非キレート化ガドリニウム（III）のためのアプタマーベースのセンサー

この蛍光ベースのアッセイの全体的な目標は、磁気共鳴イメージング造影剤を含む水溶液中の有毒な非キレート化ガドリニウムイオンの存在を検出することです。この方法は、合成された薬剤の高いパリティを確保する手段を提供することにより、ガドリニウムベースのMRI造影剤を容易にするのに役立ちます。この技術の主な利点は、他の生物学的金属カチオンよりも比較的高い選択性で、非キレート化毒性ガドリニウムのサブマイクロモル濃度を検出できることです。

この手順を開始するには、テキストプロトコルに概説されているようにアッセイバッファーを調製します。水酸化ナトリウムと塩酸を使用して、pHを7.4に調整します。次に、0.2ミクロンのPESメンブレンを備えた滅菌済みの使い捨てボトルトップフィルターでバッファーをろ過します。

次に、497マイクロリットルのアッセイバッファーを新しいマイクロ遠心チューブに移します。調製したガドリニウムアプタマー原液1マイクロリットルと調製したQS原液2マイクロリットルを加えます。この2Xガドリニウムセンサー溶液を50マイクロリットルを9本のPCRチューブのそれぞれに移します。

この後、チューブをサーマルサイクラーに入れます。サーマルサイクラーをサンプルを摂氏95度に5分間加熱するように設定し、次に溶液を15分かけてゆっくりと摂氏25度に冷却します。2倍のガドリニウムセンサー溶液を95度に加熱し、その後、ガドリニウムイオン溶液を追加する前に室温までゆっくりと冷却することを覚えておくことが重要です。

まず、固体の三塩化ガドリニウムをアッセイバッファーに溶解して、所望の濃度のガドリニウム3ストック溶液を作成します。段階希釈を使用して、テキストプロトコルに概説されているように、6つの100マイクロリットルガドリニウム3溶液を調製します。この後、試験する造影剤をアッセイバッファーに溶解します。

段階希釈を使用して、3つの異なる濃度を調製します。次に、2Xガドリニウムセンサー溶液を含むPCRチューブをサーマルサイクラーから取り出します。各ガドリニウム3溶液の50マイクロリットルを別々のPCRチューブに移します。

各溶液を数回上下にピペットで動かして混合します。次に、各造影剤溶液の50マイクロリットルを別々に残りのPCRチューブに移します。ピペッティングで数回上下させて混合します。

9種類の溶液すべてを室温で5分間インキュベートします。この後、各溶液の45マイクロリットルを384ウェルプレートに二重に移します。次に、テキストプロトコルに概説されているように蛍光データを記録および分析します。

本研究では、水溶液中の非キレート化三価ガドリニウムイオンを蛍光法で検出します。蛍光センサーは、アプタマーに蛍光色素を付着させることで開発されます。次に、センサーはクエンチングストランドとハイブリダイズされ、クエンチング分子にダーククエンチャー分子がタグ付けされます。

ガドリニウム3の添加は、アプタマーからの焼入れ鎖を置換し、蛍光放出の増加を引き起こす。検量線は、100ナノモルのガドリニウムアプタマーと200ナノモルのQSを使用して取得し、生の蛍光または蛍光倍率変化をプロットしました。どちらの曲線も、ガドリニウムの3濃度が1マイクロモル未満で線形範囲を示し、3マイクロモルを超える濃度でのシグナルの飽和を示しています。

次に、ガドテリン酸の2つの異なるバッチを、0ミリモルから20ミリモルの範囲の濃度で分析します。高純度サンプルの蛍光発光は、この範囲では目立って増加しませんが、5ミリモルという低濃度の非キレート化ガドリニウム3を含むサンプルでは、有意な変化が観察されます。この手順を試行する際は、蛍光測定値が変わるため、マイクロプレートのウェルに気泡がないことを確認することが重要です。

この手順により、造影剤を含む溶液中の計算されたガドリニウムイオンを微量でも検出できる可能性があります。これは、薬剤の純度を決定するための良い方法になります。化学薬品の取り扱いは危険な場合があり、この手順を実行する際には個人用保護具を着用するなどの予防策を講じることが重要です。