簡便な分離大豆プロトプ ラストと一過的遺伝子発現解析への応用

我々 は生きているセルで複雑な規制とシグナル伝達メカニズムを研究するダイズプロトプ ラストの大量の準備のためシンプルで効率的なプロトコルを開発しました。

この方法の全体的な目標は、ダイズから高品質のプロトプラスト細胞を取得し、生きたダイズ細胞の制御およびシグナル伝達メカニズムを調べることです。この方法は、直接の標的遺伝子が何であるか、輸血因子を開くか、相互作用するパートナーが何であるか、タンパク質を開くかなど、調節ネットワークにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は芸術です。

均一な大豆プロトプラスト細胞を大量に生成し、シンプルで簡単です。一般的に、この方法に不慣れな人は、特定の段階でユニフォイトしない限り、大豆の葉から優れたプロトプラストを得るのが非常に難しいため、苦労するでしょう。適切な発育段階での葉の選択は、大豆プロトプラスト調製を成功させるための鍵です。

生後10日の大豆の苗から新しく拡大したユニフォイエートの葉を切り取ります。サンプルが高プロトプラスト収量をもたらすことを確認するために、わずかに異なる発育段階のユニフォイルの葉のサンプルを少なくとも3つ収集します。新しいかみそりの刃で、各ユニフォリの葉から中肋骨を取り除き、残りを0.5〜1ミリメートルのストリップに切ります。

一対の鉗子を使用して、葉のストリップをすぐに15ミリリットルのチューブに調製したばかりの酵素溶液10ミリリットルに静かに移します。室温で15分間葉のストリップに真空浸潤します。葉片を酵素溶液中で静かに攪拌しながら、室温で4〜6時間、弱光下でインキュベー

プロトプラストが放出されると、酵素溶液は黄緑色に変わります。酵素プロトプラスト溶液を顕微鏡で10倍の倍率で確認し、プロトプラスト分解が最適なサンプルを選択します。放出されたプロトプラストは球形をしていますが、未消化の細胞は不規則または楕円形をしています。

消化を止めるには、プロトプラストの消化が良好な酵素プロトプラスト溶液10ミリリットルを50ミリリットルのチューブに静かに注ぎ、室温で10ミリリットルのW5溶液を加えます。チューブを数回静かに反転させます。次に、酵素プロトプラスト溶液を50ミリリットルのチューブの上に置いたきれいな75ミクロンのナイロンメッシュに静かに注ぎ、未消化の葉組織を取り除きます。

次に、酵素プロトプラスト溶液を100倍Gで室温で1〜2分間遠心分離します。次に、10ミリリットルの血清ピペットを使用して、プロトプラストペレットを乱さずに上清を穏やかに除去します。プロトプラストを冷やしたW5溶液に再懸濁し、50ミリリットルのチューブを氷上に保ちます。

顕微鏡下の血球計算盤でプロトプラスト数をカウントした後、冷却したW5溶液中で1ミリリットルあたり10〜5番目のプロトプラストの2倍の濃度に希釈します。プロトプラストを氷上に30分間置きます。懸濁液をGの100倍で室温で1〜2分間遠心分離します。

次に、1ミリリットルのピペットを使用して、プロトプラストペレットを乱さずにW5溶液を静かに取り出します。プロトプラストをMMG溶液に室温で再懸濁し、10の2倍から1ミリリットルあたり5番目のプロトプラストの濃度で再懸濁します。形質転換のためのプロトプラストを準備するには、ノーカットの200マイクロリットルピペットチップを使用して、1.5ミリリットルの低接着マイクロ遠心チューブに100マイクロリットルのプロトプラストアリコートを作製します。

ネガティブコントロールとして機能するために、1つのアリコートを取っておきます。残りのプロトプラストのアリコートに、10マイクロリットルのプラスミドDNAを添加します。110ミリリットルの微量遠心チューブの内壁に、準備したばかりのペグ溶液を1.5マイクロリットルゆっくりと加えます。

次に、溶液が均一になるまでチューブを静かに反転させ、回転させます。形質転換混合物を室温で15分間インキュベートします。形質転換を止めるには、室温で各1.5ミリリットルのチューブに400マイクロリットルのW5溶液をゆっくりと加え、溶液が均一になるまでチューブを静かに反転させます。

チューブをGの100倍で室温で1〜2分間遠心分離します。上清を捨てます。各チューブに1ミリリットルのWI溶液を追加します。

6ウェル組織培養プレートのウェル表面をコーティングして、プロトプラストがプレートに付着するのを防ぎます。各ウェルに1ミリリットルの5%滅菌子牛血清を加え、数秒後にピペットを使用して子牛血清を取り出します。再懸濁したプロトプラストを培養プレートのウェルに移し、プレートを蓋で覆います。

収穫する前に、プロトプラストを室温で2日間暗所でインキュベートします。2日後、プロトプラスト溶液を1.5ミリリットルの低接着性微量遠心チューブに移します。チューブをGの100倍で室温で1〜2分間遠心分離します。

ピペットを使用して上清を取り除きます。10マイクロリットルのプロトプラストをスライドガラスに移します。蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡下で、非形質転換プロトプラストをネガティブコントロールとして使用して蛍光シグナルを観察します。

プロトプラスト細胞は、10日齢の大豆の異なる器官から調製され、顕微鏡下で観察されました。hypocaudalおよびepicaudalからの細胞壁はほとんど消化されませんでした。そして、一部の細胞は互いにくっついたままでした。

尾側鉛と根では、細胞壁は細胞のごく一部でのみ除去されました。対照的に、ユニフォリエートを用いた場合、多数のプロトプラストが観察されました。この写真の苗木は、左から右に、拡大していない、拡大したばかり、または完全に拡大したユニフォイトの葉を示しています。

拡大していないユニフォリエートの葉と拡大したばかりのユニフォイエートの葉の両方がプロトプラストの収量を多くもたらしましたが、拡大したばかりのユニフォイルのプロトプラストのサイズは、拡大していないユニフォリエートよりも均一でした。完全に拡張したユニフォリエートの場合、細胞壁はほとんどの細胞でまだ無傷でした。さまざまな量のプラスミドDNAを試験した結果、DNAの量が多いほど形質転換効率が高いことが示唆されました。

マメ科植物特異的E1遺伝子に融合したGFPを発現するコンストラクトで形質転換したダイズプロトプラストの共焦点画像は、シロイヌナズナプロトプラスト系を使用した以前の研究と一致するE1 GFP融合タンパク質の核局在を示しました。この手順を試行する際には、葉の適切なステージの選択、細胞壁の消化時間の長さ、濃度の年齢、形質転換のためのプラスミドDNAの量など、各実験条件を経験的に最適化することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、RNAやタンパク質の複製などの他の方法を実行して、どの遺伝子やどのタンパク質が制御されているか、または制御されていないかなどの追加の質問に答えることができますか?

このビデオを見た後、高品質のソイブリアンプロトプラスト細胞を取得する方法をよく理解しているはずです。