Name: 磁気共鳴イメージングのための準備、精製、および造影剤として使用するための希土類錯体のキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: 学ぶ ランタノイド錯体の合成・精製・特性評価法。ダイアリシスによる精製と緩和活性測定を用いて、MRI造影剤としての性質を評価し、生体高分子標識への応用を支援する。

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我々は感謝してウェイン州立大学（MJA）、研究（SMV）のエージングのためのアメリカ財団、国立研究所の生体イメージングとバイオの国立研究所から独立キャリアトランジション賞（R00EB007129）への経路からの助成金からのスタートアップ資金を認めるの健康（MJA）。

1。 LnCl 3塩を使用してメタル化<ol><li> 30から265 mMの溶液を生成する水の配位子を溶かす。配位子2 - （4 - isothiocyanatobenzyl） -ジエチレントリアミン五酢酸（P - SCN - BN - DTPA）は73 mMの濃度で、このビデオで使用されていました。 </li><li> 1 M NH 4 OHを添加することにより5.5と7.0の間に配位子の溶液のpHを調整します。このビデオでは、1 M NH 4 OH液0.2 mLを使用した。 </li><li> 5000〜1000 mMの濃度の溶液を生成するために水でLnCl 3の1〜2当量を溶解する。このビデオでは、EuCl 3、GdCl 3は 111 mMの濃度で使用された。金属の過剰は、多くの場合、完了するまでメタル化を促進し、その結果、精製を簡素化するために使用されます。 </li><li>攪拌しながら、配位子の解決にLnCl 3の溶液を加える。 </li><li> LnCl 3を添加した後、0.2 M NH 4 OHを添加することにより5.5と7.0の間に得 ​​られた反応混合物のpHを調整する。 0.2 M NH 4 OH溶液0.5 mLの合計は、このビデオで使用されていました。あなたのリガンドは、酸に敏感な官能基が含まれている場合、このステップの中のpHを複数回調整する。注意 - 解決策があまりにも基本的になれば、どのベースに敏感な官能基は、イソチオシアネートと同様に、結合体化のため使用できなくなります。 </li><li> pH測定を経由して反応を監視する。 pHが一定のままである時に反応は完了です。 </li></ol> 2。 （このビデオに含まれているが、ベースに敏感な官能基のない配位子のためによくない）pHの精密検査を上げる<ol><li> ≥11にpHを調整するために反応混合物に濃NH 4 OHを追加。このステップでは、不溶性の水酸化物として任意の非錯化金属を沈殿する。 </li><li> 0.2μmのフィルターに通して上清をフィルターします。反応混合物は、フィルタをひいた場合、遠心分離の前のフィルタリングにデカントすることをお勧めします。 </li><li>透析が実行されない場合は、減圧（回転蒸発または凍結乾燥をお勧めします）の下に溶媒を除去。 </li><li>無料のランタニドが残っている場合は、手順2.1から2.3までを繰り返すことができます。 </li></ol> 3。透析精密検査<ol><li>余分な長さ（サンプルの体積の約10％）を残したまま、サンプルボリュームを保持するために（製造業者のガイドラインに従って）適切な長さに透析チューブをカット。このビデオでは、100から500ダルトンの分子量カットオフ（MWCO）膜が使用されていましたが、共役をメタル化する前に実行される場合は、大きいMWCOチューブを適宜用いることができる。また、透析カセットは、必要に応じて透析チューブの代替として使用することができます。 </li><li>メーカーのガイドラインに基づいて、適切な場合、周囲温度で15分間水にカット透析チューブを浸す。 </li><li>水（透析液）で透析リザーバーを（1 Lのビーカーがこのビデオで使用された）入力してください。透析液の量は約100倍のサンプルのことでなければなりません。 </li><li>倍管の一方の端を折ると透析の閉鎖クランプで管の折り返し部分を固定します。それは透析中に閉じたままであることを保証するために輪ゴムで閉鎖の端を巻きます。 </li><li> 0.2μmのフィルターを通して反応混合物をフィルタリングし、チューブを引き裂くように注意しながらチューブの開放端にろ液をロードする。チューブを閉じるには、十分なヘッドスペースを残してください。 </li><li>二度、閉鎖と確保、および手順3.4のようにゴムバンドで閉鎖をラップチューブの残りの開放端を折る。 </li><li>ゴムバンドを使用して透析チューブの一端をクランプするために空気を含有するガラスバイアルを取り付けます。他のクランプへの砂の入ったバイアルを取り付けます。これらのバイアルは、チューブが透析液に浸漬に留まることを保証します。 </li><li>透析液を含む透析リザーバーのフルチューブを置きます。 </li><li>周囲温度で低速（無ボルテックス）で磁気攪拌プレートを用いて透析液をかき混ぜる。 </li><li>一日の経過（このビデオでは、透析液を2.5、6.5、11.5時間で変更された）の3倍透析を変更してから、（透析の20〜28時間の合計）透析は一晩を継続することができます。 </li><li>透析液から透析チューブを取り外し、慎重にサンプルを削除する1つの閉鎖を開きます。水で3倍の透析チューブを洗浄し、サンプルと洗浄液を組み合わせる。 </li><li>減圧下で水を取り外します。凍結乾燥は、このビデオで使用されています。 </li></ol> 4。フリー金属の存在の評価<ol><li>酢酸緩衝液中で金属錯体を溶解（バッファの準備を：400 mLの水に酢酸1.4 mLを溶かし、1 M NH 4 OHで5.8にpHを調整し、500mLの総容積を生成するために水を加える）し、キシレノールを追加するオレンジ色のインジケータ（pH 5.8の緩衝液で16μM）。このビデオでは、複雑な0.3 mgをバッファ0.3 mLに溶解し、指示薬溶液の3mLを追加しました。 </li><li>紫に黄色からインジケータの色の変化の観察を経由してフリー金属の存在を検出する。 </li><li>必要に応じて、自由な金属の量は、検量線1を作成することによって定量することができる。また、染料アルセナゾIIIは、キシレノールオレンジ2の代わりに使用することができます。遊離金属が残っている場合、サンプルは、さらに前に特性評価するために透析、脱塩カラム、または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて精製する必要があります。 </li></ol> 5。水配位数の決定（Q） <ol><li> H 2 Oで複雑 ​​な（〜1 mm）を含むIII - EUのソリューションとD 2 Oで同じ濃度の別の溶液を調製します分析前に、D 2 O溶液は、残留H 2 Oを除去するために三回を蒸発させて、D 2 Oに溶解する必要があります。 </li><li>きれいなキュベットに水溶液を追加し、分光にキュベットを置きます。 </li><li> （〜395 nmと〜595 nmの、それぞれ）ごとに最大値を決定するために励起および発光スキャンを実行します。 </li><li>ステップ5.3、励起および発光スリット幅（5 nm）から決定した励起および発光波長、発光回数（100）、最初の遅延（0.01ミリ秒）、最大遅延（13ミリ秒）：次のパラメータを使用して燐光時間の崩壊実験を行います、および遅延の増加（0.1ミリ）。これらの条件は、ほとんどの複合体に適していますが、最大遅延値と増分値は、極端に長いまたは極端に短い減衰時間を持つ種については増減することができます。 </li><li>ステップ5.1で作成したD 2 O溶液を用いて、ステップ5.4を繰り返します。 </li><li> 5.4と5.5で得られた発光減衰データから、強度対時間の自然対数をプロット。これらの線の傾きは、減衰率（τ-1）（図2）です。このビデオでは、Microsoft Excel 2007が生データから自然対数プロットを生成するために使用されていました。ホロックスと同僚（式1）3で開発された方程式に減衰率を使用してください。あなたの配位子が金属に配位するOHまたはNH基が含まれている場合、式は使用3の前に変更する必要があります。 </li></ol> 式1： <img src="/files/ftp_upload/2844/2844eq1.jpg" alt="式1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式（1）"> 6。緩和測定<ol><li> T 1（縦緩和時間）またはT 2（横緩和時間）：緩和時間のアナライザで、目的のアプリケーションモードを選択します。 </li><li> Gdの異なる濃度IIIを含有する水性溶媒中での複合体を含む一連のサンプルを準備します。このビデオでは、水を溶媒として使用され、10.0、5.00、2.50、1.25、0.625、0 mMの溶液を調製した。その他の水性溶剤またはバッファが使用されますが、それは空白のような溶媒を使用することが重要であることができる。サンプルの最終容量は、使用されている楽器に固有のものです。 </li><li>器にサンプルを置き、それは楽器の温度（37℃このビデオではC）に平衡に5分間放置します。 </li><li> T 1またはT 2（T 1とT 2の代表的な曲線を図3に示されている）のための滑らかな指数曲線を得るために、ソフトウェアのパラメータを調整することにより緩和時間を（秒単位）を決定します。 </li><li>空白を含むすべてのサンプルのステップ6.3と6.4を繰り返します。 </li><li> s -1の単位で測定されたT 1またはT 2の値の逆数を計算します。 </li><li> T 1 -1またはT GdのIIIの濃度に対する2 -1の値を（mm単位の）をプロットする。ためにGdのIIIを含む複合体の吸湿性の性質から、原子吸光光度法又は誘導結合プラズマ質量分析法を用いたGdのIIIの濃度を確認する。直線とプロットをフィット。代表的なプロットを図4に示されています。 </li><li>近似直線の傾きは緩和（T 1とT 2、それぞれのためのR 1またはR 2）であり、mMの-1 s -1の単位を持っています。 </li></ol> 7。代表的な結果このプロトコールのステップのための代表的なデータを表と図のセクションに含まれています。プロトコールに記載されて水の配位数と緩和の特性評価に加えて、それは標準的な化学的手法を用いて最終製品を特徴づけることが重要です。化合物の同定は、質量分析、及びGd IIIの診断同位体パターンを示す代表的な質量スペクトルを使用して取得することができます-とEu III含有複合体を図5に示されています。さらに、非GdのIII用<img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1メタル化と精製の ​​ための一般的なスキーム：スキームは、メタル化し、異なる精製の ​​ルートを選んだ理由のための一般的な手順を描いた。 <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2発光強度をプロットする：セクション5から強度対時間の自然対数の代表プロット。水とD 2 Oのソリューションのために取得した同じようなカーブから生成された線の傾きは、Euの水の配位数IIIを含有する複合体を特徴づけるために式1で使用されています。 <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3リラクゼーションの減衰時間曲線：（左）T 1と（右）T 2取得 ​​のための代表的なデータ。これらの曲線の形状からの偏差は、信頼できないデータが生成されます。 <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4緩和の決定：GdのIIIの濃度対1 / T 1の代表的なプロット。近似直線の傾きは緩和であり、mMの-1 s -1の単位を持っています。 <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5マススペクトル：（左）GD III含有複合体及び（右）のEu III含有複合体の診断同位体パターンを示す代表的な質量スペクトル。黒のガウスピークは理論的な同位体の分布を表し、赤い線が実際のデータです。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ランタニド系造影剤4-14を含んで出版物の増加を考えると、それはケアが、準備、精製、および再現性と比較可能な結果を確保するために製品の特性で撮影されていることが重要です。これらの複合体は、しばしば精製し、その常磁性の性質とバイオコンジュゲーションのために使用される可能性のある官能基の感受性に起因する有機分子の相対的な特徴づけるために挑戦と考えられている。我々は、ランタニド錯体の合成、精製、および特性評価のための一般的な方法を記載している。しかし、これらの方法のいずれかを選択するときに、それは研究されている特定のシステムを考慮することが重要です。 錯体形成反応において、市販されている金属塩の様々な使用することができ、塩の選択は、研究の目的に依存します。例えば、塩化（またはトリフレートまたは硝酸塩）塩を使用する利点は、比較的温和な条件は温度に対して必要であるということです。しかし、これらの方法は、pHの注意深い監視を必要とし、副産物として塩を生成する。研究されているシステムは、pHの変化に特に敏感である場合、pH値の注意深い監視と制御を実行する必要があります。また...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬および器具</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> EuCl 3•6H 2 O </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 203254 - 5G </td></tr><tr><td> P - SCN - BN - DTPA </td><td> Macrocyclics </td><td> B - 305 </td></tr><tr><td>アンモニウム水酸化</td><td> EMD </td><td> AX1303 - 3 </td></tr><tr><td>スペクトラ/ポアバイオテックセルロースエステル（CE）透析膜 - 500 D分画分子量</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 68-671-24 </td></tr><tr><td>ミリポアICマイレクス- LGフィルターユニット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> SLLG C13 NL </td></tr><tr><td>キシレノールオレンジ四ナトリウム塩</td><td>アルファAesar </td><td> 41379 </td></tr><tr><td>酢酸</td><td>フルカ</td><td> 49199 </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td>ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ、（株） </td><td> DLM - 4 - 25 </td></tr><tr><td>浄水器</td><td>エルガ</td><td> Purelabウルトラ</td></tr><tr><td>高速液体クロマトグラフィーと質量分析</td><td>島津</td><td> LCMS - 2010EV </td></tr><tr><td>緩和時間のアナライザ</td><td>ブルカー</td><td> mq60ミニスペック</td></tr><tr><td>紫外可視分光光度計</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 20-624-00092 </td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 10-030-133 </td></tr><tr><td> pHメータ</td><td>ハンナインスツルメンツ</td><td> HI 221 </td></tr><tr><td>蛍光光度計</td><td>ホリバジョバンイボン</td><td> Fluoromax - 4 </td></tr><tr><td>マシューモンローによる分子量の計算のバージョン6.46は、2009年10月17日ダウンロード</td><td> <a href="http://ncrr.pnl.gov/software/">http://ncrr.pnl.gov/software/</a> </td><td>分子量の計算</td></tr></tbody></table>

磁気共鳴イメージングのための準備、精製、および造影剤として使用するための希土類錯体のキャラクタリゼーション

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Polyaminopolycarboxylateベースのリガンドは、一般的にランタニドイオンをキレートするために使用され、結果として得られる複合体は、磁気共鳴画像（MRI）用造影剤として有用である。多くの市販のリガンドは、アミン反応性の活性エステルとイソチオシアネート基又はチオール反応性マレイミドを介して高分子と生体分子への彼らは、高速、高純度を可能にする官能基を含んでいるために特に有用であり、かつ高収率共役。これらのリガンドのメタル化は、コンジュゲーション化学、メタル化の手順の微妙な違いの分野における一般的な知識と考えている間に金属の出発物質を選択する際に考慮する必要があります。さらに、精製および特性評価のための複数のオプションが存在し、最も効果的な手順の選択は、部分的に出発原料の選択に依存します。これらの微妙な違いは、多くの場合、パブリッシュしたプロトコルでは無視されています。ここで、私たちの目標は、メタル化、精製、およびMRI（図1）のための造影剤として使用することができるランタニド錯体の特性評価のための一般的な方法を示すことです。我々は、この出版物は、生物医学科学者は、出発原料と精製方法の選択を緩和し、一般的に使用される反応の彼らのレパートリーにランタニド錯体形成反応を組み込むことが可能になることを期待しています。

我々は、メタル化、精製、及びランタニド錯体の特性を示しています。ここで説明する複合体は、磁気共鳴イメージング法を用いて、これらの分子のトラッキングを有効に高分子に結合させることができる。

ポリアミノポリカルボン酸系リガンドは、ランタノイドイオンをキレートするために一般的に使用されており、得られた錯体は...の造影剤として有用である。

この手順の全体的な目的は、生体高分子のタグ付けに使用可能なランタノイド含有錯体を合成、精製し、特性解析することです。これは、まず溶液のpHを制御しながら、金属出発物質と配位子を混合することで達成されます。手順の第2ステップでは、得られた錯体を透析を用いて精製します。次に、遊離金属が存在しないことを確認する必要があります。本手順の最終ステップは、イメージングに関連する複合体の特性評価です。最終的に、緩和能測定を通じて、合成した複合体が造影剤として機能することを示す結果を得ることができます。この手法は、造影剤がタンパク質に結合した際に水の配位数に変化が生じるかなど、イメージング分野における重要な疑問への回答に役立ちます。一般的に、この手法を必要とする方は、pHを厳密に制御しすぎるとLIが生物教育に不適切な状態になるため、苦労することになります。透析と活性測定の実演は、BudaおよびSashiが行います。私の研究室の大学院生による手順です。ランタノイド塩を用いたメタレーションを開始するには、まず1当量の配位子を水に溶解し、30から265 millimolarの溶液を作成します。ここでは、配位子Paraiso Benzyl DTPAを73 Millimolarの濃度で使用しています。次に、1 molarの水酸化アンモニウムを添加し、配位子溶液のpHを5.5から7の間に調整します。このビデオでは、1 Mの水酸化アンモニウム溶液0.2 mLを使用して、1〜2当量のランタノイド塩化物を水に溶解し、5〜1000 mMの濃度の溶液を調製します。塩化ユロピウムまたは塩化ガドリニウムを111 mMの濃度で使用することが可能です。多くの場合、反応を完結させ、その結果として精製を簡略化するために、過剰量の金属が使用されます。次に、攪拌しながら、調製したリガンド溶液に各ランタン塩溶液を加えます。続いて、0.2 molar 水酸化アンモニウムを加えて、得られた反応混合物の pH を 5.5 から 7 の間に調整します。ここでは、溶液の調整に合計 0.5 milliliters の 0.2 molar 水酸化アンモニウム溶液を使用します。使用するリガンドに酸に敏感な官能基が含まれている場合は、このステップの間に数回pH調整を行ってください。溶液が塩基性に傾きすぎると、イソチオシアネートなどの塩基に敏感な官能基が使用不能になるため、pH調整の際は十分にご注意ください。コンジュゲーションにおいては、pH測定によって反応を注意深くモニタリングしてください。pHが一定に保たれた時点で反応は完了となります。塩基に敏感な官能基を持たないリガンドの場合、pHを上昇させる後処理が有用な場合もあります。透析による後処理を開始するには、サンプル量に加え、さらにサンプル量の10%を保持できる余裕を持たせた適切な

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