フローサイトメトリーによる肺および肺リンパ節の分析とマウスの非外科的気管内注入

この手順の目的は、ガバージュ針を用いてマウスの肺に試験物質を非外科的に注入し、その後、肺および肺ドレナージリンパ節を解析することです。まず、麻酔下にあるマウスの気管に照明付き喉頭鏡と曲げたガバージュ針を挿入します。次に、喉頭鏡とガバージュ針を介して、動物の肺に試験物質を注入します。

次に、肺と所属リンパ節を摘出します。最後に、肺とリンパ節を単一細胞懸濁液に調製します。最終的に、本手法により、試験物質と肺免疫細胞との関連、および肺所属リンパ節への細胞の移行について、フローサイトメトリーによる解析が可能となります。

本手法の、経鼻投与やエアロゾル曝露などの既存手法に対する主な利点は、鼻腔関連リンパ組織を回避して、肺に試験物質を直接的に届けることができる点にあります。さらに、気管内投与のための外科的処置を伴うラットへの投与と比較して、簡便に実施可能です。本手順のデモンストレーションは、Richie研究室のポストドクターであるElizabeth Enti氏と、lens研究室の大学院生であるManji氏が行います。

マウスを麻酔した後、生理食塩水 50 µL で接種液を調製します。滅菌済みの曲がり胃管針を装着した 1 mL シリンジに接種液を満たします。すべての液体が肺内に注入されるように、接種液の後方に 100 µL のエアポケットをシリンジに入れておきます。

マウスを斜めの木製プラットフォームに乗せ、ワイヤーに門歯を掛けた状態でリボンを用いて緩やかに固定します。次に、片手で喉頭鏡の電源を入れ、もう一方の手で鈍端鑷子（ずんたんせっし）を把持します。喉頭鏡の先端と鑷子を用いて、口をゆっくりと開かせます。

舌を引き出し、側方に保持します。喉頭鏡のブレードを口の奥へと導きます。気管の開口部が見えるまで、喉頭鏡を90度の角度で非常に緩やかに押し下げたままにします。

片手で喉頭鏡を固定したまま、もう一方の手で接種液を入れた曲がりガバージュ針付きの1 mLシリンジを持ちます。針の曲がり部分が前切歯のあたりに来るまで、針を気管内に挿入します。気泡が入らないように、プランジャーを均等に押し下げて接種液を注入します。

速やかに針を気管から抜きます。マウスを数秒間直立させ、接種液が肺に吸入されるようにします。マウスを ısı温ランプの近くに置き、覚醒するまで待ちます。

安楽死させた後、マウスの四肢を解剖板にピンで固定します。はさみを用いて、腹側の中央に沿って切開します。皮膚を慎重に剥がし、腹膜を露出させます。

腹膜を切開し、腹部臓器を露出させます。ピンセットで胸骨の先端を保持し、ハサミで横隔膜を穿刺します。解剖台の表面と平行にハサミを使い、肋骨の側面に沿って横隔膜を切断します。

胸腔の背腹線に沿って両側をわずかに切開します。心臓の右側の肋骨を上に持ち上げます。胸腺の直下にある2つのリンパ節を探します。

3つ目のわずかに大きなリンパ節は、気管に垂直に走る小さな動脈の直下に位置しています。リンパ節を1 mLのリンパ節消化液に回収し、混合して氷上に置きます。リンパ節の回収後、肺を6ウェルプレートに回収します。

6ウェルプレートを氷上に置いたままPBSを吸引し、ピンセットとハサミを用いて葉を細かく切断します。各リンパ節を26ゲージの針で固定し、別の26ゲージの針を用いてほぐします。すべての細胞を確実に遊離させるため、肺には3 mLの消化液を、リンパ節には1 mLの消化液を加えます。

リンパ節を25～30分間、肺を30分間、37 °Cでインキュベートした後、各消化混合液に最終濃度10 millimolarとなるようにEDTAを加え、反応を停止させて氷上に置きます。3 mLシリンジを用い、肺の組織片を18ゲージの針に通します。肺の組織片とリンパ節を、70～100 micronのセルストレーナーで3回すり潰します。

1 mLシリンジプランジャーの背面を用いて、カルシウムおよびマグネシウム不含のHBSS 10 mLでセルストレーナーを洗浄します。細胞サンプルを4°C、500 ×gで5分間遠心分離します。ペレットを5 mLの赤血球溶血緩衝液で再懸濁し、3分間インキュベートします。

室温で、溶解を停止させるためにカルシウムおよびマグネシウム不含のHBSSを10 mL添加し、サンプルを500 ×gで5分間遠心分離します。肺および肺漏出リンパ節の単一細胞懸濁液の液量を、それぞれ10 mLおよび5 mLに調整します。トリパンブルー排除法と血球計数器を用いて細胞数を計測します。

これら2つの図では、AJマウスに1×10⁸個のBacillus anthracis胞子を接種し、感染30分後に肺をフローサイトメトリーで分析しました。これらのドットプロットはゲーティング戦略を示しています。これらのパネルは、Bacillus anthracis胞子陽性であるCD45陽性CD11c陽性肺細胞の割合を示しています。

この図では、AJマウスに気管内投与を行い、その後、肺ドレナージリンパ節を解析しています。代表的なドットプロットは、蛍光ビーズを保有する肺ドレナージリンパ節内のCD 11 C high細胞の割合を、空チャネルに対してプロットしたものです。左側のパネルはPBSを投与したマウスの結果を示し、右側のパネルは10 µgのLPSを含む5×10⁹個の蛍光黄色緑色マイクロスフィアを投与したマウスの結果を示しています。

この手法は、肺で具体的にどのようなイベントが開始されるのか、また、吸入された抗原が肺から排泄リンパ節へとどのように輸送されるかなど、この分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。