Name: 簡便な分離大豆プロトプ ラストと一過的遺伝子発現解析への応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学ぶ 大豆プロトプラストの簡便な調製法と一過的遺伝子発現解析への応用。適切な発育段階の葉を用いることで、大量の均一なプロトプラストを得られ、植物細胞の制御メカニズムやシグナル伝達を研究できます。

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この作品は、全米科学財団 (NSF-PGRP IOS-1339388) から植物ゲノム研究プログラムによって支えられました。

1. 植物の成長
<ol><li>大豆の 5-10 ダイズ種子 (ウィリアムズ 82) 長日条件 (16 h 1,500 µmol m-2の-1光) カスタム土壌ミックスの 25 ° c の下で温室で 13 cm ポットに種をまく (、1: 土、パーライト、魚雷の砂の比率 1:1)。</li>
</ol>2. DNA のプラスミッドの準備
<ol><li>滅菌ピペット チップやつまようじを使用すると、単一コロニーを大腸菌興味の遺伝子を含んでいるプラスミッドを運ぶ冷凍グリセロール ストックを選ぶし、20 mL ルリア ベルターニカミラ (LB) 液体培地 50 mL のフラスコに適切な抗生物質で予防接種します。</li>
	<li>シェーカーで一晩 37 ° C でフラスコを孵化させなさい。5 分間室温で 12,000 × g の懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄して細菌を収集します。抽出・精製プラスミド プラスミド準備キットの製造元の手順を実行します。</li>
</ol>3. プロトプ ラスト単離
<ol><li>10 日間の古い大豆苗 (図 1) から新しく拡張された単葉の葉をカットします。 注: 適切な発達段階で葉の選択は大豆プロトプ ラスト調製成功への鍵です。初期の発達段階で展開直後の葉だけ使用します。成熟した葉、消化する細胞壁と難しくなってください。</li>
	<li>新鮮なかみそりの刃を含む葉と 0.5-1 に残る mm ストリップ、カットから主脈を削除します。 注: 2 つの単葉の葉 10 mL の酵素液で消化は以上 10 変換のため十分なプロトプ ラストを与えます。</li>
	<li>葉が 10 mL を 15 mL チューブに作りたての酵素液 (表 1) にすぐにそして軽くをストリップ鉗子、転送のペアを使用しています。真空潜入葉ストリップ部屋の温度で 15 分。</li>
	<li>室温で 4-6 h の低照度下で穏やかな攪拌 (40 回転) と酵素液で葉の細片を孵化させなさい。プロトプ ラストがリリースされると、酵素液が黄色緑を回すことを確認します。(X10) 顕微鏡下で酵素/プロトプ ラスト ソリューションを確認してください。 注: リリースのプロトプ ラストは球状形、未消化の細胞が不規則なまたは楕円形です。</li>
	<li>そっとして 50 mL のチューブで酵素/プロトプ ラスト溶液 10 mL を転送し、消化を停止するために室温 W5 溶液 (表 1) 10 mL を追加します。穏やかに数回チューブを反転します。未消化の葉身を削除する 50 mL のチューブの上に置かれたきれいな 75 μ m ナイロン メッシュに酵素/プロトプ ラストの溶液を注ぐ穏やか。</li>
	<li>室温で 1-2 分の 50 mL のチューブで 100 x g でプロトプ ラスト酵素/フロースルー ソリューションを遠心します。プロトプ ラストのペレットを乱すことがなく 10 mL の血清ピペットを使用して上清を慎重に取り外します。</li>
	<li>プロトプ ラストを再懸濁し、プロトプ ラスト (x10) 顕微鏡で血球の数を数えることによって 2 x 105 mL-1 4 ° C に冷やした W5 ソリューションでの濃度に希釈します。30 分間氷の上プロトプ ラストをしてください。</li>
	<li>室温で 1-2 分の 100 x グラムの懸濁液を遠心し、原形質体の餌を乱すことがなく 1 mL ピペットを使用した W5 ソリューションを慎重に取り外します。室温で 2 x 105 mL-1濃度で MMG 解決方法 (表 1) プロトプ ラストを再懸濁します。</li>
</ol>4. プロトプ ラスト
<ol><li>プロトプ ラスト (2 x 104プロトプ ラスト 2 x 105 mL-1) の 100 μ 因数は 1.5 mL 低接着マイクロ遠心チューブ用ノーカット 200 μ L ピペット チップを使用してします。ネガティブ コントロールとして機能する 1 つの因数脇を置きます。プロトプ ラストの残りの因数のそれぞれにプラスミド (10-20 μ g) の 10 μ L を追加します。</li>
	<li>ゆっくり 1.5 mL 遠心チューブの内壁に作りたての止め釘の解決 (表 1) の 110 μ L を追加し、軽く反転ソリューションが均質になるまでチューブを回転させてください。</li>
	<li>15 分間室温で変換の混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>変換を停止するには、ゆっくりと室温で 1.5 mL チューブに W5 ソリューションの 400 μ L を追加し、ソリューションが均一になるまでやさしくチューブを転倒させます。室温で 1-2 分の 100 g でチューブを遠心分離、ピペットを使用して上澄みを廃棄します。</li>
	<li>チューブに無線ソリューション (表 1) の 1 つの mL を追加し、1-2 回を軽くピペッティングによって再懸濁します。表面をコートし、プロトプ ラストが板にくっつかないように 6 ウェル培養プレートの各ウェルに 5% (巻/巻) 滅菌子牛血清 1 mL を追加します。</li>
	<li>数秒後、ピペットを使用して子牛血清を破棄します。再懸濁のプロトプ ラスト培養プレートのウェルに移転します。蓋付きプレートをカバーします。</li>
</ol>5. プロトプ ラストの培養と収穫
<ol><li>暗闇の中で 1-2 日間室温でプロトプ ラストを孵化させなさい。 注: 1 日培養に比べて一般に強い蛍光蛋白質信号を 2 日間培養に利回りし、蛍光蛋白質信号が 3-4 日間続く可能性がありますがわかった。</li>
	<li>プロトプ ラストのソリューションを 1.5 mL の低接着微量遠心チューブに転送します。プロトプ ラストを収穫するために室温で 1-2 分の 100 x g でチューブを遠心します。ピペットを使用して上清を除去し、スライド ガラスに 10 μ L プロトプ ラストを転送します。</li>
	<li>蛍光共焦点顕微鏡又は蛍光信号を観察します。(信号を守らなければなりませんない) 陰性対照として非変形プロトプ ラストを使用します。</li>
</ol>

<ol><li>Melchers, G., Labib, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00271144">Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).</li>
<li>Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2474847">In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration.</a> Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).</li>
<li>Lörz, H., Baker, B., Schell, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00330256">Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation.</a> Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).</li>
<li>Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation+system+for+production+of+fertile+transgenic+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants.</a> Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).</li>
<li>Koop, H. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199 (2), 193-201 (1996).</li>
<li>Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003194220089679X">Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts.</a> Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).</li>
<li>Lin, W., Wittenbach, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+proteases+in+wheat+and+corn+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).</li>
<li>Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+cadmium+and+cadmium-binding+peptides+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves.</a> Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+transient+protoplast+system+for+analyzing+defence+gene+expression+and+protein-protein+interactions+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice.</a> Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).</li>
<li>Wu, F. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich-a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant methods. 5 (1), 16(2009).</li>
<li>Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+polyubiquitin+genes%3A+structure%2C+thermal+perturbation+of+expression+and+transcript+splicing%2C+and+promoter+activity+following+transfer+to+protoplasts+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation.</a> Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).</li>
<li>Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nature/journal/v335/n6189/abs/335454a0.html">Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts.</a> Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).</li>
<li>Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+and+fungal+elicitor+regulation+of+a+plant+defense+gene+promoter+in+electroporated+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+A.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).</li>
<li>Cocking, E. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nature/journal/v187/n4741/abs/187962a0.html">A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles.</a> Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rice+plants+produced+by+electroporation-mediated+plasmid+uptake+into+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts.</a> Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).</li>
<li>Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+genes+transferred+into+monocot+and+dicot+plant+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+A.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).</li>
<li>Crossway, A., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00331634">Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).</li>
<li>Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+barley+by+microinjection+into+isolated+zygote+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts.</a> Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).</li>
<li>Schapire, A. L., Lois, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+rapid+method+for+the+isolation+and+transfection+of+Arabidopsis+leaf+mesophyll+protoplasts+for+large-scale+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Transduction%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications.</a> Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).</li>
<li>Niedz, R. P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-005-9028-4">Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).</li>
<li>Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-011-0002-z">Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis).</a> Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).</li>
<li>Grun, P., Chu, L. -J. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2442587">Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae).</a> Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).</li>
<li>Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+protoplasts%3A+status+and+biotechnological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives.</a> Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).</li>
<li>Pitzschke, A., Persak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poinsettia+protoplasts-a+simple%2C+robust+and+efficient+system+for+transient+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies.</a> Plant methods. 8 (1), 14(2012).</li>
<li>Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565(2007).</li>
<li>Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+domestication%3A+the+origin%2C+genetic+architecture+and+molecular+bases%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases.</a> New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).</li>
<li>Yang, Y., Li, R., Qi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+plant+promoters+and+transcription+factors+by+agroinfiltration+of+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves.</a> Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).</li>
<li>Marion, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+protein+subcellular+localization+and+interaction+using+high-throughput+transient+transformation+of+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings.</a> Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).</li>
<li>Wu, H. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGROBEST%3A+an+efficient+Agrobacterium-mediated+transient+expression+method+for+versatile+gene+function+analyses+in+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings.</a> Plant methods. 10 (1), 19(2014).</li>
<li>Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+constitutive+viral+promoters+in+transgenic+soybean+roots+and+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules.</a> Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).</li>
<li>Nagamatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+soybean+genes+involved+in+flavonoid+biosynthesis+by+virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing.</a> Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).</li>
<li>Juvale, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+Bean+pod+mottle+virus-induced+gene+silencing+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean.</a> Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).</li>
<li>Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+an+efficient+multipurpose+bean+pod+mottle+virus+viral+vector+set+for+foreign+gene+expression+and+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing.</a> Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).</li>
<li>Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mesophyll+protoplasts+from+mature+leaves+of+soybeans%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans.</a> Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-repeat+MYB+transcription+factor%2C+GmMYB176%2C+regulates+CHS8+gene+expression+and+affects+isoflavonoid+biosynthesis+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean.</a> Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).</li>
<li>Faria, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAC+domain-containing+protein%2C+GmNAC6%2C+is+a+downstream+component+of+the+ER+stress-and+osmotic+stress-induced+NRP-mediated+cell-death+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway.</a> BMC Plant Biol. 11 (1), 129(2011).</li>
<li>Kidokoro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+DREB1%2FCBF-type+transcription+factors+function+in+heat+and+drought+as+well+as+cold+stress-responsive+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression.</a> Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+soybean+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system.</a> Sci Rep-UK. 5, 10342(2015).</li>
<li>Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11992820">GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).</li>
<li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+and+characterization+reveal+the+molecular+basis+for+soybean+maturity+locus+E1+that+regulates+photoperiodic+flowering%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+A.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ダイズプロトプと一過性発現研究への応用の分離のこのプロトコルは徹底的にテストされており、当研究室では非常にうまきます。手順はシンプルで簡単な一般的な機器を最小コストを必要とされます。我々 のプロトコルは、以前に報告された方法34,35,36,37,38に比べて均一で高品質のプロトプ ラストの大量を生成します。ただし、プロトプ ラストの収率と変換レートに影響を与える多くの要因があるので、実験条件、望ましい結果および使用される材料に従って条件を最適化する研究者も強く推奨します。このシステムは植物細胞における即時規制および生化学的イベントの検討に非常に役立ちますが、組織または個体レベルで発生するイベントと長期的細胞プロセスの観察に適してはありません。
理想的な発達段...

プロトプ ラストは、削除される細胞壁を持つ植物細胞です。機能のほとんどは、植物細胞の活動を管理するのでプロトプ ラスト観察・多様な携帯電話イベントを評価する良いモデル系、1体の交配を研究し、植物の再生2する貴重なツールです。プロトプ ラストは、細胞壁がブロックされセルに DNA の通過以来工場変換3,4、5、また広く利用されています。プロトプ ラストは生理学的な応答のいくつか、したがって細胞内タンパク質局在6,7、8を研究する基礎研究の基本的な値を提供して、そのまま植物の細胞プロセスを所有しています。蛋白質蛋白質の相互作用の9,10、プロモーター活動11,12,13ではセルを住んでいます。
196014で最初に報告された植物プロトプ ラストの分離と分離とプロトプ ラストの変形のためのプロトコルを開発し、最適化します。葉の切断と非消化組織破片からリリースされた原形質体の分離に続いて、細胞壁の酵素消化、原形質体の隔離の標準的な手順が含まれます。エレクトロポレーション15,16、マイクロインジェクション17,18、およびポリエチレング リコール (PEG)4,5,19手法変革戦略が含まれています。種の広い範囲は、原形質体の隔離、柑橘類20、アブラナ科21、ナス科22その他の観賞用植物家族23,24を含む成功報告されています。モデル植物シロイヌナズナの葉から分離したシロイヌナズナ葉肉プロトプ ラスト (TEAMP) に一過性発現系が確立した25をされている様々 な種では、多様な組織型が使用されて、多様なアプリケーションに広く採用されています。
大豆 (最高グリシン(l.)ダイズ) 最も重要なタンパク質の 1 つで、油作物26。異なり、シロイヌナズナイネ、遺伝子組み換え大豆の植物を得ることはむしろ困難と低効率に知られています。アグロバクテリウム-仲介された浸潤一般に使用されているタバコ27で表皮細胞およびシロイヌナズナ28,29, 苗の一時的な遺伝子発現研究に対しサツマイモネコブセンチュウは大豆30植物毛状根の変形のために使用されています。ウイルス誘導性遺伝子のサイレンシング アプローチは、ターゲット遺伝子の31,32と過渡式の33のダウンレギュレーションを系統的に利用されています。プロトプ ラストは、貴重な汎用性の高いこれらのアプローチ方法を提供します。プロトプ ラストは大豆の地上材料から得ることが、発現の迅速かつ同期ができます。しかし、1983年34ダイズプロトプ ラストの最初の成功した分離以来報告されている限られた大豆35,36,37,プロトプ ラストの応用38、主にダイズプロトプ ラストの比較的低い収穫のため。
ここでは、ダイズプロトプ ラストの分離のためのシンプルで効率的なプロトコルと一時的な遺伝子発現研究への応用について述べる。ダイズ芽ばえから若い単葉の葉を使用すると、数時間以内の重要なプロトプ ラストの大量を取得することができました。さらに、ペグによるカルシウムの変換法はシンプルで高効率で大豆プロトプ ラストに DNA を提供する低コストを最適化しています。

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8250-100G</td><td></td></tr><tr><td>セルラーゼ CELF</td><td>Worthington Biological Corporation</td><td>LS002611</td><td></td></tr><tr><td>ペクトリアーゼ Y-23</td><td>BioWorld</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>セルラーゼ "ONOZUKA" R-10</td><td>ヤクルト</td><td>10g</td><td></td></tr> マセロ<tr><td>チーム R-10</td> ヤ<td>クル</td>ト <td>10g</td><td></td></tr><tr><td>マンニトール</td><td>ICNBiomedicals</td><td>152540</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500g</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>Aldrich D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>ナイロン メッシュ</td><td>カロライナ</td><td>652222N</td><td></td></tr><tr><td>組織培養プレート</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>かみそりの刃</td><td>フィッシャー</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>血球計算計</td><td>hausserscientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep スピン Miniprep キット</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EZNA プラスミド ミニプレップ キット</td><td>オメガ</td><td>D6942-01</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET プラスミド ミニプレップ キット</td><td>サーモ サイエンティフィック</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5810</td><td>エッペンドルフ</td><td>5811000827</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5424</td><td>エッペンドルフ</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>ジェンコンズ パワーペット プラス ピペット コントローラー</td><td>ジェンコンズ</td><td>14526-202</td><td></td></tr><tr><td>ツァイス 710 共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ノンスティック、RNaseフリー マイクロチューブ、1.5 mL</td><td>アンビオン</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心チューブ</td><td>デンビル</td><td>C1018-P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心チューブ</td><td>デンビル</td><td>C1060-P</td><td></td></tr><tr><td>新生児用ウシ血清</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>土壌</td><td>イングラムのナーサリー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パーライト</td><td>ビゴロ</td><td>100521091</td><td></td></tr><tr><td>魚雷サンド</td><td>JKS Ventures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LBブロス レノックス (粉末)</td><td>フィッシャー</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr></tbody></table>

簡便な分離大豆プロトプ ラストと一過的遺伝子発現解析への応用

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

大豆 (最高グリシン(l.)ダイズ) は重要な作物を遺伝学的、生化学的経路の研究マメ科のモデルとなっています。そのため、大豆の効率的な一過的遺伝子発現系を確立することが重要です。ダイズプロトプ ラストの準備のための単純なプロトコルと非定常の機能解析への応用を報告します。ダイズ芽ばえから若い単葉の葉が高品質のプロトプ ラストの大量に起因したと分かった。ペグ カルシウム仲介された変形方法を最適化することにより、大豆含むプロトプ ラストを用いた高い変換効率を達成しました。このシステムは、ライブ ダイズ細胞における複雑な規制とシグナル伝達メカニズムの検討の効率的かつ汎用性の高いモデルを提供し、ヘルプは、マメ科植物の多様な細胞・発達・生理学的なプロセスを理解するかもしれない。

プロトプ ラストの調製 (図 1) を 10 日間の古い大豆のさまざまな器官を調べた (図 2) 顕微鏡下では認められなかった.胚軸, 上胚軸から細胞壁がほとんど消化して、そしていくつかの細胞 (図 2 b, 2 C) 互いに接続されています。子葉 (図 2 D) とルート (図 2 a) は、細胞壁は細胞のごく一部でのみ削除されました。対照的に、多数プロトプ ラストの含むの頃にみ (図 2 eG) を使用します。発達段階別に単葉の葉はさらに調べた (図 2 H).展開されていないとだけ拡張含...

我々 は生きているセルで複雑な規制とシグナル伝達メカニズムを研究するダイズプロトプ ラストの大量の準備のためシンプルで効率的なプロトコルを開発しました。

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

この方法の全体的な目標は、ダイズから高品質のプロトプラスト細胞を取得し、生きたダイズ細胞の制御およびシグナル伝達メカニズムを調べることです。この方法は、直接の標的遺伝子が何であるか、輸血因子を開くか、相互作用するパートナーが何であるか、タンパク質を開くかなど、調節ネットワークにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は芸術です。均一な大豆プロトプラスト細胞を大量に生成し、シンプルで簡単です。一般的に、この方法に不慣れな人は、特定の段階でユニフォイトしない限り、大豆の葉から優れたプロトプラストを得るのが非常に難しいため、苦労するでしょう。適切な発育段階での葉の選択は、大豆プロトプラスト調製を成功させるための鍵です。生後10日の大豆の苗から新しく拡大したユニフォイエートの葉を切り取ります。サンプルが高プロトプラスト収量をもたらすことを確認するために、わずかに異なる発育段階のユニフォイルの葉のサンプルを少なくとも3つ収集します。新しいかみそりの刃で、各ユニフォリの葉から中肋骨を取り除き、残りを0.5〜1ミリメートルのストリップに切ります。一対の鉗子を使用して、葉のストリップをすぐに15ミリリットルのチューブに調製したばかりの酵素溶液10ミリリットルに静かに移します。室温で15分間葉のストリップに真空浸潤します。葉片を酵素溶液中で静かに攪拌しながら、室温で4〜6時間、弱光下でインキュベートします。プロトプラストが放出されると、酵素溶液は黄緑色に変わります。酵素プロトプラスト溶液を顕微鏡で10倍の倍率で確認し、プロトプラスト分解が最適なサンプルを選択します。放出されたプロトプラストは球形をしていますが、未消化の細胞は不規則または楕円形をしています。消化を止めるには、プロトプラストの消化が良好な酵素プロトプラスト溶液10ミリリットルを50ミリリットルのチューブに静かに注ぎ、室温で10ミリリットルのW5溶液を加えます。チューブを数回静かに反転させます。次に、酵素プロトプラスト溶液を50ミリリットルのチューブの上に置いたきれいな75ミクロンのナイロンメッシュに静かに注ぎ、未消化の葉組織を取り除きます。次に、酵素プロトプラスト溶液を100倍Gで室温で1〜2分間遠心分離します。次に、10ミリリットルの血清ピペットを使用して、プロトプラストペレットを乱さずに上清を穏やかに除去します。プロトプラストを冷やしたW5溶液に再懸濁し、50ミリリットルのチューブを氷上に保ちます。顕微鏡下の血球計算盤でプロトプラスト数をカウントした後、冷却したW5溶液中で1ミリリットルあたり10〜5番目のプロトプラストの2倍の濃度に希釈します。プロトプラストを氷上に30分間置きます。懸濁液をGの100倍で室温で1〜2分間遠心分離します。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、プロトプラストペレットを乱さずにW5溶液を静かに取り出します。プロトプラストをMMG溶液に室温で再懸濁し、10の2倍から1ミリリットルあたり5番目のプロトプラストの濃度で再懸濁します。形質転換のためのプロトプラストを準備するには、ノーカットの200マイクロリットルピペットチップを使用して、1.5ミリリットルの低接着マイクロ遠心チューブに100マイクロリットルのプロトプラストアリコートを作製します。ネガティブコントロールとして機能するために、1つのアリコートを取っておきます。残りのプロトプラストのアリコートに、10マイクロリットルのプラスミドDNAを添加します。110ミリリットルの微量遠心チューブの内壁に、準備したばかりのペグ溶液を1.5マイクロリットルゆっくりと加えます。次に、溶液が均一になるまでチューブを静かに反転させ、回転させます。形質転換混合物を室温で15分間インキュベートします。形質転換を止めるには、室温で各1.5ミリリットルのチューブに400マイクロリットルのW5溶液をゆっくりと加え、溶液が均一になるまでチューブを静かに反転させます。チューブをGの100倍で室温で1〜2分間遠心分離します。上清を捨てます。各チューブに1ミリリットルのWI溶液を追加します。6ウェル組織培養プレートのウェル表面をコーティングして、プロトプラストがプレートに付着するのを防ぎます。各ウェルに1ミリリットルの5%滅菌子牛血清を加え、数秒後にピペットを使用して子牛血清を取り出します。再懸濁したプロトプラストを培養プレートのウェルに移し、プレートを蓋で覆います。収穫する前に、プロトプラストを室温で2日間暗所でインキュベートします。2日後、プロトプラスト溶液を1.5ミリリットルの低接着性微量遠心チューブに移します。チューブをGの100倍で室温で1〜2分間遠心分離します。ピペットを使用して上清を取り除きます。10マイクロリットルのプロトプラストをスライドガラスに移します。蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡下で、非形質転換プロトプラストをネガティブコントロールとして使用して蛍光シグナルを観察します。プロトプラスト細胞は、10日齢の大豆の異なる器官から調製され、顕微鏡下で観察されました。hypocaudalおよびepicaudalからの細胞壁はほとんど消化されませんでした。そして、一部の細胞は互いにくっついたままでした。尾側鉛と根では、細胞壁は細胞のごく一部でのみ除去されました。対照的に、ユニフォリエートを用いた場合、多数のプロトプラストが観察されました。この写真の苗木は、左から右に、拡大していない、拡大したばかり、または完全に拡大したユニフォイトの葉を示しています。拡大していないユニフォリエートの葉と拡大したばかりのユニフォイエートの葉の両方がプロトプラストの収量を多くもたらしましたが、拡大したばかりのユニフォイルのプロトプラストのサイズは、拡大していないユニフォリエートよりも均一でした。完全に拡張したユニフォリエートの場合、細胞壁はほとんどの細胞でまだ無傷でした。さまざまな量のプラスミドDNAを試験した結果、DNAの量が多いほど形質転換効率が高いことが示唆されました。マメ科植物特異的E1遺伝子に融合したGFPを発現するコンストラクトで形質転換したダイズプロトプラストの共焦点画像は、シロイヌナズナプロトプラスト系を使用した以前の研究と一致するE1 GFP融合タンパク質の核局在を示しました。この手順を試行する際には、葉の適切なステージの選択、細胞壁の消化時間の長さ、濃度の年齢、形質転換のためのプラスミドDNAの量など、各実験条件を経験的に最適化することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、RNAやタンパク質の複製などの他の方法を実行して、どの遺伝子やどのタンパク質が制御されているか、または制御されていないかなどの追加の質問に答えることができますか?このビデオを見た後、高品質のソイブリアンプロトプラスト細胞を取得する方法をよく理解しているはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、シロイヌナズナの14日齢の実生の組織から無傷のプロトプラストを単離するための手順を示しています。分離されたプロトプラストは、少なくとも96時間のためにそのまま残るし、代わりに一ヶ月の成熟植物の苗から分離されていることを考えると、この手順は、無傷プロトプラストを必要とするアッセイを迅速に処理されます。...

の14日齢の苗の組織からのプロトプラストの単離シロイヌナズナ</em

我々は、導入、トラッキングおよび植物細胞におけるGFP発現の定量分析法を報告する。このメソッドは、時間の経過とともに、大量のサンプルから半連続画像コレクションのためにカスタム設計されたロボットのシステムを利用しています。我々はまた、画像系列の分析のためのImageJのとImageReadyの使用方法を示しています。...

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究​​のための動的画像解析

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でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

植物は現在の式のパラダイムより、スケーラブルでコスト効率の高い、安全である商業規模で医薬品タンパク質の生産のための新たなシステムを提供しています。本研究では、我々を含む、標的遺伝子を導入するための簡単​​で便利な、まだスケーラブルなアプローチを報告...

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既存の植物改変の方法は適用性が限られています。ここで提案されている新しいペプチド由来の技術は、無傷の植物の目的の細胞内コンパートメントへの外因性タンパク質または遺伝子の導入における簡便性と効率性の両方を約束します。...

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学ぶ 大豆プロトプラストの簡便な調製法と一過的遺伝子発現解析への応用。適切な発育段階の葉を用いることで、大量の均一なプロトプラストを得られ、植物細胞の制御メカニズムやシグナル伝達を研究できます。

簡便な分離大豆プロトプラストと一過的遺伝子発現解析への応用

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