Name: CRISPRコンカテマーを用いたマウス小腸オルガノイドにおける複数の遺伝子ノックアウトのためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 学ぶ CRISPRコンカテマーベクターを用いた複数gRNAのクローニングとマウス小腸オルガノイドへの電気穿孔法による複数遺伝子ノックアウトの効率的な手法。この方法は機能喪失研究の効率を大幅に向上させます。

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私たちは、原稿の批判的な読み方についてクリストファー・ヒンドレーに感謝します。 AMは、Wntsapp（Marie Curie ITN）、AA-Rによってサポートされています。メディカルリサーチカウンシル（MRC）とBK.Kによってサポートされています。 Wellcome TrustとRoyal Society [101241 / Z / 13 / Z]のSir Henry Dale Fellowshipによってサポートされ、Wellcome TrustとMRCからWellcome Trust - MRC Cambridge Stem Cell Institute 。

<html> 1. CRISPR-コンカテマーベクターのためのgRNA設計注：このセクションの目的は、最適なターゲティング戦略を選択する方法、およびCRISPRコンカテマーベクターの特定のオーバーハングを含むgRNAを設計する方法を説明することです。 <ol><li>選択したCRISPR gRNA設計ツールを使用して目的の遺伝子に対するgRNAを設計する。例については表の表を参照してください。 注：1組のパラロガス遺伝子を標的とする場合、1遺伝子につき1つのgRNAを設計することは可能ですが、遺伝子ごとに2つのgRNAを設計してダブルノックアウトを達成する可能性を高めることが推奨されます （ 図1 ）。 </li><li>制限地図作成ツールを使用してgRNAにBbs I認識部位が含まれていないことを確認します（例の表を参照）。 </li><li> 表1に示すように、各オリゴに特異的CRISPR-コンカテマーベクターオーバーハングを付加する。 </li></ol>&quot;fo：keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;fo：keep-with-next.within-page =&quot; <tbody><tr><td></td><td> カセット1 </td><td> カセット2 </td><td> カセット3 </td><td> カセット4 </td></tr><tr><td> 配列（5&#39;-3 &#39;） </td><td> CACCGG [gRNA1] GT </td><td> ACCGG [gRNA2] G </td><td> CCGG [gRNA3] </td><td> ACACCGG [gRNA4] GTT </td></tr><tr><td> 配列（5&#39;-3 &#39;） </td><td> TAAAAC [RC-gRNA1] CC </td><td> AAAAC [RC-gRNA2] C </td><td> AAAC [RC-gRNA3] </td><td> CTAAAAC [RC-gRNA4] CCG </td></tr></tbody></table> 表1：CRISPRコンカテマーベクターの各カセットのオーバーハング。 2.CRISPR-コンカテマーベクターへのgRNAのクローニング<ol><li> オリゴのリン酸化およびアニーリング 注：この手順は、どのようにto各gRNAオリゴのトップストランドおよびボトムストランドをアニールする方法、および単一の反応でそれらの末端をリン酸化する方法。 <ol><li>以下の手順に従って、オリゴをリン酸化し、氷上で上鎖および下鎖を​​アニーリングするための反応混合物を調製する。 注：すべてのオリゴを1つの反応にプールすることができます。例えば、4gRNAコンカテマーベクターの場合、8オリゴを一緒にプールする。 </li><li> 3つのコンカテマーについて、3.0μLのgRNAトップ鎖（各gRNAから1.0μL、10μM、1μL/ gRNA）、3.0μLのgRNAボトム鎖（各gRNAから1.0μL;10μM、1μL/ gRNA）、2.0μLのT4 DNAリガーゼ緩衝液（10×）、1.0μLのT4 PNK、および総容量20.0μLまでH 2 Oを加える。 </li><li>ピペットでよく混合し、以下の設定を使用してサーモサイクラーでこれを実行します：37℃で30分間、95℃で5分間、25℃で0.3℃/分で下降、4℃で保持。 </li></ol></li><li> Bbs私はシャッフル反応 注：このセクションでは、プレアニーリングされたgRNAオリゴは、消化とライゲーションのサイクルを交互に繰り返すことによって、コンカテマーベクターの適切な位置に1ステップで取り込まれます。 <ol><li> DNase / RNaseを含まない水で1：100の反応液を希釈して、3および4gRNAコンカテマーベクターを作製する。 注：2 gRNAコンカテマーをクローニングする場合、このステップは必要ありません 。 </li><li>以下の手順に従って、氷上で反応をシャフリングするBbsを組み立てます。ベクターのみを含むネガティブコントロールを含めます。 </li><li> 100μgのCRISPRコンカテマーベクター、10.0μLのオリゴ混合物、1.0μLのBSA含有制限酵素緩衝液（10倍）、 1.0μLDTT （10mM）、 1.0μLATP （10mM）、 1.0μLBbs I、 1.0μLT7リガーゼ、およびH 2 Oを総量20.0μLまで含む。 </li><li>ピペット操作でよく混合し、以下の設定を使用してサーモサイクラーでこれを実行する：3および4gRNA-コンカテマーをクローニングするために50サイクルを実行し、 <s37℃で5分間、21℃で5分間、37℃で15分間、次いで4℃で永久に保持する、2gRNA-コンカテマーについて25サイクル以上。 </li></ol></li><li> エキソヌクレアーゼ処理 注：線状化したDNAの痕跡を取り除いてクローニングの効率を上げるため、この手順を強くお勧めします。 <ol><li>次のように、 Bbs Iシャフリング反応をDNAエキソヌクレアーゼ（ 表の表を参照）で処理する。 </li><li>前のステップ（2.2.3）から11.0μLのライゲーションミックスを取り出し、1.5μLのエキソヌクレアーゼ緩衝液（10×）、1.5μLのATP（10mM）、1.0μLのDNAエキソヌクレアーゼを添加し、総容量を水で15.0μLにする。 37℃で30分間インキュベートし、続いて70℃で30分間インキュベートする。 注：このステップでは、混合物中の残留線状化DNAが除去され、クローニング効率が向上します。 </li><li> 2μLの反応混合物を用いて化学的に変換する熱ショックによるテント大腸菌 12 。 注：あるいは、-20℃で最大1週間反応を保存することができます。 </li></ol></li><li> 制限消化 注：この手順の目的は、制限消化によってクローニング手順の成功を評価することです。 <ol><li> CRISPR-コンカテマーベクター中のgRNAインサートの存在を確認するために、接種ループを有する4〜8個の細菌コロニーを選択し、4mLのLB培地中で37℃で一晩オービタルシェーカーで各クローンを増殖させる。製造業者の指示に従ってプラスミドミニプレップキットを用いてDNAを抽出する（ 表の表を参照）。 </li><li>細菌インキュベーター内で37℃で3時間インキュベートすることにより、10μLの反応液中に10UのEcoRI + 5UのBglIIを含む200ngのDNAを消化する。サイズ比較のための陽性対照として対応する元のベクターと別の反応混合物を含める。 注：ティこれらの2つの制限酵素が全コンカテマーを排出するため、すべてのコンカテマーが存在するかどうかを確認する。これらは、各コンカテマーの予想されるサイズであり、2gRNAコンカテマー（800bp）、3gRNAコンカテマー（1.2kbp）、および4gRNAコンカテマー（1.6kbp）である。 </li><li> 1％アガロースゲル上で90Vで約20分間消化反応を行う。 </li><li> UVトランスイルミネーターを使用してゲルを視覚化する。正確な挿入サイズのクローンを、そのバンドパターンが元のベクターのものと一致すること、およびDNAラダーを使用して各フラグメントが予想されるサイズを有することを確認することによって同定する。 </li><li>選択したクローンを5U Bbs Iで37℃で3時間、細菌インキュベーターで消化します。対照として対応する元のベクターと別の反応混合物を含める。 注：この追加の消化ステップは、gRNAが正しい位置にクローニングされ、結果としてすべてのBbs I認識部位が失われていることを確認することです。 </li><li>消化反応を実行する1％アガロースゲル（90V、約20分間）。彼らがgRNAだけを含んでいるので、 Bbs Iによって切断されていないベクターだけを修正すると考えてください。 </li></ol></li><li> ベクターシーケンシング 注：このステップの目的は、制限消化分析によって正しいと同定されたベクター中のgRNA配列の存在を確認することである。 <ol><li>以下のプライマーを用いてSanger配列決定13により陽性コンカテマーベクターを確認する： フォワード：TCAAGCCCTTTGTACACCCTAAG（最初のgRNAカセットをチェックするため） Linker1_Forward：GACTACAAGGACGACGATGACAA（2番目のgRNAカセットをチェックするため） Linker2_Reverse：GGCGTAGTCGGGCACGTCGTAGGGGT（第2のgRNAカセットをチェックするため） Linker2_Forward：ACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCC（第3のgRNAカセットをチェックするため） Linker3_逆：TCCTCCTCTGAGATCAGCTTCTGCAT（第3のgRNAカセットをチェックするため） 逆：AGGTGGCGCGAAGGGGCCACCAAAG（最後のgRNAをチェックするため）カセット） </li><li>シークエンシングリードで配列を検索することにより、すべてのgRNAの存在を確認します。 </li></ol></li></ol> 3.エレクトロポレーションによる腸オルガノイドのトランスフェクション注：この手順は、Fujii et al 。によって発行されたプロトコルに基づいています。 2015年には、マウス小腸オルガノイド培養液14のための適応を持ちます。 <ol><li> エレクトロポレーション前 注：このセクションでは、エレクトロポレーションの前にマウスの腸オルガノイドを調製する方法について説明します。これは、エレクトロポレーションの間の起こりうる毒性作用を防止する。 <ol><li>トランスフェクション手順の0日目に、1：2の比率でオルガノイドを分割する。 注：腸のオルガノイド培養物は、以前に確立されたプロトコールに従って陰窩分離を行うことによって得ることができる15 。を参照してください<stすべてのメディア構成について表2を参照のこと。 <ol><li>電気穿孔のためにオルガノイドを分割する場合、トランスフェクション当たり48ウェルプレートの最低6ウェルを種にする。 </li><li> 20μL、基底行列滴でオルガノイドを播種し、37℃でWENR +のNIC媒体（のWnt + EGF +ノギン+ Rスポンジン+ニコチンアミド）でそれらを増殖、加湿インキュベーター中5％CO 2（としては、以前15に記載） 。 </li></ol></li><li> 2日目にWENR + Nicを抗生物質を含まないEN（EGF + Noggin）+ CHIR99021（グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3阻害剤）+ Y-27632（ROCK阻害剤）250μLに置き換えて培地を交換する（ 表2参照）。 注：すべてのステップで、48ウェルプレートの各ウェルに添加する培地の量は250μLです。 </li><li> 3日目に、オルガノイド培地を抗生物質を含まないEN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25％v / vジメチルスルホキシド（DMSO）に交換する。 </li></ol></li><li> 細胞の調製 注意：ここでは、オルガノイドを機械的および化学的解離によって小細胞クラスターに分ける方法を説明します。これらの手順は、手順の成功に不可欠です。 <ol><li> 4日目に、1mLのピペットチップを用いて基底マトリックスのドームを破壊し、オルガノイドを1.5mLチューブに移す。 48ウェルプレートの4つのウェルの内容物をチューブにプールする。 </li><li> P200ピペットで上下に約200回ピペット操作することにより、オルガノイドを小さな断片に機械的に破壊する。室温で遠心分離し、600×gで5分間遠心分離する。 </li><li>培地を除去し、ペレットを細胞培養グレードの組換えプロテアーゼ（材料表参照）1 mLに再懸濁する。 37℃で最大5分間インキュベートし、4倍の対物レンズを備えた倒立光学顕微鏡下で50μLのサンプルを点検する。 注：エレクトロポレーション後の細胞生存を増加させるので、10〜15個の細胞のクラスターが望ましい。 </li><li>細胞懸濁液を低結合15 mLチューブに移し、抗生物質を含まない9mLの基礎培地を添加することにより解離させた（ 表2参照）。室温、600xgで5分間遠心分離し、上清を捨て、ペレットを1mLの還元血清培地（ 表の表を参照）に再懸濁する。 </li><li> Bürkerのチャンバーで細胞数を数え、エレクトロポレーション反応あたり最低1 x 10 5個の細胞を使用する。還元血清培地9mLを15mLチューブに加え、室温で遠心分離し、400×gで3分間遠心分離する。 </li></ol></li><li> エレクトロポレーション 注：以下のセクションでは、エレクトロポレーションを実行し、後にオルガノイドを回復させる方法について説明します。 <ol><li>すべての上清を除去し、ペレットをエレクトロポレーション溶液で再懸濁する（ 表の表を参照）。総量10μgのDNAを細胞懸濁液に添加し、エレクトロポレーション溶液を最終容量100μLに加え、細胞DN氷上での混合物。 1：1の比でCas9発現プラスミド（ 例えば、 Addgene＃41815）と組み合わせてCRISPR-コンカテマーベクターを使用する。 注記：添加するDNAの総容量は、総反応量の10％以下である必要があります。 </li><li>トランスフェクション効率（ 例： pCMV-GFP、Addgene＃11153、または一般的なGFP発現プラスミド）を評価するために、GFPプラスミドを含む別のトランスフェクションミックスを含めます。 </li><li>細胞-DNA混合物をエレクトロポレーションキュベットに加え、エレクトロポレーターチャンバーに入れる。エレクトロポレーターの適切なボタンを押してインピーダンスを測定し、それが0.030-0.055Ωであることを確認します。 表3に示す設定に従ってエレクトロポレーションを行います。 注：インピーダンス値が許容範囲外になる場合は、キュベット内の溶液量を調整してください。 </li><li>エレクトロポレーションバッファー+ Y-27632400μLをキュベットに加え、すべてを1.5mLチューブに移す。インカバ室温で30分間インキュベートして細胞を回収し、続いてそれらを室温で3分間400xgで回転させる。 </li><li>上清を除去し、ペレットを20μL/ウェルの基底マトリックスに再懸濁する。種子は、約1×10 4〜1×10 5個の 48ウェルプレートにウェル当たり細胞およびEN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25％（v / v）のDMSO媒体を加えます。 37℃でインキュベートする。 </li><li> 5日目に、培地をEN + CHIR99021 + Y-27632に交換し、GFP発現を観察することによりトランスフェクション効率を確認する（ 図2 ）。オルガノイドを37°Cに保ち、2日後にEN + CHIR99021 + Y-27632培地を再懸濁する。 </li><li> 9日目に、培地をWENR + Nic + Y-27632に交換し、37℃でインキュベートする。 注：Y-27632は、7〜10日後（16〜19日目）に除去することができます。 </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> ポーリングパルス </strong&gt; </td><td> 転送パルス </td></tr><tr><td> 電圧 </td><td> 175V </td><td> 20V </td></tr><tr><td> パルス長 </td><td> 5ミリ秒</td><td> 50msec </td></tr><tr><td> パルス間隔 </td><td> 50msec </td><td> 50msec </td></tr><tr><td> パルス数 </td><td> 2 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 減衰率 </td><td> 10％ </td><td> 40％ </td></tr><tr><td> 極性 </td><td> + </td><td> +/- </td></tr></tbody></table> 表3：エレクトロポレーションの設定。 4.成長因子退出注：ここでは、腸オルガノイドにおけるWnt経路の負のレギュレーターをノックアウトする際に、成長因子回収実験を行う方法を例示する。 <ol><li> 10-14日後電気穿孔法を用いて、上記の手順（3.2.1-3.2.2）に従って48ウェルプレート中で1：3の比率でオルガノイドを分割する。 </li><li>オルガノイドペレットを20μLの基底膜マトリックスに再懸濁し、37℃で10分間固化させる。次に、標的遺伝子のノックアウトが達成されているかどうかを試験するために、250μLの増殖因子枯渇培地（ 例えば、 EN）をオーバーレイする。5 。 </li><li>野生型野生型（WT）対照オルガノイドおよび変異オルガノイド5、15の間の生存の差を確認するために3継代- 2の最小の成長因子欠乏条件下オルガノイドを分割します。 注：野生型オルガノイドは、2つの継代にわたって増殖因子欠乏培地で生存できないはずであるが、突然変異株は増殖できるはずである。 </li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはない。著者らは、利益相反を宣言していない。

このプロトコールでは、複数の遺伝子を同時にノックアウトするために、CRISPRコンカテマーを生成し、マウス腸オルガノイドにCRISPRコンカテマーを適用するために必要なすべてのステップを詳述します。前述のように、この戦略には、スピード、高効率、コスト効率などのいくつかの利点があります。 手順全体を首尾よく行うためには、考慮すべき重要な側面がいくつかあります。第1に、すべてのgRNAオリゴが適切にアニーリングされ、リン酸化されていることが必須であり、それはBbs Iクローニング反応のための出発物質であり、それ自体が非常に効率的であるからである。第2に、オルガノイドをエレクトロポレーションすると、条件ごとに細胞が多く使用されるほど、トランスフェクション効率が最大に高くなります。さらに、細胞解離後、小さな細胞クラスターが単一細胞より優勢であることも重要である。 それにもかかわらず、技術的な問題に遭遇する可能性があります最初にクローニングまたはトランスフェクションのいずれかを試みるときはレム（lems） gRNAのクローニング中に問題が発生した場合は、gRNAオリゴ配列を再度確認し、正確であれば、制限消化スクリーニング用に追加の細菌コロニーを選択することをお勧めします。トランスフェクション効率および細胞生存率がエレクトロポレーション後に低い場合、条件ごとにより多くの細胞を使用し、細胞解離の時間を3分に短縮することを推奨します。 CRISPRコンカテマーの生成は比較的安価で容易であるが、オルガノイド培養に関連するコストおよびその労働集約的性質によってスケールが制限されるので、オルガノイドにおいてより大きなスケールの遺伝子スクリーニングを行うことはできない。この場合、CRISPR-コンカテマー法は、HEK293およびマウス胚性幹細胞などの細胞系とも適合性があることに言及することは重要である。 セルラーシステムにかかわらず、このsの別の潜在的な欠点3つまたは4つの異なる遺伝子を同時にノックアウトすることを目指すと、怒りを感じることがあります。例えば、各gRNAは異なるターゲティング効率を有するであろうし、同時に全ての遺伝子をヒットする変化は比較的低くてもよい。この理由から、コンカテマーシステムを用いて同じ遺伝子に対して複数のgRNAを指向させることが望ましい。 同様にゴールデンゲートシャッフリングに基づく代替戦略は、多重gRNAベクトル7、8を生成するために、長年にわたって提案されてきました。しかし、我々の方法では、複数回のgRNAを1回のクローニングで単一のレトロウイルスベクターに直接組み立てることが可能であり、これにより、パラログを標的とするためのgRNAライブラリを生成するのに適している。 当社のCRISPRコンカテマーは、MSCVレトロウイルスベクターのバックボーンに組み込まれています。したがって、gRNAコンカテマー含有レトロウイルスは、過剰発現する安定な細胞株を生成するために使用され得るgRNAを分解する。 Cas9誘導性の系と組み合わせると、我々の系を用いて誘導性のパラログノックアウトを行うことができる。 要約すると、ここでは、最大4つの異なるgRNAを同じベクターに1ステップでクローン化する方法と、高いトランスフェクション効率でオルガノイド培養にこの戦略を適用する方法について説明します。さらに、私たちは、手順全体を通して成功のチャンスを最大にするために有用な提案を提供します。

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Erratum: A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

逆遺伝学アプローチは、遺伝子の機能を調べるために広く用いられている方法である。特に、遺伝子の破壊が表現型変化を引き起こす機能喪失研究は、生物学的プロセスの理解を構築する上で重要な役割を果たす。 CRISPR / Cas9法は、ゲノム工学技術における最新の進歩を表し、細胞および生物における現在の遺伝学の実践に革命をもたらしました。 Cas9は、gRNAに相補的な特定のDNA配列に結合し、二本鎖切断（DSB）を生じるRNA誘導エンドヌクレアーゼである。このDSBは、相同組換えのためのDNA鋳型の非存在下で切断されたDNA鎖を誤りがちな非相同末端結合を介して再連結するDNA修復機構を採用し、その結果、ヌクレオチドの挿入または欠失が生じ、フレームシフト突然変異を引き起こす1 。 CRISPR / Cas9 apprの大きな容易性と多様性oachは、未知の遺伝子機能2、3の解明を目的としたゲノムスケールノックアウトスクリーンのため非常に魅力的なツールになりました。それにもかかわらず、冗長機能を有する複数のパラログが存在する場合、単一遺伝子ノックアウト手法は限られた用途に過ぎない。したがって、1つの遺伝子をアブレーションすることは、パラログによる可能性のある報酬を与えられた場合、その遺伝子の機能を決定するには不十分であり、表現型の変化がほとんどまたは全くない4 。したがって、遺伝的補償の影響を克服するために、異なるパラロガス遺伝子を標的とする複数のgRNAベクターを送達することによってパラログを同時にノックアウトすることが重要である。 CRISPR / Cas9のパラロガス遺伝子ノックアウトへの使用を拡大するために、我々は最近、最大4つのプレアニーリングされたgRNAを単一のレトロウイルスベクターにクローニングする迅速なワンステップクローニング法を開発した5 。 CRISPRコンカテマーと名づけられたバックボーンは、反復性のgRNA発現カセットを含むMSCVレトロウイルスプラスミド上に置いた。各カセットには、Type IIS制限酵素Bbs Iの2つの逆位認識部位が含まれています。これは、単管6でゴールデンゲートシャフリング反応を使用してオーバーハングが一致するアニーリングされたgRNAオリゴで不可逆的に置き換えられます。このクローニング方法は、消化および連結の反復サイクルからなり、 Bbs Iによって生成された異なるオーバーハング配列を利用することにより、複数のDNAフラグメントの同時アセンブリを可能にする。この酵素の一意性は、例えば、その認識外で非対称切断を行う能力シーケンス;したがって、各カセットは、 Bbs Iコア部位に隣接するカスタマイズされたオーバーハングを有する異なる配列を有することができ、このようにして、各gRNAをコンカテマーベクターの特定の位置および配向にクローニングすることができる。 原則の証明として、我々はこの戦略の使用をマウスエレクトロポ5の一周で同時にWnt経路のパラロガス負の調節因子の二対を破壊することによって腸のオルガノイド。 過去数年の間、多くの他のグループは、ヒト細胞株8、9、ゼブラフィッシュ10及び大腸菌（Escherichia coli）などの様々なモデル系、多遺伝子ノックアウトを達成するために7をシャッフルゴールデンゲートを用いて構成された多重gRNA発現ベクターに基づく同様の戦略を開発しました11 。それらのプロトコルでは、gRNAを最初に個々の中間ベクターにクローン化し、次いで一緒に組み立てて1つの最終産物にする。対照的に、CRISPRコンカテマー戦略の主な利点は、単一のBbs Iシャフリングクローニングステップの利便性です。他のgRNAコンカテマーと同様に、本発明者らの方法は、最大4つの同時ノックアウト異なる遺伝子または複数のgRNAを有する1つまたは2つの遺伝子の標的化後のCRISPRノックアウト効率の増加（ 図1 ）。 このプロトコールでは、gRNA設計からゴールデンゲート反応まで、そして成功したクローニングの確認まで、CRISPRコンカテマーベクターの生成におけるすべてのステップを詳細に記述する。我々はまた、エレクトロポレーションおよびその後の成長因子回収実験によって、CRISPRコンカテマーのマウス小腸オルガノイドへのトランスフェクションのための非常に効率的なプロトコールを提供する。

<table><tbody><tr><td>最適化されたCRISPRデザインツール</td><td>Feng Zhangグループ</td><td></td><td>CRISPR gRNAデザインツール; http://crispr.mit.edu/</td></tr> <tr><td>Webcutter 2.0</td><td></td><td></td><td>制限マッピングツール; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/</td></tr> <tr><td>T4 PNK (ポリヌクレオチドキナーゼ)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼバッファー</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T7 DNAリガーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0318L</td><td></td></tr><tr><td>DTT (ジチオスレイトール)</td><td>プロメガ</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>ATP (アデノシン三リン酸)</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest BbsI (BpiI)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>FD1014</td><td></td></tr><tr><td>タンゴバッファー (BSA含有制限酵素バッファー)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>BY5</td><td></td></tr><tr><td>BglII</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0144</td><td></td></tr>エコ<tr><td>リ</td>ニュー<td>イングランドバイオラボ</td><td>R0101</td><td></td></tr>プラス<tr><td>ミドセーフエキソヌクレアーゼ</td><td>カンビオ</td><td>E3101K</td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td>応用<td>バイオシステム</td><td></td>4359659 <td></td></tr><tr><td>10G有能な大腸菌細菌</td>ケン<td>ブリッジバイオサイエンス</td><td>60108-1</td><td></td></tr><tr><td>プラスミドミニキット</td><td>Qiagen</td><td>12125</td><td></td></tr><tr><td>卓上型微量遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td>UY-02580-01</td><td></td></tr><tr><td>接種ループ</td><td>Microspec</td><td>PLS5</td><td></td></tr><tr><td>バクテリアインキュベーター</td><td>三洋電</td>機<td>MIR-262</td><td></td></tr><tr><td>ルリア・ベルタニブロス (LB)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>L3522</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>・シグマ・アルドリッチ</td><td>A4718</td><td></td></tr><tr><td>アガロースゲル電気泳動装置</td><td>Bioneer</td><td>A-7020</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12(細胞培養培地)</td><td>Invitrogen</td><td>12634-034</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (L-Glutamine) 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M (緩衝剤)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement (Neuronal cellserum-free supplement) 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>n-Acetylcysteine 500 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Mouse EGF 500 &micro;g/mL</td><td>Invitrogen Biosource</td><td>PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>マウス Noggin 100 &micro;g/mL</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド 1 M</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin 馴染培地</td> n.a.n.a.HEK293 <td></td><td></td><td>細胞から社内で生産、詳細は Sato and Clevers 2013</td></tr><tr><td>Wnt 馴染培地</td><td>n.a.n.a.HEK293</td><td></td> <td>細胞から社内で生産、詳細は Sato and Clevers 2013</td></tr><tr><td>Y-27632 10 &micro;M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Standard BD Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>48-well Plate</td><td>Greiner Bio One</td><td>677980</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3734-1MG</td><td></td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Cell Guidance Systems</td><td>SM39-10</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (recombinant protease)</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (reduced serum medium )</td><td>Life technologies</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット 2 mm ギャップ</td><td>NepaGene</td><td>EC-002S</td><td></td></tr><tr><td>低結合 15 mL チューブ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>B&uuml;rker'チャンバー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR719520-1EA</td><td></td></tr><tr><td>NEPA21 スーパーエレクトロポレーター</td><td>NepaGene</td><td>コンタクトサプライヤー</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質 LoBind チューブ 低結合</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10708704</td><td></td></tr><tr><td>BTXpress エレクトロポレーションバッファー</td><td>ハーバード装置</td><td>45-0805</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (ジメチルスルホキシド)</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr></tbody></table>

crisprコンカテマーを用いたマウス小腸オルガノイドにおける複数の遺伝子ノックアウトのためのプロトコル

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

CRISPR / Cas9技術は遺伝子機能を理解する上で不可欠な機能喪失研究の実現可能性とスピードを大幅に改善しました。高等真核生物では、パラロガス遺伝子は遺伝子の損失を補うことによって潜在的な表現型を隠蔽することができ、単一の遺伝子ノックアウトに依存する遺伝子研究から得られる情報を制限する。我々は、マウス小腸オルガノイドの一回トランスフェクション後にマルチ遺伝子ノックアウトを作製するために、ガイドRNA（gRNA）コンカテマーの新規な迅速なクローニング法を開発した。我々の戦略は、アニーリングされたgRNAオリゴとあらかじめ設計されたレトロウイルスベクターとのゴールデンゲートシャフリング反応を1回実行することにより、最大4つの個々のgRNAを単一のベクターにコンカテマー化することができます。これにより、最大4つの異なる遺伝子の同時ノックアウト、または複数のgRNAによる1つの遺伝子の標的化後のノックアウト効率の増加が可能になる。このプロトコルでは、詳細を示しますどのようにして複数のgRNAをレトロウイルスCRISPRコンカテマーベクターに効率的にクローン化するか、そしてどのように腸オルガノイドにおいて非常に効率的なエレクトロポレーションを達成するか。一例として、我々は、Wntシグナル伝達経路（Axin1 / 2およびRnf43 / Znrf3）の負の調節因子をコードする2対の遺伝子の同時ノックアウトが、腸オルガノイドを主要な成長因子の回収に耐性にすることを示す。

コンカテマーベクター中に正しい数のgRNAインサートが存在することを確認するために、全てのgRNA発現カセットに隣接する酵素（ EcoR I + Bgl II）を用いて制限消化を行う（各カセットのサイズは〜400bp、 図1 ）。例えば、4gRNAコンカテマーベクターを作製する場合、アガロースゲル中のより低いバンドの予想サイズは約1.6Kbpであり;これより低いバンドは、4つのgRNAカセットのすべてがベクターに挿入されていないことを示しています（ 図2A ）。さらに、 Bbs I認識部位がすべて失われ、酵素がベクターを切断しないことを確認することが常に推奨されます（ 図2B ）。 構築物が確認されたら、それらをエレクトロポレーションによりマウス腸オルガノイドに送達して最適化を達成することができるGFPコントロール（ 図3 ）で示されるように、1レベルのトランスフェクション効率（最大70％）を達成します。 最後に、この戦略の効率を機能的に試験するために、Cas9でトランスフェクトした腸オルガノイドおよびAxin1 / 2およびRnf43 / Znrf3に対するコンカテマーベクターをEN（R-スポンジン離脱）およびEN + IWP2（R-スポンジンおよびWnt離脱、IWP2 ：Porcupine阻害剤、2.5μM）培地で最低3継代培養した（ 図4 ）。トランスフェクトされていないWTオルガノイドは両方の条件下で死亡したが、Axin1 / 2ノックアウトオルガノイドはWnt経路の下流の活性化のために両方で生存した。さらに、Rnf43 / Znrf3変異オルガノイドは、R-スポンジンの非存在下で生存するが、IWP2の存在下では生き残ることができず、これは経路を活性化するWntの枯渇を引き起こす。まとめると、これらの観察は、これらのパラログの対のノックアウトが、t彼はオルガノイドの表現型を期待していた。これらの結果の詳細は、 Developmental Biology 5に掲載されています。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55916/55916fig1.jpg" /> 図1：4つのカセットを備えたCRISPRコンカテマーの模式図 U6プロモーター、2つの逆方向反復BbsI部位（BBとも示される）およびgRNA足場をこの順序で含む各400bpカセットを有する4つのgRNA-コンカテマーベクターのスキーム。シャッフリング反応の間、 BbsI部位は、 突き合わせに一致するgRNA断片によって置換され、結果として失われる。 gRNAオリゴの正しい挿入を確認するための配列決定プライマーの結合部位を青色矢印で示す。 Fwd =フォワードプライマー、Rev =リバースプライマー、Link 1/2/3 =リンカー領域1/2/3。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig1large.jpg" target="_blank">してください</a>この図のより大きなバージョンを見るにはここを舐めてください。 <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55916/55916fig2.jpg" /> 図2：コンカテマーベクターの代表的な消化パターン。 （ A ） EcoR IおよびBgl IIを用いた3および4gRNAコンカテマーベクターの二重消化。正確な消化パターンは緑色のダニでマークされていますが、1または2のgRNA挿入のみを持つベクターは赤い十字でマークされています。レーン1は、陽性対照として使用した4gRNA連結体親ベクターの消化を示す（「+」印）。同様に、レーン5は、3つのgRNAコンカテマー親ベクターの消化を示し、「+」で示す。 （ B ）消化されたコンカテマーベクター（緑色のダニで示される）の正しいサイズを示す、 Bbs Iによる消化。 BbsI部位を欠失したgRNA含有コンカテマーベクターの消化を陽性対照として使用するdは &quot;+&quot;でマークされます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55916/55916fig3.jpg" /> 図3：成功したElectroporated腸オルガノイドの代表的なイメージ。トランスフェクション効率を評価するには、GFPプラスミドのトランスフェクションが重要です。エレクトロポレーションの約24時間後に、少数の細胞を含むオルガノイドが既に見え、エレクトロポレーション手順が成功した場合、それらの70％までが緑色蛍光を示す。 BF =明視野、GFP =緑色蛍光タンパク質。スケールバー=2,000μm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> 図4：変異腸オルガノイドの代表的な画像。 Wnt経路Axin1およびRnf43の負の調節因子のノックアウトは、それらのパラログと一緒に、腸オルガノイドを増殖因子欠乏に対して抵抗性にする。特に、Axin1 / 2ノックアウトオルガノイド（Axin1 / 2KO）は、R-スポンジン（EN：EGF +ノギン）とWnt（EN + IWP2：EN + Porcupineインヒビター）の両方の非存在下で増殖することができるのに対して、Rnf43 / Znrf3変異オルガノイド（R＆Z KO）は、R-スポンジン（EN）の非存在下でのみ生き残ることができる。対照的に、WTオルガノイドは、対照培養条件、WENR + Nic（Wnt + EGF + Noggin + R-スポンジン+ニコチンアミド）においてのみ生存することができる。スケールバー=1,000μm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo：keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> 基礎培地 </td><td></td><td> コメント </td></tr><tr><td> 4℃で4週間保存する</td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養培地</td><td> 500 mL </td><td>材料の表を参照</td></tr><tr><td> L-グルタミン100倍</td><td> 5mL </td><td></td></tr><tr><td>緩衝剤1 M </td><td> 5mL </td><td>材料の表を参照</td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン100倍</td><td> 5mL </td><td></td></tr><tr><td> WENR + Nic（Wnt + EGF +ノギン+ R-スポンジン+ニコチンアミド） </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4℃で2週間保存する</td><td></td><td></td></tr><tr><td>基礎培地</td><td>最大50 mL </td><td></td></tr><tr><td>ニューロン細胞無血清サプリメント（50倍） </td><td> 1 mL </td><td> maの表を参照テリアール</td></tr><tr><td>ニューロン細胞無血清サプリメント（100倍） </td><td> 500μL </td><td>材料の表を参照</td></tr><tr><td> n-アセチルシステイン（500mM） </td><td> 125μL </td><td></td></tr><tr><td>マウスEGF（100μg/ mL） </td><td> 25μL </td><td></td></tr><tr><td>マウスノギン（100μg/ mL） </td><td> 50μL </td><td></td></tr><tr><td> R-スポンジン条件培地</td><td> 5mL </td><td></td></tr><tr><td> Wnt3a条件培地</td><td> 25 mL </td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド（1 M） </td><td> 250μL </td><td></td></tr><tr><td> EN + CHIR + Y-27632（EGF +ノギン+ CHIR + Y-27632） </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4℃で2週間保存する</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシンを含まない基本培地</td><td>最大20 mL </td><td></td></tr><tr><td>ニューロン細胞無血清サプリメント（50倍） </td><td> 400μL </td><td>材料の表を参照</td></tr><tr><td>ニューロン細胞無血清サプリメント（100倍） </td><td> 200μL </td><td>材料の表を参照</td></tr><tr><td> n-アセチルシステイン（500mM） </td><td> 50μL </td><td></td></tr><tr><td>マウスEGF（100μg/ mL） </td><td> 10μL </td><td></td></tr><tr><td>マウスノギン（100μg/ mL） </td><td> 20μL </td><td></td></tr><tr><td> Y-27632（10μM） </td><td> 20μL </td><td></td></tr><tr><td> CHIR99021（8μM） </td><td> 10μL </td><td></td></tr><tr><td> EN（EGF +ノギン） </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4℃で4週間保存する</td><td></td><td></td></tr><tr><td>基礎培地</td><td>最大50 mL </td><td></td></tr><tr><td>ニューロン細胞無血清サプリメント（50倍） </td><td&gt; 1 mL </td><td>材料表を参照</td></tr><tr><td>ニューロン細胞無血清サプリメント（100倍） </td><td> 500μL </td><td>材料表を参照</td></tr><tr><td> n-アセチルシステイン（500mM） </td><td> 125μL </td><td></td></tr><tr><td>マウスEGF（100μg/ mL） </td><td> 25μL </td><td></td></tr><tr><td>マウスノギン（100μg/ mL） </td><td> 50μL </td><td></td></tr></tbody></table> 表2：オルガノイド培地の組成。

このプロトコルは、CRISPR / Cas9技術を用いたマルチ遺伝子ノックアウトの作成に特に有用な、1つのガイドRNAコンカテマーベクターに複数の単一ガイドRNAをクローニングするための工程を記載する。腸オルガノイドにおける二重ノックアウトの生成は、この方法の適用可能性として示されている。

CRISPRコンカテマーを用いたマウス小腸オルガノイドにおける複数の遺伝子ノックアウトのためのプロトコル

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

本プロトコルの総合的な目的は、複数のガイドRNAを1つのCRISPRコンカテマーベクターにクローニングし、マウス腸管オルガノイドにおいて高効率なエレクトロポレーションを実現することで、複数の遺伝子の同時ノックアウトを行うことです。この手法により、並行的な代償作用による潜在的な影響を克服することが可能となり、機能喪失研究の効率を大幅に向上させることができます。当社のCRISPRコンカテマー戦略の主な利点は、クローニング工程が1回で済むという簡便さと、最大4つの異なる遺伝子を同時にノックアウトできる点にあります。 procedureのデモンストレーションは、私の研究室の博士課程学生であるAlessandra Merendaが行います。ガイドRNA（gRNA）のCRISPRコンカテマーベクターへのクローニングは、各gRNAオリゴヌクレオチドの上鎖と下鎖をアニーリングさせ、末端をリン酸化させる単一の反応から始まります。氷上で反応混合液を調製します。3つのコンカテマー分として、3 µLの上鎖gRNA、3 µLの下鎖gRNA、2 µLのT4 DNAリガーゼバッファー、1 µLのT4ポリヌクレオチドキナーゼを加え、滅菌水で全量を20 µLにします。ピペッティングで十分に混合し、以下の設定でサーモサイクラーを運転します：37 °Cで30分間、95 °Cで5分間、その後0.3 °C/minの速度で25 °Cまで降温し、4 °Cで保持します。次のステップはBbs1シャッフリング反応であり、ここで、あらかじめアニールさせたgRNAオリゴヌクレオチドをコンカテマーベクターの適切な位置に組み込みます。反応混合液をDNA/RNAフリーウォーターで1/100に希釈し、3つおよび4つのgRNAコンカテマーベクターを作製します。Bbs1シャフリング反応液を氷上で調製します。CRISPR-concatemerベクター 100 nanograms、オリゴ混合液 10 microliters、制限酵素バッファー 1 microliter、DTT 1 microliter、ATP 1 microliter、Bbs1酵素 1 microliter、T7リガーゼ 1 microliterを加え、滅菌水で全量を 20 microliters に調整します。ピペッティングで十分に混ぜ合わせ、ベクターのみを含むネガティブコントロールを設けます。サーモサイクラーを用いて、以下の設定で反応を行います。3個および4個のgRNAコンカテマーをクローニングする場合、37 °Cで5分間、21 °Cで5分間のサイクルを50サイクル行い、37 °Cで15分間保持した後、4 °Cで不定期間保持します。2個のgRNAコンカテマーの場合は、ステップ1を25サイクルとした同様の設定で実行します。Bbs1シャッフリング反応が完了したら、各ライゲーションミックスから11 µLを分注し、1.5 µLのエクソヌクレアーゼバッファー、1.5 µLのATP、1 µLのDNAエクソヌクレアーゼ、および滅菌水を加え、全量を15 µLにします。37°Cで30分間インキュベートした後、70°Cで30分間インキュベートします。続いて、標準的なプロトコルに従い、反応混合物を用いて化学的コンペテントE.coli菌を形質転換させます。CRISPRコンカテマーベクターにgRNAインサートが存在することを確認するため、白金ループで細菌コロニーをピックアップし、それぞれ4mLのLB培地に接種します。クローンをオービタルシェーカーを用い、37 °Cで一晩培養します。翌日、メーカーの指示に従い、プラスミドミニプレップキットを使用してDNAを抽出します。各DNAサンプル約200 ngを、10 UのEcoR1および5 UのBglIIとともに、合計10 µLの反応液で混合します。サイズ比較のための陽性対照として、対応する元のベクターを含む別の反応混合物を用意します。反応液を37 °Cで3時間インキュベートします。消化反応液を1%アガロースゲルを用い、90 Vで約20分間電気泳動します。UVトランスイルミネーターを用いてゲルを視覚化し、正しいインサートサイズを持つクローンを特定します。gRNAが正しい位置にクローニングされ、その結果としてすべてのBbs1認識部位が消失したことを確認するため、選択したクローンを5ユニットのBbs1で消化します。対照として、対応する元のベクターを用いた別の反応混合液を用意してください。37 °Cで3時間インキュベートし、消化反応物を1%アガロースゲルを用いて90 Vで約20分間電気泳動します。UVトランスイルミネーターを使用してゲルを可視化し、Bbs1によって切断されていないベクターを特定します。エレクトロポレーションのためにオルガノイドを分割する際は、1回のトランスフェクションにつき48ウェルプレートの最低6ウェルに播種してください。オルガノイドを20 µLの基底膜マトリックスドロップに播種し、ウェルあたり250 µLのWENRおよびニコチンアミド含有培地を用いて、37 °C、5% CO2の加湿インキュベーター内で培養します。2日目に、WENRおよびニコチンアミド含有培地を、抗生物質を含まない250 µLのEGF、noggin、GSK3阻害剤およびROCK阻害剤含有培地に交換します。3日目に、オルガノイド培地を、抗生物質を含まないEGF、noggin、GSK3阻害剤、ROCK阻害剤および1.25% DMSO含有培地に変更します。4日目に、1 mLピペットチップを使用して基底膜マトリクスのドームを破砕し、オルガノイドを1.5 mLチューブに移します。48ウェルプレートの4ウェル分の内容物を1本のチューブにまとめます。P200ピペットで約200回ピペッティングし、オルガノイドを機械的に小さな断片に分散させます。室温で600 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、すべてのチューブから培地を除去し、ペレットを1 mLの細胞培養グレードの組換えプロテアーゼで再懸濁します。37 °Cで最大5分間インキュベートします。エレクトロポレーションの成功は、単一細胞ではなく細胞塊を含む細胞懸濁液を得られるかどうかにかかっているため、プロテアーゼ処理を慎重にモニターすることが重要です。4倍対物レンズを備えた倒立光学的顕微鏡を用いて、50 µLのサンプル滴を確認してください。エレクトロポレーション後の細胞生存率を高めるため、10〜15個の細胞からなる細胞塊が形成されていることが望ましいです。細胞懸濁液を低吸着の15 milliliterチューブに移し、抗生物質を含まない基礎培地を9 milliliter加えて解離を停止させます。室温で600 times G、5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを1 milliliterの低血清培地で再懸濁します。バーカーチャンバーを用いて細胞数をカウントします。1回のエレクトロポレーション反応につき、最低1 × 10⁵個の細胞が必要です。まず、細胞懸濁液の入った15 mLチューブに9 mLの低血清培地を加え、室温で400 ×gで3分間遠心分離します。上清をすべて取り除き、ペレットをエレクトロポレーション溶液で再懸濁してください。2本の新しいチューブに、合計10 microgramsのDNAを加えます。次に、最終容量が100 microlitersになるようにエレクトロポレーション溶液を加え、細胞とDNAの混合液を氷上で保持します。この細胞とDNAの混合液をエレクトロポレーションキュベットに移し、キュベットをエレクトロポレーターのチャンバーに設置します。エレクトロポレーターの適切なボタンを押し、インピーダンスを測定して、0.030から0.055 ohmであることを確認します。テキストプロトコルに示された設定に従ってエレクトロポレーションを行います。キュベットに400 microlitersのエレクトロポレーションバッファーとROCK阻害剤を加え、その後、内容物をすべて1.5 milliliterチューブに移します。細胞を回復させるため、室温で30分間インキュベートします。30分後、室温で400 ×gで3分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを1ウェルあたり20 µLのベースメントマトリックスで再懸濁します。48ウェルプレートの1ウェルあたり約1×10⁴〜1×10⁵個の細胞を播種し、EGF、noggin、GSK3阻害剤、ROCK阻害剤、および1.25% dimethyl sulfoxideを含む培地を加えます。37°Cでインキュベートします。翌日、培地をEGF、noggin、GSK3阻害剤、およびROCK阻害剤を含むものに交換し、GFPの発現を観察して導入効率を確認します。オルガノイドを37°Cで保持します。2日後、培地を新鮮な培地に交換します。エレクトロポレーションの4日後、培地をニコチンアミドおよびROCK阻害剤添加WENR培地に変更し、引き続き細胞を37°Cで培養します。EcoR1およびBglIIを用いた二重制限酵素消化により、コンカテマーベクターに正しい数のgRNAインサートが存在することが確認されます。下方のバンドの予想サイズは、4つのgRNAを含むコンカテマーベクターでは約1.6 kilobase、3つのgRNAを含むコンカテマーベクターでは1.2 kilobaseです。さらに、Bbs1による消化により、gRNAが正しい位置にクローニングされ、その結果としてすべてのBbs1認識部位が消失していることが確認されます。確認済みのコンストラクトをエレクトロポレーションによってマウス腸管オルガノイドに導入し、GFP発現により示される最大70%の導入効率を達成します。このビデオを視聴することで、gRNAコンカテマーベクターの作製方法と、エレクトロポレーションを用いてそれらを3Dオルガノイド培養に効率的に導入し、複数の遺伝子を同時にノックアウトする方法について十分に理解することができます。

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このビデオプロトコルでは、一次腸上皮のオルガノイドにおけるレンチウイルス形質導入と、定量的RT-PCR、RNA-マイクロアレイ、免疫組織化学によるこれらの培養物の処理と下流分析について、段階的に説明します。...

レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

マウス卵母細胞のマイクロインジェクションは、古典的なトランスジェネシス（ すなわち、トランスジーンのランダム組込み）およびCRISPR媒介遺伝子ターゲティングの両方に一般的に使用される。このプロトコールは、マイクロインジェクションの最新動向をレビューし、特に品質管理とジェノタイピング戦略を重視しています。...

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

我々は、1)レンチまたはレトロウイルス伝達のための磁気ナノ粒子を使用して腸内オルガノイドを効率的に設計し、2)工学的オルガノイドから凍結切片を生成するステップバイステップの指示を説明する。このアプローチは、下流の効果を調査するためにオルガノイドの遺伝子発現を効率的に変更するための強力なツールを提供します。...

凍結断面化のための磁気ナノ粒子転写ウイルスベクターを用いた一次マウス腸オルガノイドの遺伝子工学

このプロトコルは、より大きなプラスミドを有する4つの異なる胃腸オルガノイドエンティティのトランスフェクションのための効率的なエレクトロポレーション法を記述する(10kBの範囲)。それは1日以内に行うことができるし、広範な準備または特別な、費用を要するエレクトロポレーションの緩衝液を必要としない。...

消化管オルガノイドの遺伝子工学のための汎用的かつ効率的なエレクトロポレーションプロトコル

ここでは、子宮胚性レンチウイルス注射で超音波誘導を使用した迅速かつ直接的なin vivo...

In Vivo CRISPR/Cas9スクリーニングによるマウス皮膚と口腔の遺伝子機能の同時評価

本プロトコルは、遺伝子カセットノックインおよびフロックスマウスを効率的に作製するためのCRISPR-Cas9およびドナーDNAの接合子マイクロインジェクションを記載する。...

マウスの遺伝子カセットノックインおよびフロックス対立遺伝子を作成するための接合子マイクロインジェクション

接合子のCRISPRエレクトロポレーションによるマウスの効率的なゲノム編集

ここでは、遺伝子型と表現型の依存関係を調査し、神経膠芽腫治療の可能性のある薬剤をスクリーニングするために、実験室で操作された神経膠芽腫オルガノイド(LEGO)を生成および利用するための包括的なプロトコルについて概説します。...

実験室で設計された膠芽腫オルガノイド培養および薬物スクリーニング

ここでは、エレクトロポレーションによるスライスされたヒト皮質オルガノイドの急性遺伝子操作について紹介します。これらの皮質オルガノイドモデルは、スライス後に心室のような構造を容易に特定できるため、特に注射に適しており、ヒトの皮質発達、神経発達障害、および皮質進化の機能的研究を可能にします。...

遺伝子機能研究のためのスライスヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーション

学ぶ CRISPRコンカテマーベクターを用いた複数gRNAのクローニングとマウス小腸オルガノイドへの電気穿孔法による複数遺伝子ノックアウトの効率的な手法。この方法は機能喪失研究の効率を大幅に向上させます。

CRISPRコンカテマーを用いたマウス小腸オルガノイドにおける複数の遺伝子ノックアウトのためのプロトコル

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