遺伝子改変マウスモデルにおける前立腺癌のモデリング:マウス前立腺葉細胞におけるCRISPR/Cas9媒介局所遺伝子編集技術

強力な上流プロモーターによってCas9エンドヌクレアーゼと緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するように操作されたゲノムを持つ、麻酔および調製されたCRISPR/Cas9ノックインマウスモデルから始めます。プロモーターのすぐ下流に挿入されたフロックスSTOPカセットまたはLSLは、通常の条件下でCas9およびGFP転写をブロックします。

マウスの腹壁を切開して、精嚢に付着した前立腺葉を露出させます。所望のアデノウイルス懸濁液を前葉に注入して、細胞への標的ウイルスゲノム送達を促進します。前立腺葉を腹腔内に戻し、切開部を縫合します。

ウイルスに感染した細胞内では、ウイルスゲノムは変異する遺伝子を標的とするCreリコンビナーゼ酵素とガイドRNAを発現します。Cre酵素はLSLカセットを認識し、floxed転写遮断薬を切除します。このステップにより、プロモーターはCas9エンドヌクレアーゼとGFPの発現を駆動できます。

その後、Cas9エンドヌクレアーゼは、ウイルスがコードするガイドRNAと複合体を形成し、これらの複合体を変異する遺伝子内の標的配列に誘導します。この局在化により、Cas9エンドヌクレアーゼが標的遺伝子内のゲノムDNAを切断し、遺伝的変化を引き起こします。

発癌性の変化により、変異した細胞が癌化します。変異細胞内での GFP レポータータンパク質の共発現は、がんの進行の同定と追跡を容易

ウイルスを前立腺に送達するには、テキストプロトコルに従って生後8週間の雄マウスを麻酔した後、筋弛緩、ペダル引き抜き、および眼瞼反射を評価して麻酔の深さを調べます。反射神経の喪失が観察されたら、動物の下腹部を剃ります。眼球乾燥症による失明を防ぐために、滅菌綿棒を使用して動物の目を動物用眼科軟膏で慎重に覆います。次に、70%エタノールと10%ポビドンヨードを使用して、剃った腹部を拭き、手術部位を消毒します。

次に、滅菌手術用ハサミを使用して、腹部正中線下部に約1センチメートルの垂直皮膚切開を行います。次に、細い先端鉗子で腹膜を持ち上げて、その下にある臓器を傷つけないようにし、手術用ハサミを使って腹膜を8mm以下で丁寧に切開します。脂肪組織をそっと脇に動かして精嚢を明らかにします。次に、リング状鉗子を使用して、前前立腺が特定できるまで精嚢を慎重に持ち上げます。

次に、0.5ミリリットルのインスリン注射器と30G x 8ミリメートルの針を使用して、総量30マイクロリットルのウイルス溶液を前立腺上皮に注入します。漏れを最小限に抑え、液体が組織内で吸収され、小さな気泡が形成されるようにします。次に、精嚢を腹腔内に戻します。

体液が小さな気泡で組織内に吸収され、漏れないようにするには、精嚢と平行に前立腺葉の形状に従って

テーパーポイント針と13ミリメートルの3/8円を使用して、6-0吸収性縫合糸の2〜3つの単純な断続ステッチで腹膜を縫合します。次に、腹膜の損傷を避けるために鉗子で皮膚を持ち上げ、3つの滅菌4.8 x 6.5ミリメートルクリップで皮膚をホッチキスで

手術後の回復を良くするために、滅菌された 1 ミリリットルの注射器と 27G x 1/2 インチの針を使用して、腹腔内注射により体重 1 グラムあたり 0.1 ミリリットルの用量で麻酔解毒剤を投与します。次に、動物を慎重にケージに戻します。

• CRISPR/Cas9 knock-in mouse model - Genetically engineered rodent model used for research purposes involving the CRISPR/Cas9 genome editing system.
• Lsl cassette - A genetic construct used to block transcription under certain conditions.
• Cas9 endonucleases - Enzymes expressed by the Cas9 gene, used in CRISPR for cutting DNA at desired locations.
• Green Fluorescent Proteins (GFPs) - Proteins that glow green under specific light; used as a marker in biological research.
• Prostate Cancer Model - A mouse model designed for prostate cancer studies.

• Introduce CRISPR/Cas9 knock-in mouse model – Define and contextualize the genetically engineered rodent model utilized for genome editing research (e.g., mouse models of prostate cancer).
• Key Concepts – Summarize principles of genetic editing using concepts like lsl-cassette, Cas9 endonucleases, and GFPs (e.g., targeted viral genome delivery).
• Underlying Mechanisms – Briefly describe the process of creating a genetic mutation (e.g., Cre recombinase enzymes and guide-RNA).
• Connect to Experiment – Discuss the importance of these processes in creating prostate cancer mouse models, demonstrating genetic alteration and cancer progression.

• What is the CRISPR/Cas9 knock-in mouse model and how does it assist in genetic research?
• How does the incorporation of GFPs help in tracing cancer progression?
• What is the role of Cas9 endonucleases in the genetic mutation process?

• Practical Applications – Discuss real-world use cases of these techniques in genetic research and cancer study (e.g., prostate cancer research).
• Industry Impact – Identify research sectors benefiting from mouse models, including genome science, biotechnology, and healthcare (e.g., CRISPR technology).
• Societal Importance – Emphasize the wider benefits of this technology, in aiding our understanding of diseases and therapies (e.g., cancer research).
• Link to Scientific Advancements – Discuss the significant breakthroughs these models have led to in scientific research.