CRISPRコンカテマーを用いたマウス小腸オルガノイドにおける複数の遺伝子ノックアウトのためのプロトコル

このプロトコルの全体的な目標は、複数のガイドRNAを1つのCRISPRコンカテマーベクターにクローニングし、マウス腸オルガノイドで高効率のエレクトロポレーションを達成して、複数の遺伝子を同時にノックアウトすることです。この方法は、並列補償の潜在的な影響を克服することを可能にすることにより、機能喪失研究の効率を大幅に向上させることができます。当社のCRISPRコンカテマー戦略の主な利点は、1つのクローニングステップの利便性と、最大4つの異なる遺伝子の同時ノックアウトを実行できることです。

手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生であるアレッサンドラ・メレンダが行います。CRISPRコンカテマーベクターへのガイドRNAまたはgRNAのクローニングは、各gRNAオリゴヌクレオチドの上部および下部の鎖をアニーリングし、それらの末端をリン酸化するための単一の反応から始まります。3つの連結体のために、氷上で反応混合物を調製し、3マイクロリットルの上鎖gRNA、3マイクロリットルの下鎖gRNA、2マイクロリットルのT4 DNAリガーゼ緩衝液、1マイクロリットルのT4ポリヌクレオチドキナーゼおよび水(総容量20マイクロリットルまで)を使用する。

ペッティングしてサーモサイクラーを37°Cで30分間、95°Cで5分間、0.3°C/分で25°Cまで下げ、4°Cで保持するという設定でよく混合します。次のステップはBbs1シャッフル反応で、事前にアニーリングされたgRNAオリゴヌクレオチドがコンカテマーベクターの適切な位置に組み込まれます。反応混合物をDNA、RNAフリー水で1〜100希釈して、3つおよび4つのgRNAコンカテマーベクターを生成します。

Bbs1シャッフル反応を氷上で組み立てます。100ナノグラムのCRISPRコンカテマーベクター、10マイクロリットルのオリゴ混合物、1マイクロリットルの制限酵素緩衝液、1マイクロリットルのDTT、1マイクロリットルのATP、1マイクロリットルのBbs1酵素、1マイクロリットルのT7リガーゼ、および総容量20マイクロリットルまでの水を使用します。ピペッティングでよく混合し、ベクターを含むネガティブコントロールを含めます。

3つおよび4つのgRNAコンカテマーをクローニングするために、以下の設定を使用してサーモサイクラーで反応を実行し、摂氏37度で5分間、摂氏21度で5分間50サイクルを実行し、摂氏37度で15分間保持した後、摂氏4度で無期限に保持します。2つのgRNAコンカテマーについて、ステップ1を25サイクル行い、同じ設定を実行します。Bbs1シャッフル反応が完了したら、各ライゲーションミックスを11マイクロリットル取り、1.5マイクロリットルのエキソヌクレアーゼバッファー、1.5マイクロリットルのATP、1マイクロリットルのDNAエキソヌクレアーゼ、および水を加えて、合計15マイクロリットルにします。

37°Cで30分間インキュベートし、続いて70°Cで30分間インキュベートします。続いて、反応混合物は、標準的なプロトコルに従って、化学的に有能な大腸菌を形質転換するために使用されます。CRISPRコンカテマーベクターにgRNAインサートが存在することを確認するには、接種ループを持つ細菌コロニーを選び、それぞれに4ミリリットルのLB培地を接種します。

クローンをオービタルシェーカーで摂氏37度で一晩成長させます。翌日、メーカーの指示に従って、プラスミドミニプレップキットを使用してDNAを抽出します。各DNAサンプルの約200ナノグラムを10マイクロリットルの反応で10ユニットのEcoR1および5ユニットのBglIIと混合します。

サイズ比較のためのポジティブコントロールとして、対応する元のベクターと別の反応混合物を含めます。反応を摂氏37度で3時間インキュベートします。1%アガロースゲルで90ボルトで約20分間、消化反応を実行します。

UVトランスイルミネーターを使用してゲルを可視化し、正しいインサートサイズでクローンを特定します。gRNAが正しい位置にクローニングされ、その結果、すべてのBbs1認識部位が失われたことを確認するために、選択したクローンを5ユニットのBbs1で消化します。対応する元のベクターをコントロールとして、別の反応ミックスを含めます。

摂氏37度で3時間インキュベートし、1%アガロースゲルで90ボルトで約20分間消化反応を実行します。UVトランスイルミネーターを使用してゲルを可視化し、Bbs1によって切断されていないベクターを特定します。エレクトロポレーションのためにオルガノイドを分割する場合は、トランスベクションごとに48ウェルプレートのウェルを最低6個播種します。

オルガノイドを20マイクロリットルの地下マトリックスドロップに播種し、ウェルあたり250マイクロリットルのWENRとニコチンアミド培地で摂氏37度、二酸化炭素5%で加湿インキュベーターで成長させます。2日目に、WENRとニコチンアミド培地を、抗生物質を含まない250マイクロリットルのEGFとノギン、GSK3阻害剤、および岩石阻害剤培地に交換します。3日目に、オルガノイド培地をEGFとノギン、GSK3阻害剤、岩石阻害剤、および抗生物質を含まない1.25%ジメチルスルホキシドに変更します。

4日目には、1ミリリットルのピペットチップを使用して地下のマトリックスドームを破壊し、オルガノイドを1.5ミリリットルのチューブに移します。48ウェルプレートの4つのウェルの内容物を1本のチューブに引き込みます。オルガノイドを機械的に小さな断片に砕くには、P200ピペットで約200回ピペッティングします。

Gの600倍で室温で5分間遠心分離します。遠心分離後、すべてのチューブから培地を取り出し、パレットを細胞培養グレードの組換えプロテアーゼの1ミリリットルに再懸濁します。摂氏37度で最大5分間インキュベートします。

エレクトロポレーションの成功は、単一細胞ではなく細胞のクラスターを含む細胞懸濁液を得ることにかかっているため、プロテアーゼ処理を注意深く監視することが重要です。50マイクロリットルの滴下試料を倒立型光学顕微鏡で4倍対物レンズで確認します。10〜15個の細胞のクラスターは、エレクトロポレーション後の細胞生存率を高めるため、望ましいです。

細胞懸濁液を低結合の15ミリリットルチューブに移し、抗生物質を含まない9ミリリットルの基礎培地を添加して解離をホッグします。室温で5分間、Gの600倍で遠心分離します。上清を捨て、パレットを1ミリリットルの還元血清培地に再懸濁します。.

バークスチャンバーで細胞の数を数えると、エレクトロポレーション反応ごとに最低1×10〜5の細胞が必要です。この手順は、細胞懸濁液を含む15ミリリットルのチューブに9ミリリットルの還元血清培地を加え、室温で3分間Gの400倍で遠心分離することから始めます。すべての上清を取り除き、パレットをエレクトロポレーション溶液に再懸濁します。

合計10マイクログラムのDNAを2つの新しいチューブに加えます。次に、エレクトロポレーション溶液を最終容量100マイクロリットルに加え、細胞DNA混合物を氷上に保ちます。細胞DNA混合物をエレクトロポレーションキュベットに移し、キュベットをエレクトロポレーターチャンバーに入れます。

エレクトロポレーターの適切なボタンを押してインピーダンスを測定し、0.030〜0.055オームであることを確認します。テキストプロトコルに示されている設定に従ってエレクトロポレーションを実行します。400マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーと岩石阻害剤をキュベットに加え、その内容物をすべて1.5ミリリットルのチューブに移します。

室温で30分間インキュベートし、細胞を回復させます。30分後、Gの400倍で室温で3分間遠心します。上清を取り除き、パレットを地下マトリックスのウェルあたり20マイクロリットルに再懸濁します。

48ウェルプレートにウェルあたり約1回10〜4〜1回10〜5番目の細胞を播種し、EGFに加えてノギン、GSK3阻害剤、岩石阻害剤、および1.25%ジメチルスルホキシド培地を添加します。摂氏37度でインキュベートします。翌日、培地をEGFとnoggin、GSK3阻害剤、岩石阻害剤に交換し、GFPの発現を観察してトランスベクション効率を確認します。

オルガノイドは摂氏37度に保ちます。2日後、メディウムを新しいメディウムと交換します。エレクトロポレーションの4日後、培地をWENRとニコチンアミドおよび岩石阻害剤培地に交換し、細胞を摂氏37度でインキュベートし続けます。

コンカテマーベクターに正しい数のgRNAインサートが存在することは、EcoR1とBglIIによる二重制限消化によって確認されます。下側のバンドの予想されるサイズは、4 gRNAコンカテマーベクターで約1.6 kgbase、3 gRNAコンカテマーベクターで約1.2 kgベースです。さらに、Bbs1による消化により、gRNAが正しい位置にクローニングされたことが確認され、その結果、すべてのBbs1認識部位が失われます。

確認されたコンストラクトは、エレクトロポレーションによってマウス腸オルガノイドに送達され、GFP発現で示される最大70%のトランスベクション効率を達成します。このビデオを見れば、gRNAコンカテマーベクターを作製する方法や、エレクトロポレーションを使用して効率的に3Dオルガノイド培養に送達し、同時に複数の遺伝子をノックアウトする方法を十分に理解できるはずです。