心原性誘導効率を定量化するために修飾されたマウス胚性幹細胞ベースのアッセイ

本実験の全体的な目的は、マウス胚性幹細胞の心筋細胞分化に必要な重要な時間的制御を明らかにすることです。まず、96ウェル丸底プレートを用いて胚様体（EB）を形成し、第2ステップとしてEB形成を標準化します。次に、あらかじめ決定したタイムコースに従ってタンパク質または化学的モジュレーターをEBに添加し、検討対象となる経路の時間的制御を行います。

次に、さまざまな信号変調スキームの誘導効率を決定するために、拍動するEBSをの手動で定量します。拍動するEBSの形成率に基づいた心筋細胞分化における必須シグナル伝達経路の時間的要件と、ハンギングドロップ法による確認の結果が得られます。ハンギングドロップ法のような既存の手法と比較した本手法の主な利点は、労力を要する手順を標準化および簡素化し、定量のための直接的な読み取りを可能にすることです。

この手法は、目的の細胞型への分化を誘導する不可欠なシグナル伝達経路の特定など、幹細胞生物学分野における重要な課題の解決に寄与します。本手順を開始するには、白血病抑制因子（LIF）を添加したマウスES細胞培地を用い、10 cmの細胞培養プレートでマウス胚性幹細胞を培養します。ES細胞のコンフルエンスが50〜70%に達した時点で、使用可能な状態となります。

ES培地を除去し、5 mLの滅菌PBSで細胞を1回洗浄します。各プレートに0.05% tripsin EDTAを2 mL加え、37 °Cで3〜5分間インキュベートします。次に、1プレートあたり3 mLのES培地を加えてtrypsin EDTAを失活させ、細胞を50 mL centrifuge tubeに移します。

1000 rpmで3分間遠心分離します。遠心後、上清を除去し、目的量のEB培地で細胞ペレットを再懸濁します。細胞数をカウントし、細胞濃度を5 × 10³ cells/mLに希釈します。

マルチチャンネルピペットを用い、細胞を含むEB培地 100 µLを96穴丸底マイクロタイタープレートの各ウェルに分注します。必要な96穴プレートの枚数は、実験の条件数およびタイムポイントによって異なります。心臓形成における主要なシグナル伝達経路の重要な時間的ウィンドウを特定するため、96穴丸底マイクロタイタープレートを、加湿された37 °C、5% carbon dioxideインキュベーター内に設置します。

特定のシグナル伝達経路のモジュレーターをES細胞に添加します。96ウェル丸底プレートの各ウェルに、培地で希釈したシグナル伝達モジュレーターを、さまざまなタイムポイントで添加します。各96ウェルプレートのウェルの半分を、それぞれの処理開始タイムポイントに使用します。

各タイムポイントにおいて、他の48ウェルにビークルコントロールを追加します。異なる停止時点で、培地を交換することにより各ウェルからシグナル伝達調節剤をウォッシュアウトしますが、この操作を行う際は、胚体（EB）を乱さないよう細心の注意を払う必要があります。各停止タイムポイントにおいて、EB培地を交換して調節剤をウォッシュアウトします。96ウェルプレートを約10度の角度に傾け、マルチチャンネルピペットを用いてウェルから緩やかに培地を取り除きます。

48時間を超える処理を行う場合は、各ウェルにモジュレーターを含まないEB培地を補充します。目的の停止時間に達するまで、新鮮なモジュレーターを添加したEB培地を2日ごとに交換してください。ES細胞を96ウェルプレートに移してEB分化を誘導してから7日後に、顕微鏡下でEBの凝縮状態を確認します。

各処理時間の経過に伴う収縮EBSの割合を算出するため、収縮しているEBSがあるウェルを陽性と判定します。96ウェルプレートを用いた実験で特定された心臓形成のシグナル伝達タイムウィンドウは、吊り下げ滴法で作製したEBS（吊り下げEB滴）を用いて検証することが可能です。まず、後の工程で液滴の変形を防ぐために、ペトリ皿に3〜4 mLのPBSを加えて準備します。

次に、最終密度を2.5 × 10⁴ cells/mLに調製したES細胞懸濁液を、取り出しやすいようにバクテリア皿に分注します。マルチチャンネルピペットを使用して、ペトリ皿の裏返した蓋の上にES細胞を20 µLずつ滴下します。このとき、個々の液滴同士が接触しないようにしてください。

一般的に、1つの蓋に最大80滴まで配置できます。次に、PBSを含むペトリ皿の上に蓋を戻し、37 °C、5% carbon dioxide インキュベーター内で48時間インキュベートし、EBを形成させます。48時間後、各蓋から吊り下げられた液滴で形成されたEBを、3 mLのEB培地で洗い流します。

2つのEBSの蓋を新しいペトリ皿に移します。このペトリ皿を37 °C、5% 二酸化炭素インキュベーターで4日間培養します。4日目に、浮遊状態のEBSを0.2%ゼラチンコートした6ウェルプレートに転移させます。各ウェルに30個のEBSを転移し、96ウェルプレートの実験で特定された期間にわたってシグナル伝達調節剤を添加して培養します。これはハンギングドロップ法による作製から7日後の時点となります。

顕微鏡下でEBSを観察し、EBの収縮を確認します。96ウェルプレートのラウンドボトムウェルで培養したES細胞は、この4日目に形成されたEBの代表的な画像に示すように、EBSを形成します。ES細胞からの心筋分化におけるクリティカルタイムポイントとは、ビヒクルコントロールと比較して、シグナル調節剤で処理した際に収縮するEBSの割合が最も高くなる時間窓のことです。ここでは、96ウェルマイクロタイタープレート上で分化10日目に、背側モルヒネで処理したES細胞から形成された、自発的に収縮する心筋細胞のフォーカスを示しています。

このビデオを視聴することで、ES細胞による心臓形成における重要なシグナリング経路の決定的な時間的制御およびウィンドウを効率的に特定する方法について、深く理解することができます。