Name: コットンでアグロバクテリウムを介したウイルス誘発遺伝子サイレンシングアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学ぶアグロバクテリウムを介したVIGS法で綿のGrCLA1遺伝子サイレンシングを行い、白化表現型を観察する技術。綿の遺伝子機能解析に有用な迅速な手法です。

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我々は、博士に感謝しています。 SPディネッシュ-クマールとユール劉TRV - VIGSのベクトルに対して、と博士。チャックKenerley、テリーウィーラー、ジムスターと綿の種子を提供するためのバイエルクロップサイエンス社。この作品は、PHにLSとNIHにNSFによって資金を供給された

1。綿の苗を育て<ol><li>アップランド綿（チョウ目害虫抵抗性ワタ）、様々なFibermax 832、Phytogen 425RF、Phytogen 480WRおよびメトロミックス700（SunGR、Beavile、ワシントン州）を含むポット（直径7cm）でDeltapine 90の種をまく。 </li><li> 23℃プラスチックドームで覆われているトレイにポットを保つ成長室で12時間light/12時間暗光周期と° C、120μEM -2 S -1の光、。 </li><li> two子葉が浮上しているドームを取り外します。 </li><li>約2週間後、VIGSアッセイの2つの完全に展開された子葉と植物を使用してください。この段階では、真の葉はまだ（図1）浮上していない。 </li></ol> 2。 GrCLA1​​遺伝子を運ぶVIGSベクターを構築<ol><li> G.のcDNAライブラリーからプライマーGrCLA1 ​​- Fを用いるPCR、5' - GCCCTTTGTGCATCTTC - 3'とGrCLA1 ​​- R、5' - CTCTAGGGGCATTGAAG - 3'で綿のCloroplastos alterados 1遺伝子（GrCLA1）を増幅するraimondii葉組織。 </li><li> EcoRIとKpnIでGrCLA1 ​​のPCR産物を消化し ​​、ライゲーションによってpYL156（pTRV - RNA2）ベクターに挿入する。 </li><li>カナマイシンの濃度50μg/ mLを含むLB寒天プレート上でクローンをスクリーニングする。制限酵素消化およびシーケンシングにより構造を確認してください。 </li><li>エレクトロポレーションによってアグロバクテリウムツメファシエンス GV3101にプラスミドをトランスフォームし、28℃のLB液体培地で回復℃のLBとプレート+カナマイシン（50μg/ mlの）+ゲンタマイシン（25μg/ mLの）上で形質転換体を選択してください。バクテリアは、-80℃で長期使用のため25％グリセロールで保存することができます。 </li></ol> 3。 VIGS接種を行います<ol><li>カナマイシンの濃度50μg/ mLを含むLB寒天プレート上RNA2 - GrCLA1：接種の3日前、pYL192（TRV）を保持するアグロバクテリウムツメファシエンスの縞凍結グリセロールストック：RNA1、pYL156（TRV）：RNA2（ベクターのみ ​​）とpYL156（TRV）と25μgの/ゲンタマイシンのmLの。 24時間、28℃で培養する。 </li><li> VIGSの浸潤への2日前には、上記のプレートから各構成要素のために単一コロニーを採取し、カナマイシン50μg/ mLのとゲンタマイシンの25μg/ mLのを補充したLB培地5mLにそれを接種する、28で細菌培養を育て° 50rpmの速度でローラードラムで一晩のためのC。 </li><li>と20μMのアセトシリンゴン - カナマイシン50μg/ mLのとゲンタマイシンの25μg/ mLの、プラスの10mM MES（（4モルホリノ）エタンスルホン酸2）を補充したLB培地50mLでフラスコに、上記の文化を移す。 ° C〜50 rpmの速度でシェーカーで一晩のために28で文化を育てる。 </li><li>次の日に、5分間4000rpmでアグロバクテリア細胞をスピンダウンし、10mMのMgCl 2、10mMのMESおよび200μMのアセトシリンゴンを含む浸透バッファに文化を再サスペンド。 1.5文化のOD 600を調整します。 </li><li> 3時間室温でベンチに文化を残す。 </li><li> Agrobacterial浸潤に先立って、パンチ子葉を通して貫通せずに25 Gの針を持つ綿の植物の子葉の裏面。一つまたは二つの穴は、（組織の柔らかさに依存する）子葉の各セクション（図2）にパンチした。 </li><li> 1:1の比でRNA2 - GrCLA1、手には1を使用して負傷サイトを通じて子葉の下側から混合物を浸透させる：RNA1とpYL156（TRV）：：RNA2またはpYL156（TRV）pYL192のAgrobacterial培養懸濁液（TRV）を混在させるmLの無針注射器（図3）。 </li><li>プラスチックドームで植物をカバーし、一晩薄明かりの状態で、室温で浸透した植物を残す。 </li><li> 12時間の明/ 12時間暗のサイクルで23℃、120μEM -2 S -1の光の温度と成長のお部屋に植物を移す。 </li></ol>注：VIGSは、植物が23 ° Cまたは温室（25〜28 ° C）のどちらか下にあるときに動作する。温度が比較的低い場合（23〜25℃）、それは接種と表現型のためにより高い（28-30 ° C）または変動温度に比べてより均一であるほうが簡単です。ドームで植物を覆うこともVIGSがより効率的になります。 <ol start="10"><li> 7〜8日後の浸潤におけるサイレンシング表現型を調べます。 pYL156（TRV）によって沈黙植物の真の葉：RNA2 - GrCLA1 ​​はアルビノ表現型（図4）を表示するために始めた。アグロバクテリウムキャリングpYL156（TRV）を浸透植物：RNA2はコントロールとして使用。 </li><li>コントロールと沈黙綿の植物から単離されたRNAを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT - PCR）を用いて内在性遺伝子の発現レベルを調べることにより、遺伝子サイレンシングの効率を確認してください。 </li></ol>注：TRVは広い宿主範囲を持っていると届出病原体であるとしてVIGS - edの植物が含まれている検疫条件および植物の下に保持されるべきは、適切にオートクレーブし、アッセイ後に廃棄する必要があります。 4。代表的な結果： 約2週間Agrobacterial混合物と手浸潤した後、GrCLA1 ​​サイレンシングによって引き起こさアルビノ表現型が明らかに本当の葉で観察された。サイレンシングの効率は50以上の植物を使用して複数の実験でほぼ100％に達する。沈黙の植物は、新たに兄の葉（図4）上にモザイクの葉を開発する上で均一に分布し、非常に強力なアルビノの表現型を表示します。 <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図 Agrobacterial浸潤のために使用される2つの完全に展開された子葉と約2週齢の段階で1。綿の苗。 <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2。Agrobacterial浸透を容易にするために、25 Gの針を使用して綿の植物の子葉の下側に小さな穴をパンチング。 <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3"> 無針注射器を使用して傷のサイトを通じて、綿の子葉にAgrobacterial混合物の図3。ハンドの浸潤<img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図4"> 図4。アルビノの表現型は、綿の植物を沈黙さVIGSに登場。四品種が表示されます。 A）Fibermax 832、B）Phytogen 480WR、C）Phytogen 425RF、D）Deltapine 90。

<ol><li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+sequencing+cotton+%28Gossypium%29+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li>
<li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li>
<li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li>
<li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li>
<li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li>
<li>Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+expression+of+CLA1%2C+a+gene+that+encodes+the+1-deoxyxylulose+5-phosphate+synthase+of+the+2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).</li>
<li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLA1%2C+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development%2C+is+highly+conserved+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li>
<li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

VIGSは、一時的に内在性遺伝子の発現をノックダウンにより、機能的なゲノミクス解析の強力なツールであることが証明されています。本研究では、我々はTRV -ベースのバイナリーベクターを利用することにより、アグロバクテリウムを介したVIGSを開発した。綿CLA1（GrCLA1）遺伝子サイレンシングの効率を監視するための視覚的なマーカーとして開発されました。我々は一貫して取得しているすべての品種で、真の葉の上に現れるアルビノ表現型によって示される遺伝子サイレンシング効率の100％は、約2週間後の浸潤から始まり、テストされています。しかし、ほとんど可能性が高い葉緑体の発達に大きな欠陥が原因である繊維や種子の段階、へと発展していない綿の植物をCLA1 -黙らせた。綿のVIGSの開発に成功は容易に機能喪失型のアッセイのための関心のある遺伝子を沈黙させる代替手段を提供し、高速に近づいポストゲノム時代8の綿機能的遺伝学/ゲノミクスの基盤となります。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬と機器の名称</th><th>会社</th><th>カタログ/シリアル番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>ローラードラム</td><td>グラス=コル、LLC。 </td><td> 099A TC108 </td><td>アグロバクテリアの培養</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>シェルドンマニュファクチャリング株式会社</td><td> 01046209 </td><td>アグロバクテリアの培養</td></tr><tr><td> UV / VIS分光光度計</td><td>ベックマンコールター</td><td>モデル：DU530 </td><td>測定OD </td></tr><tr><td>ジーンパルサー</td><td> BioRad社</td><td>モデル：1652076;シリアル：154BR3880 </td><td>エレクトロポレーション</td></tr><tr><td>パルサーコントローラ</td><td> BioRad社</td><td>モデル：1652098;シリアル：232BR4833 </td><td>エレクトロポレーション</td></tr><tr><td> Micropulserエレクトロポレーションキュベット</td><td> BioRad社</td><td> 165-2081 </td><td>エレクトロポレーション</td></tr><tr><td> 1 mlのシリンジ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 30962 </td><td>アグロバクテリアの接種</td></tr><tr><td>メトロミックス700 </td><td> SUNGR </td><td> SKU＃553001 </td><td>成長する苗</td></tr><tr><td>テラコッタポット</td><td> TOPlastics </td><td> GPS 3001B2 </td><td>成長する苗</td></tr><tr><td> MES一水和物</td><td> USB </td><td> 18886 </td><td>浸潤のバッファ</td></tr><tr><td>アセトシリンゴン</td><td>シグマ</td><td> D134406 </td><td>浸潤のバッファ</td></tr></tbody></table>

コットンでアグロバクテリウムを介したウイルス誘発遺伝子サイレンシングアッセイ

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

コットン（ チョウ目害虫抵抗性ワタ ） が世界中で最も重要な作物の一つです。かなりの努力が、新品種の分子育種が行われている。綿花の大規模な遺伝子機能解析は、ゲノム、遺伝子重複と倍数性、遺伝的形質転換1〜長期成長サイクルと反抗のその大きさに起因する可能性が高い近代的な植物種、の中で最も遅れをとっている。綿の高スループット機能遺伝学/ゲノム研究を容易にするために、我々は、綿の遺伝子機能を評価するために迅速かつ効率的なトランジェントアッセイの開発を試みる。 ウイルス誘導ジーンサイレンシング（VIGS）は、ウイルス増殖2,3を抑制する宿主転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）に基づいて開発された強力な手法です。 Agrobacterium媒介VIGSが正常に様々な機能ゲノム研究の3,4のために、広くそのようなナス科、シロイヌナズナおよびマメ科植物の種などの双子葉植物の種の範囲、及び大麦、小麦、トウモロコシを含む単子葉植物の種に適用されている。この迅速かつ効率的なアプローチは、植物形質転換を回避し、機能的な冗長性を克服するとして、それは特に魅力的と変換のための従順ではない綿のような作物種の機能性ゲノム研究に適しています。 本研究では、我々は、綿のアグロバクテリウムVIGSのシステムの詳細なプロトコールを報告する。いくつかのウイルスVIGSのベクターのうち、タバコのガラガラのウイルス（TRV）がホストの広い範囲に侵入した後、まだhosts5で軽度の症状を作り出すプラント全体にわたって精力的に感染することが可能です。サイレンシングの効率を監視するには、GrCLA1、綿のシロイヌナズナCloroplastos alterados 1遺伝子（AtCLA1）のホモログ遺伝子が、VIGSのバイナリーベクターpYL156中にクローニングし、挿入されている。CLA1遺伝子が葉緑体の開発6、および以前の研究に関与していることはことが示されているAtCLA1の機能喪失効率を黙らせるための優れた視覚的なマーカーを提供する、真の葉7のアルビノ表現型をもたらした。約2週間でポストアグロバクテリウムの浸潤、アルビノ表現型はすべて反復実験で100％のサイレンシングの効率で、真の葉の上に登場し始めました。内因性遺伝子発現のサイレンシングは、RT - PCR分析により確認した。著しく、サイレンシングが強力にテキサス州の様々な商業的に栽培品種を含めて我々がテストしたすべての品種で発生する可能性があります。この迅速かつ効率的なアグロバクテリウムVIGSアッセイは、綿のゲノムワイドなレベルでの遺伝子機能の迅速な大規模解析のための非常に強力なツールが用意されています。

我々は、綿のアグロバクテリウムを介したウイルス誘発遺伝子サイレンシング（VIGS）アッセイの詳細なプロトコールを提示する。タバコ茎えそウイルス（TRV）由来VIGSベクターは、R​​NAが綿GrCLA1​​、C​​loroplastos alterados 1遺伝子のサイレンシング誘導するために配備されました。サイレンGrCLA1​​によって引き起こさアルビノ表現型は、接種後2週間以内に幼苗期で観察された。

綿（Gossypium hirsutum）は、世界で最も重要な作物のひとつである。新品種の分子育種には多大な努力が注がれてきた。その...

本手順の全体的な目的は、遺伝子機能を研究するために、アグロバクテリウムを媒介としたウイルス誘導性遺伝子サイレンシング（VIGS）アッセイを綿花で構築することです。まず、綿花の苗を播種後10日から2週間までの段階まで成長させます。次に、綿花の葉緑体rados 1遺伝子を、タバコ rattles virus（TRV）ベースのVIGSベクターにクローニングします。第3のステップは、P-T-R-V-R-N-A 1およびP-T-R-V-G-R-C-A 1を含むアグロバクテリウム培養液を調製することです。最終ステップでは、これらのアグロバクテリウム培養液を綿花の子葉柄に手作業で接種します。最終的に、約2週間後に綿花植物の本葉に白化表現型を観察することで、遺伝子サイレンシングの結果を示すことができます。形質転換などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、VIGsが綿花における遺伝子機能研究のための迅速かつ効率的なプラットフォームを提供することです。この手法は、綿花におけるゲノムワイドなレベルでの迅速かつ大規模な遺伝子機能解析のための強力なツールとなり得ますが、他の重要な作物種にも適用可能です。一般的に、この手法に慣れていない人は、アグロバクテリウム培養液の接種や綿花の子房への接種が困難であるため、習得に苦労することがあります。この手法は、ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング（VIGS）のために綿の苗を育成させるなど、綿の遺伝学およびゲノミクス分野における遺伝子機能の探索といった重要な疑問を解決するのに役立ちます。Metro-Mix 700を複数の7 cmポットに入れ、満たしたポットをトレイに配置します。次に、FiberMax 832 PhytoGen 4, 25, RF PhytoGen 4 80 WR、およびDeltaPine 90などのいくつかの陸地綿品種の種子を播種します。準備したポットにおいて、ポットの入ったトレイをプラスチック製ドームで覆い、温度 23 °C、光量 120 µEinsteins/m²/s、明期 12 時間・暗期 12 時間の光周期に設定された育成室に置きます。3〜4日後、2枚の子葉が展開したら、プラスチック製ドームを取り除きます。綿花を約 10 日間育成し、2枚の子葉が完全に展開し、かつ本葉が出現する前の段階まで成長させます。これで、植物をウイルス誘導性遺伝子サイレンシング（VIGS）アッセイに使用できる状態になります。これらのクローニング手順は、綿植物が完全に展開した段階に達する2週間の期間内に実施してください。まず、書面によるプロトコルに記載されたプライマーを使用し、標準的なPCR手順に従って、CACI remondi 葉組織の cDNA ライブラリから綿クロロプラスト one 遺伝子を増幅させます。次に、酵素メーカーのプロトコルに従い、Ec

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生物学

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最適化と利用の<em&gt;アグロバクテリウム</em中&gt;媒介一過性タンパク質産生<em&gt;タバコ</em

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コットンでアグロバクテリウムを介したウイルス誘発遺伝子サイレンシングアッセイ

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