コットンでアグロバクテリウムを介したウイルス誘発遺伝子サイレンシングアッセイ

この手順の全体的な目標は、遺伝子機能を研究するために、綿のアグロバクテリア媒介ウイルス誘導遺伝子サイレンシングアッセイを開発することです。これは、最初に綿の苗を生後10日から2週間の段階まで育てることによって達成されます。次に、綿の葉緑体rados 1遺伝子がタバコガラガラウイルスベースのvsベクターにクローニングされます。

第3のステップは、P-T-R-V-R-N-AとP-T-R-V-G-R-C-Aを含むアグロバクテリウム培養物を調製することです。最後のステップは、アグロバクテリウム培養物を綿割り子鉛に手で接種することです。最終的には、約2週間後に綿花の本葉のアルビノ表現型を観察することで、遺伝子サイレンシングの結果を示すことができます。

形質転換などの既存の方法と比較した場合、この手法の主な利点は、VIG が綿の遺伝子機能研究に迅速かつ効率的なプラットフォームを提供することです。この方法は、綿のゲノムワイドレベルでの遺伝子機能の迅速で大規模な解析のための強力なツールであることが証明されていますが、他の重要な作物種にも適用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、アグロバクテリウム培養物と綿花の手作業による接種が難しいため、苦労するでしょう。

この方法は、ウイルス誘発遺伝子サイレンシングのための綿の苗を育てるための遺伝子機能の探索など、綿遺伝学およびゲノミクス分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。メトロミックス700をいくつかの7センチのポットに追加し、満たされたポットをトレイに置きます。次に、ファイバーマックス8 3 2フィト、第4世代、第2 5世代、RFフィト、第4世代80 WR、デルタパイン90など、いくつかの高地綿花品種の種子を植えます。

準備したポットで、プラスチックのドームでポットを含むトレイを覆い、トレイを成長室、摂氏23度、120マイクロアインシュタイン/平方メートル/秒のライトに12時間のライト、12時間の暗い写真期間に置きます3〜4日後、2つのオレアンが出てきたら、プラスチックドームを取り外します。綿花が2つの完全に拡張されたベビートリードインが発達した段階に達するまで、綿花を約10日間成長させます。しかし、本葉が出現する前に、植物はウイルス誘導遺伝子サイレンシングアッセイに使用する準備が整います。

これらのクローニング手順は、綿花が完全に拡大した段階に達する2週間の期間中に実行する必要があります。まず、標準的なPCR手順に従って、書面によるプロトコルで提供されているプライマーを使用して、CACI remondi葉組織のCD NAライブラリーから綿葉緑体1遺伝子を増幅します。次に、酵素メーカーのプロトコルに従って、GCA one PCR産物をEcho R oneおよびK PN oneで消化します。

500塩基対のPCR産物をAtheneブロマイドゲル上に可視化します。バンドを切り取り、精製されたPCR産物であるDNAライゲートをPYL 1 56ベクターに抽出します。T 4 DNAリガーゼを使用して、ライゲーションされたベクターでコンピテントな大腸菌細胞を形質転換し、形質転換された細胞の10〜50マイクロリットルを、カナムマイチンのミリリットルあたり50マイクログラムを含むLBA寒天プレートに広げます。

翌日、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。プレートからコロニーを選び、缶マイシン1ミリリットルあたり50マイクログラムを含む2ミリリットルのLBブロスで一晩成長させ、遠心分離によってバクテリアを収穫し、標準的な手順に従ってDNA調製を行います。プラスミドDNAを精製するには、制限酵素消化およびシーケンシングによりコンストラクトを検証します。

PYL 1 56ベクター中のインサートの存在と配向を確認したら、プラスミドをアグロバクテリウム腫瘍fas GV 3 1 0 1に電気操作し、摂氏28度のLB液体培地で回収します。缶マイシン1ミリリットルあたり50マイクログラム、ゲンタマイシン1ミリリットルあたり25マイクログラムを含むLBI寒天プレート上の形質転換体を選択します。必要に応じて、バクテリアをマイナス80°Cで25%グリセロールに保存できます。

接種ストリークの3日前に、Tは、PYL 1 9 2 RNA 1 PY、1 56 RNA 2、およびPY 1 56 RNA 2、PY 1 56 RNA 2、GLA OneをLB抗生物質寒天プレートに運ぶアグロバクテリウム腫瘍相のグリセロールストックを、プレートを摂氏28度で24時間インキュベートすると考えました。翌日、各コンストラクトごとに1つのコロニーを選び、各コロニーを5ミリリットルのLB培地に接種します。缶マイシン1ミリリットルあたり50マイクログラム、ゲンタマイシン1ミリリットルあたり25マイクログラムを補充。

毎分50回転の速度で設定されたシェーカーで、摂氏28度で一晩細菌培養を成長させます。PYL 1、56 RNA、2 GLA One、培養および対照培養物を、50 ミリリットルのLB培地を含む別々のフラスコに移し、50 μg/ミリリットルの缶マイシンと25 μg/ミリリットルのゲンタマイシンに加えて、10ミリモルのMESと20マイクロモルのアセトを添加します。サイリンギー 毎分50回転の速度で設定されたシェーカーで、摂氏28度で一晩で培養します。

翌日、培養物を遠心分離管に移し、アグロ細菌細胞を毎分4,000回転でスピンダウンします 5分間、10ミリモルの塩化マグネシウム、10ミリモルのMESおよび200マイクロモルのアセタチロンを含む浸潤緩衝液に培養物を再懸濁します。培養物のOD600を測定し、浸潤バッファーで1.5に調整します。アグロバクテリアの葉が浸潤する前に、室温で3時間ベンチで培養物をインキュベートします。

綿花のコットレジンの下側を、コットリードインを突き刺さずに25ゲージの針でパンチします。コット・リードインの各セクションに1つまたは2つの穴が開けられています。次に、PYL 1 92 RNA 1 agro bacterial cultureを、PYL 1 56 RNA 2またはPY 1 56 RNA 2 GRCA 1のいずれかと1対1の比率で混合します。

次に、1ミリリットルの針または注射器を使用します。パンチ穴を通してコットリードインの下側に混合物を導入します。植物をプラスチックのドームで覆い、浸潤した植物を薄暗い光の条件下で室温で一晩放置します。

植物を摂氏23度、120マイクロアインシュタイン/平方メートル/秒の光、12時間の光、12時間の暗サイクルの成長室に移します。浸潤後7〜8日でサイレンシング表現型を調べます。この時点で、PY 1 56 RNA 2 GLA 1によってサイレンシングされた植物の真の葉は、アルビノの表現型を示し始めます。

植物は、PYL 1 56 RNA 2を運ぶアグロバクテリアが浸潤しました。コントロールとして機能します。標準的な手順に従って、コントロールおよびサイレンシングされた綿植物から単離されたRNAを用いた逆転写PCRを用いて内在性遺伝子の発現レベルを調べることにより、遺伝子サイレンシング効率を検証します。

この画像は、GLA 1遺伝子のウイルス誘導遺伝子サイレンシング後の繊維max8 3 2品種を示しています。ここでは、遺伝子サイレンシングが発生した白い葉に注意してください。PHYTO four 80 WR品種は、ウイルス誘発遺伝子サイレンシング後にアルビノの表現型も示します。

同様に、このフィト4 2 5 RF品種は、ウイルスによる遺伝子サイレンシングが発生した場所で白い葉を示します。最後に、この画像は、デルタPINE 90品種で成功した別のウイルス誘導遺伝子サイレンシング実験を示しています。この手順を試みる際には、この手順の3時間後にアグロバクテリウム培養物をベンチに置いたままにする前に、アセトンをアグロバクテリウム培養物に加えることを忘れないでください。

vig、CD NAライブラリクローニングなどの他の方法を実行して、開発後の新しい遺伝子機能の探索などの追加の質問に答えることができます。この技術は、植物遺伝学の分野の研究者が、経済的に重要な作物植物における抗生物質と生物的ストレスに対する遺伝子機能と防御応答を探求する道を開きました。データをマスクすると、この手法は適切に実行されれば2〜3日で実行できます。

このビデオを見れば、綿花でウイルス誘導遺伝子サイレンシングを行う方法についてよく理解できるはずです。