磁気共鳴イメージングのための準備、精製、および造影剤として使用するための希土類錯体のキャラクタリゼーション

この手順の全体的な目標は、生体高分子のタグ付けに使用できるランタニド含有錯体を合成、精製、および特性評価することです。これは、まず溶液のpHを制御しながら、金属出発物質と配位子を混合することによって達成されます。手順の2番目のステップは、透析を使用して得られた複合体を精製することです。

次に、遊離金属が存在しないことを確認する必要があります。手順の最後のステップは、イメージングに関連する複合体の特性評価です。最終的には、合成された複合体がリラックス活性測定を通じて造影剤として振る舞うことを示す結果を得ることができます。

この方法は、造影剤がタンパク質に結合すると水配位数が変化するかどうかなど、イメージング分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。一般的に、個人は、慎重にpHを制御するネットは、LIをレンダリングし、バイオ教育のために役に立たなくなるため、この方法が苦労する必要があります。透析と活動測定のデモンストレーションは、ブダとサシです。

私の研究室の大学院生:ランタニド塩を使用したメタシエーションを開始するには、まず1つの当量のリガンドを水に溶かして、30〜265ミリモルの溶液を生成します。ここでは、配位子パライソベンジルDTPAが73ミリモルの濃度で使用されています。次に、水酸化アンモニウムを1モル追加して、リガンド溶液のpHを5.5〜7に調整します。

このビデオでは、0.2ミリリットルの1モルの水酸化アンモニウム溶液を使用して、1〜2相当の塩化ランタノイドを水に溶解して、5〜1000ミリモルの濃度の溶液を生成します。ユーロ塩化ビウムまたは塩化ガドリニウムのいずれかを111ミリモルの濃度で使用できます。多くの場合、過剰な金属を使用して換気を完了し、その結果、精製が簡素化されます。

次に、攪拌しながら調製した配位子の溶液にレイタン塩の各溶液を加えます。次に、0.2モルの水酸化アンモニウムを添加して、得られた反応混合物のpHを5.5〜7に調整します。ここでは、合計0.5ミリリットルの0.2モルの水酸化アンモニウム溶液を使用して溶液を調整します。

使用するリガンドに酸感受性官能基が含まれている場合は、このステップでpHを複数回調整します。pHを調整する際には、溶液が塩基性になりすぎると、イソチオシアネートなどの塩基感受性官能基が使用できなくなるため、注意してください。コンジュゲーションについては、pH測定により反応を綿密にモニタリングします。

pHが一定のままであれば反応は完了します 塩基感受性官能基を持たないリガンドの場合、pHを上げることを含む精密検査も有用です。透析精密検査を開始するには、サンプル量を保持するための適切な長さと、サンプル量の10%を追加で保持するための追加の長さを決定します。次に、メーカーのガイドラインに従って、チューブをこの長さに切断します。

本動画では100〜500ダルトンの分子量カットオフメンブレンを使用しましたが、メテーション前にコンジュゲーションを行う場合は、必要に応じてより大きな分子量カットオフチューブを使用することができます。必要に応じて、メーカーのガイドラインに基づき、カット透析チューブを浸し、常温で15分間水に浸してください。次に、透析液として機能する透析リザーバーに水を入れます。ここでは1リットルのビーカーが使用されています。

透析液の量は、サンプルの約100倍にする必要があります。次に、チューブの一方の端を2回折り、折りたたまれた部分を透析クロージャークランプで固定します。クロージャーの端を輪ゴムで包み、透析中に閉じたままになるようにします。

以前に調製した反応混合物を0.2ミクロンのフィルターでろ過します。次に、濾液をチューブの開放端にロードします。チューブが破れないように注意してください。

チューブを閉じるのに十分なヘッドスペースを確保してください。チューブの残りの開放端を2回折り、クロージャーで固定し、クロージャーを輪ゴムで包みます。次に、空気の入ったガラスバイアルを透析チューブの一方の端にあるクランプに別の輪ゴムで取り付けます。

次に、砂の入ったバイアルをもう一方のクランプに取り付けます。これらのバイアルは、チューブが透析液に浸されたままであることを保証します。次に、透析液を含む透析リザーバーにフルチューブを配置します。

透析液をマグネティックスタープレートを用いて常温低速で攪拌します。攪拌速度が遅く、溶液が遅くないことを確認してください。渦動。1日の間に3回、ダイヤラートを変えます。

このビデオでは、2.5時間、6.5時間、11.5時間でダイヤルが変更されています。透析を合計20〜28時間一晩続けさせます。透析が完了したら、ダイアレンジからチューブを取り外し、1つのクロージャーを慎重に開いてサンプルを取り出します。

透析チューブを水で3回洗浄し、洗浄液をサンプルと組み合わせます。最後に、ここで減圧下でサンプルから水を取り除きます。これは凍結乾燥によって達成されます。

サンプルを凍結し、凍結乾燥装置に置きます。サンプル中の遊離金属の存在を評価するには、まず1.4ミリリットルの酢酸を400ミリリットルの水に溶解して酢酸緩衝液を調製し、1モルの水酸化アンモニウムでpHを5.8に調整し、水を加えて総体積500ミリリットルを生成します。次に、各複合体の0.3ミリグラムを0.3ミリリットルの緩衝液に溶解します。

次に、pH 5.8バッファー中に16マイクロモルであるはずのxolオレンジインジケーターを準備します。この指示薬溶液の3ミリリットルを、以前に溶解した金属錯体に加えます。黄色から紫へのインジケータの色の変化を観察することにより、遊離金属の存在を検出します。

必要に応じて、検量線を作成することにより、遊離金属の量を定量化できます。遊離金属が残っている場合は、特性評価の前に、透析または高速液体クロマトグラフィーを使用してサンプルをさらに精製する必要があります。次に、アヘンサンプルの水配位数を決定するために、水中のアヘン含有錯体の約1ミリモルの溶液を準備し、次に酸化重水素に同じ濃度の別の溶液を準備します。

分析に先立って、酸化重水素の解決は残りの水を取り除き、分光蛍光計のスイッチを入れ、きれいなveteに水解決を加え、分光蛍光計にveteを置くためにdelightroの酸化物の解決を3回蒸発させ、溶解しなければならない。次に、励起と放出を実行して、それぞれ約395ナノメートル、595ナノメートルでそれぞれの最大値を決定します。次に、先ほど決定した励起波長と発光波長、およびここに表示されているパラメータを使用して、燐光時間減衰実験を行います。

プロットを取得したばかりの発光崩壊データから調製した酸化重水素溶液で、強度対時間の自然対数でこのステップを繰り返します。これらの線の傾きは減衰率です。このビデオでは、Microsoft Excel 2007を使用して、生データから自然対数プロットを生成しました。

ここで見られるhorsと同僚によって開発された方程式の減衰率を使用します。配位子に金属に配位したOH基またはNH基が含まれている場合は、使用前に方程式を修正する必要があります。まず、サンプルの相対性理論の測定値を決定するには、緩和時間アナライザーで目的のアプリケーションモード(T 1またはT 2)を選択します。

ここでは、Tワン設定が選択されています。次に、黙認溶媒中に異なる濃度のランタニド含有錯体を含む一連のサンプルを調製します。ここでは、10、5、2、0.5、1.25、0.625、およびゼロの溶媒と溶液として水が使用されます。

ミリモラーをご用意しております。他の未認溶媒または緩衝液を使用することもできますが、ブランクとして溶媒を使用することが重要です。サンプルの最終的な容量は、使用されている機器によって異なります。

サンプルを装置に入れ、5分間放置して、装置の温度(このビデオで使用されているユニットの摂氏37度)に平衡化させます。次に、ソフトウェアのパラメータを調整して緩和時間を秒単位で決定し、T 1またはT 2の滑らかな指数曲線を取得します。ブランクを含むすべてのサンプルに対してこれを繰り返します。

次に、測定されたT 1またはT 2の緩和値の逆数を計算してプロットします。これらの値とレイサン濃度およびミリモルの単位に対する値は、プロットを直線で一致させます。適合線の傾きは、リラックス活動が R 1 または T 1 と T 2 に対してそれぞれ R 2 であることです。

ここでは、仲介と浄化の一般的なスキームを見ていきます。このスキームは、メテーションの一般的な手順と、異なる精製ルートを選択する理由を示しています。ここでは、代表的な発光減衰プロットを示しており、自然崩壊の対数がプロットされ、時間に対して、水と酸化重水素溶液に必要な同様の曲線から生成された線の傾きが式1で使用され、アヘン含有錯体の水配位数が決定されます。

ここでは、リビティ測定の代表的な例で、適合線の傾きがサンプルのTワンリビリティとなっています。プロトコルに記載されている水配位数とリビシティの特性評価に加えて、標準的な化学技術を使用して最終製品を特性評価することも重要です。化合物の同一性は、ガドリニウムおよびアヘン含有錯体の診断同位体パターンを示す質量分析の代表質量スペクトルを用いて取得することができる。

この手順に続いて、endr分光法、HPLC、元素分析などの他の方法を実行して、得られた複合体をさらに特徴付けることができます。このビデオを見れば、生体高分子のタグ付けに使用できるランタニド含有錯体を合成、精製、および特性評価する方法を十分に理解できるはずです。