心原性誘導効率を定量化するために修飾されたマウス胚性幹細胞ベースのアッセイ

次の実験の全体的な目標は、マウス胚性幹細胞の心筋細胞の分化に必要な重要な時間的調節を特定することです。これは、まず96ウェルの丸い底板に胚体を形成し、第2のステップとしてEB形成を標準化することによって達成されます。タンパク質または化学モジュレーターは、所定の時間経過でEBSに追加され、検査中の経路の時間的制御が可能になります。

次に、ビートEBSを手動で定量化して、さまざまな信号変調方式の誘導効率を決定します。心筋細胞の分化に不可欠なシグナル伝達経路の時間的要件を示す結果が得られ、形成される拍動EBSの割合とハンギングドロップ法による確認に基づいています。吊り下げ式ドロップのような既存の方法に対するこの手法の主な利点は、労働集約的な手順を標準化および簡素化し、定量化のための簡単な読み出しを可能にすることです。

この方法は、幹細胞生物学分野における重要な疑問に答えるのに役立つ、例えば、分化を所望の細胞型に向ける本質的なシグナル伝達凝固を特定するためにこの手順を開始する。白血病抑制因子を添加したマウスES細胞培地を用いた10cm細胞培養プレート中のGroマウス胚性幹細胞。ES細胞が50〜70%のコンフルエンスにあると、使用準備が整います。

ES培地を取り出し、5ミリリットルの滅菌PBSで細胞を一度すすぎます。各プレートに2ミリリットルの0.05%tripsin EDTAを加え、プレートを摂氏37度で3〜5分間インキュベートします。次に、プレートあたり3ミリリットルのES培地でEDTAでトリップをクエンチし、細胞を50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。

毎分1000回転で3分間回転します。遠心分離後、サピネートを取り出し、細胞ペレットを所望量のEB培地で再懸濁します。細胞数を数え、次に細胞を1ミリリットルあたり3個の細胞の10の5倍に希釈します。

マルチチャンネルピペットを使用したEB培地で、細胞を含むEB培地100マイクロリットルを96丸底ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えます。必要な96ウェルプレートの数は、実験の条件と時点の数によって異なります。96個の丸底ウェルマイクロタイタープレートを加湿した摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターに入れて、心臓の起源の主要なシグナル伝達経路の重要な時間枠を特定します。

特定のシグナル伝達経路のモジュレーターがES細胞に追加されます。96個の丸底ウェルプレートに、さまざまな時点で培地で希釈されたシグナル伝達モジュレーターを各ウェルに加えます。各96ウェルプレートのウェルの半分は、処理の各開始時点に使用されます。

車両制御は、各時点の他の48の井戸に追加されます 異なる停止ポイントでは、メディアを変更することにより、各ウェルから信号変調器を洗い流すつもりであり、これを行う際には、異なる停止時点で胚体を混乱させないように細心の注意を払う必要があります。ウェルのEBメディアを交換して、モジュレーターを洗い流します。96ウェルプレートを約10度の角度で傾け、マルチチャンネルピペットで培地をウェルから静かに取り出します。

その後、モジュレーターなしのEB培地を各ウェルに再度追加し、48時間を超える処理を行います。新しいモジュレーターを添加したEBメディアを、希望の停止時間まで2日ごとに交換してください。ES細胞を96ウェルプレートに移すことによりEBSを誘導した7日後のポイントでは、顕微鏡下でEBの収縮を調べています。

EBSに感染している井戸を陽性の井戸として採点し、異なる治療時間経過ごとにEBSに感染している井戸の割合を取得します。96ウェルプレートの実験によって特定された心臓起源のシグナル伝達の時間枠は、ぶら下がっているEBSから作製してぶら下がっているEBS液滴を作ることができます。まず、後で液滴の収差を防ぐために3〜4ミリリットルのPBSを追加してペトリ皿を準備します。

次に、1ミリリットルあたり4細胞の10倍の最終密度の2.5倍で調製されたES細胞懸濁液を、簡単にアクセスできるように細菌皿に注ぎます。マルチチャンネルピペットを使用して、20マイクロリットルのES細胞をペトリ皿の逆さまの蓋に加えます。個々の液滴が互いに触れないようにしてください。

一般的に、1つの蓋に最大80滴を収めることができます。次に、PBSを含むシャーレに蓋を戻し、摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターで48時間インキュベートしてEB形成を可能にします。48時間後、各蓋からぶら下がっている液滴から形成されたEBSを3ミリリットルのEBメディアで洗い流します。

EBSの2つの蓋を新しいシャーレに引き込みます。4日目に37°Cの5%二酸化炭素インキュベーターでペトリ皿を4日間インキュベートし、懸濁液中のEBSを0.2%ゼラチンでコーティングされた6つのウェルプレートに一般的に移します。30 EBSは、吊り下げ液滴が作製されてから7日後の96ウェルプレート実験から特定された期間に、各ウェルインキュベートシグナル伝達モジュレーターに移されます。

顕微鏡でEBSを観察し、96ウェルプレートの丸底ウェルで増殖したEB収縮ES細胞は、この4日目に形成されたEBの代表的な画像に示すようにEBSを形成します。ESカーディオジェネシスの重要な時点は、ビヒクル制御と比較して、シグナル伝達モジュレーターによって処理される収縮EBSの割合が最も高い時間枠です。ここに示されているのは、96ウェルマイクロタイタープレート上の分化10日目に背側モルヒネ処理ES細胞から形成された心筋細胞の自発的に収縮する焦点です。

このビデオを見れば、ESカーディオジェネシスにおける重要な時間的調節、つまり主要なシグナル伝達経路のウィンドウを効率的に特定する方法を十分に理解できるはずです。