フローサイトメトリーによる肺および肺リンパ節の分析とマウスの非外科的気管内注入
May 2nd, 2011
我々は気管を経由して麻酔したマウスの肺に試験物質の非外科的配信を示しています。このメソッドは、肺の細菌やウイルス性病原体への曝露、サイトカイン、抗体、ビーズ、化学物質、または染料を許可します。我々は、さらにフローサイトメトリーのために肺および肺リンパ節（LDLNs）の収穫と処理を説明します。
この手順の全体的な目的は、強制針を使用してマウスの肺に非外科的に材料を試験し、その後、肺と肺ドレナージリンパ節を分析することです。これは、最初に照明用喉頭鏡と曲げた強制針を麻酔マウスの気管に挿入することによって達成されます。次に、試験材料を喉頭鏡と強制針を介して動物の肺に注入します。
次に、肺とドレナージリンパ節を摘出します。最後に、肺とリンパ節は単一細胞懸濁液に処理されます。最終的に、この方法は、試験材料と肺免疫細胞との関連、および肺ドレーンリンパ節への細胞の輸送のフローサイトメトリー分析を容易にします。
鼻腔内曝露やエアロゾル曝露などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、鼻に関連するリンパ組織をバイパスして、試験材料を肺に直接送達できることです。また、気管設置の外科用ラットに比べて簡単に行うことができます。この手順を実演するのは、Richieの研究室のポスドクであるElizabeth Entiと、レンズ研究室の大学院生であるManjiです。
マウスに麻酔をかけた後、50マイクロリットルの生理食塩水で接種物を調製します。滅菌曲げられた強制針を取り付けた1ミリリットルの注射器に接種物を入れます。.接種材料の後ろに100マイクロリットルのエアポケットをシリンジにセットして、すべての液体が肺に確実に設置
されるようにします。マウスをワイヤー上の切歯でぶら下げた角度のついた木製のプラットフォームに置き、リボンで所定の位置にそっと固定します。次に、片手で喉頭鏡をオンにし、もう一方の手で鈍い手入れの行き届いた鉗子をつかみます。喉頭鏡の先端と鉗子を使用して、鉗子で口をそっとこじ開けます。
舌を引き出して横に持ちます。喉頭鏡の刃を口の奥に導きます。気管の開口部が見えるまで、喉頭鏡を90度の角度で非常に穏やかに押し下げたままにします。
片手で喉頭鏡を所定の位置に保持しながら、もう一方の手で接種物を含む曲げられた強制針が取り付けられた1ミリリットルの注射器を取ります。針の曲がりが前切歯のそばになるまで、針を気管に挿入します。プランジャーを均等に押して、泡立たずに接種物を供給します。
できるだけ早く針を気管から引き抜きます。マウスを数秒間直立させて、接種物が肺に吸い込まれるようにします。マウスを暖房ランプの近くに置き、ウェイクアップさせます。
安楽死させた後、マウスの腕と脚を解剖ボードに固定します。はさみで腹側の中央に沿って切開を行います。皮膚をそっと引っ張り、腹膜を露出させます。
腹膜を切開して腹部の臓器を露出させます。鉗子で胸骨の先端を持ち、ハサミで横隔膜に穴を開けます。はさみを解剖板の表面と平行にして、胸郭の側面に沿ってダイヤフラムを切断します。
両側の背腹線に沿って胸腔をわずかに切り込みます。心臓の右側にある胸郭を持ち上げます。胸腺のすぐ下で、2つのリンパ節を探します。
3番目のわずかに大きいリンパ節は、気管に垂直に走る小さな動脈血管の下にあります。リンパ節を1ミリリットルのリンパ節消化に採取し、混合して氷の上に置きます。リンパ節を採取した後、肺を採取して6ウェルプレートにします。
6ウェルプレートを氷上に置いたまま、PBSを吸引し、鉗子とハサミを使用してローブを細かく刻みます。26ゲージの針で各リンパ節を押さえ、2番目の26ゲージの針でリンパ節をからかいます。すべての細胞の放出を確実にするために、肺には3ミリリットルの消化混合物を、リンパ節には1ミリリットルを追加します。
リンパ節を25〜30分間、肺を摂氏37度で30分間インキュベートした後、各消化混合物にEDTAを最終濃度10ミリモルまで追加して反応を停止し、氷上に置きます。3ミリリットルの注射器を使用して、肺の断片を18ゲージの針に通します。肺とリンパ節の断片を70〜100ミクロンの細胞ストレーナーで3回つぶします。
1ミリリットルのシリンジプランジャーの後端を使用して、カルシウムとマグネシウムの遠心分離機を使用せずに10ミリリットルのHBSSで細胞ストレーナーを洗浄します。細胞は、摂氏4度で重力の500倍で5分間サンプリングします。リースは、ペレットを5ミリリットルの赤血球溶解液で曲げ、緩衝液にし、3分間インキュベートします。
室温で、カルシウムとマグネシウムを含まないHBSSを10ミリリットル加えて溶解を急冷し、サンプルを重力の500倍で5分間遠心分離します。肺と肺のドレナージリンパ節、単一細胞懸濁液をそれぞれ10ミリリットルと5ミリリットルに育てます。ヘモサイトメーターでトライアムブルーエクスクルージョンを使用して細胞をカウントします。
この2つの図では、AJマウスに1回から10回から8番目のバシラスラシス胞子を投与し、感染後30分で肺をフローサイトメトリーで解析しました。これらのドットプロットは、ゲーティング戦略を示しています。これらのパネルは、炭疽菌の胞子に対して陽性であるCD 45陽性のCD 11 C陽性肺細胞の割合を示しています。
この図では、AJマウスを気管内注射し、その後、肺ドレーンリンパ節を分析しました。代表的なドットプロットは、肺ドレーンリンパ節のCD 11 C高細胞のうち、空のチャネルに対してプロットされた蛍光ビーズを抱く割合を示しています。左のパネルはPBSを注射したマウスの結果を示し、右のパネルは10マイクログラムのLPSを含む明るい黄緑色の微小球である9つの植物相を5倍注射したマウスの結果を示しています。
この方法は、肺で具体的にどのようなイベントが開始されるのか、吸入された抗原が肺からドレインリンパ節にどのように輸送されるのかなど、現場での重要な質問に答えるのに役立ちます。
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概要
この記事では、麻酔状態のマウスの気管を通じて肺に試験材料を投与する非外科的方法を説明しています。この技術により、様々な物質への曝露が可能となり、その後の肺免疫細胞の分析が容易になります。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 免疫学
- 呼吸器生物学
背景
- 肺の免疫反応を理解することは治療法の開発に不可欠です。
- 従来の方法では侵襲的な手順が含まれる場合があります。
- この技術により、より安全で効率的な試験が可能になります。
- フローサイトメトリーは免疫細胞の相互作用を分析するための重要なツールです。
研究の目的
- 試験材料に対する肺の曝露のための非外科的方法を開発すること。
- 試験材料と肺免疫細胞との関連性を分析すること。
- 肺ドレインリンパ節への免疫細胞の移動を研究すること。
使用された方法
- 気管への発光喉頭鏡と湾曲注射針の挿入。
- 喉頭鏡を通じて肺への試験材料の注入。
- 肺とドレインリンパ節の摘出。
- 組織を単一細胞懸濁液に加工して分析用に準備。
主な結果
- 様々な試験材料の肺への成功した投与。
- 肺免疫細胞のフローサイトメトリ分析の促進。
- リンパ節への免疫細胞の移動に関する洞察。
- 肺研究のための非侵襲的アプローチの実証。
結論
- この方法は肺研究のための貴重なツールを提供します。
- 肺における免疫反応の理解を深めます。
- このアプローチは、より良い治療戦略につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This non-surgical intratracheal instillation method enables precise delivery of test materials directly to the lungs, bypassing upper respiratory tract confounders. It supports mechanistic de-risking in immunology and respiratory drug discovery by enabling quantitative analysis of antigen trafficking and immune cell engagement. The approach enhances predictive confidence in target validation and preclinical model relevance for inhaled therapeutics and vaccines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating lung-specific immune responses from nasal-associated lymphoid tissue interference.
- Operational Value: Provides reproducible delivery of antigens or compounds to lungs for consistent target engagement assessment.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets involved in antigen presentation and T-cell activation pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable flow cytometry readouts of test material association with lung immune cells and trafficking to draining lymph nodes.
- Operational Value: Standardizes tissue processing into single-cell suspensions for high-throughput immunophenotyping.
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening of immunomodulators or vaccine candidates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models human lung antigen exposure and immune cell migration to lymph nodes for preclinical efficacy testing.
- Mechanistic De-risking: Clarifies causal relationships between lung exposure and immune activation, reducing ambiguity in target mechanism.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on quantitative immune trafficking data from lungs to lymph nodes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical immunology studies, particularly for inhaled biologics and small molecules.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of lung-specific immune initiation and pathway clarification of antigen-presenting cell activation.
- Screening: Enables assay standardization and reproducible quantitative outputs for comparing test material immunogenicity.
- Analytics: Delivers flow cytometry-based measurements of cell-associated antigen and trafficking kinetics to inform comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects lung immune events to preclinical validation via lymph node trafficking, supporting biomarker-aligned advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable lung exposure platform across immunology, infectious disease, and respiratory therapy programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in lung immune responses.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of lung exposure and immune analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in immunology pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on lung-specific immune trafficking and target engagement data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse anesthesia, surgical preparation, and tissue dissection for consistent tracheal access.
- Dependent on laryngoscopy equipment, bent gavage needles, and sterile inoculation supplies for reliable delivery.
- Necessitates standardized tissue digestion and flow cytometry protocols across teams for reproducible immune profiling.
- Adaptation considerations include varying inoculum volumes and digestion times across mouse strains or disease models.
- Practical limitations include technical skill dependency for tracheal visualization and potential variability in inoculum distribution.
