムポイントで添加します。各96ウェルプレートのウェルの半分を、各処理開始タイムポイントに使用します。各タイムポイントにおいて、残りの48ウェルにビークルコントロールを添加します。異なる停止時点において、培地を交換することで各ウェルからシグナル伝達調節剤を洗い流しますが、その際、胚体（EB）を乱さないよう細心の注意を払う必要があります。異なる停止時点において、ウェルのEB培地を交換し、調節剤を洗い流します。96ウェルプレートを約10度の角度に傾け、マルチチャンネルピペットでウェルから培地を静かに除去します。その後、48時間を超える処置を行う場合は、各ウェルにモジュレーターを含まないEB培地を補充します。目的の停止時間まで、2日ごとに新鮮なモジュレーターを添加したEB培地へと交換してください。ES細胞を96ウェルプレートに移してEBSを誘導してから7日後に、顕微鏡下でEBの収縮を確認します。各治療時間経過における収縮EBSの割合を算出するため、収縮しているEBSが含まれるウェルを陽性と判定します。96ウェルプレートを用いた実験で特定された心筋形成のシグナリングの時間窓は、吊り下げ滴法で作製したEBS（吊り下げEB滴）を用いて検証することが可能です。まず、後の液滴の変形を防ぐため、ペトリ皿に3〜4 mLのPBSを加えて準備します。次に、最終密度 2.5 × 10⁴ cells/mL で調製した ES 細胞懸濁液を、取り出しやすいようにバクテリアディッシュに移します。マルチチャンネルピペットを使用し、ペトリ皿の裏返した蓋の上に ES 細胞を 20 µL ずつ滴下します。このとき、個々の液滴同士が接触しないようにしてください。一般的に、1枚の蓋に最大80滴まで配置できます。その後、蓋をPBSを含むペトリ皿の上に伏せて、37 °C、5% carbon dioxide インキュベーター内で48時間培養し、EBを形成させます。48時間後、各蓋から吊り下げられた液滴で形成されたEBを、3 mLのEB培地で洗い流します。2つのEBSの蓋を新しいペトリ皿に移します。このペトリ皿を37 °C、5% carbon dioxideインキュベーターで4日間培養します。4日目に、浮遊状態のEBSを一般的に0.2% Gelatinコートされた6ウェルプレートへ移します。各ウェルに30個のEBSを移し、96ウェルプレートの実験で特定された期間にシグナル伝達調節剤を添加して培養します。これはハンギングドロップ法による作製から7日後になります。顕微鏡下でEBを観察し、EBの収縮を確認します。96ウェルプレートのラウンドボトムウェルで培養したES細胞は、4日目に形成されたEBの代表的な画像に示すように、EBを形成します。ES細胞からの心筋分化におけるクリティカルタイムポイントとは、ビークルコントロールと比較して、シグナル調節剤で処理した際に収縮するEBの割合が最も高くなる時間窓のことです。ここでは、96ウェルマイクロタイタープレート上で分化10日目の、ドルサルモルヒネ処理したES細胞から形成された自発的に収縮する心筋細胞のフォーカスを示しています。このビデオを視聴することで、ES細胞の心筋分化における主要なシグナル伝達経路の重要な時間的制御およびウィンドウを効率的に特定する方法について、十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶマウス胚性幹細胞を用いた心原性誘導効率の定量化法。Wnt/β-cateninとBMPシグナル伝達の重要な時間窓を特定し、心筋細胞分化の時間的制御を標準化します。再生医療研究に応用可能です。

心原性誘導効率を定量化するために修飾されたマウス胚性幹細胞ベースのアッセイ

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