マウス脳からの単核細胞単離:脳常在単核細胞を単離するための密度勾配遠心分離技術

リンパ球と単球で構成される脳内の単核細胞は、脳機能と恒常性の維持に重要な役割を果たします。

これらの単核細胞を単離するには、まず、生理食塩水を灌流したばかりの採取したばかりのマウス脳を取ります。

灌流により、血管から血液とその成分を除去することができ、その後のステップで脳に常在する免疫細胞を分離することができます。

次に、脳を適切な培地ですすぎ、付着した赤血球を除去します。すすぎに続いてみじん切りにして、小さな組織片を取得します。

組織片を均質化して、単一細胞と細胞断片の懸濁液を得る。

この懸濁液に、次に、冷却培地と適切な密度勾配培地を適切な量で添加して、低密度勾配培地を形成します。

次に、特定のボリュームの高密度グラデーション媒体を追加します。高密度グラデーション媒体は、下部に別のレイヤーを形成し、不連続な密度グラデーションを作成します。

および低温条件で懸濁液を遠心分離します。単核細胞は、2つの密度勾配培地層間の界面を占めます。

細胞破片とミエリン(神経細胞軸索を取り囲む脂肪組織鞘)を含む最上層を廃棄します。

界面層を適切な培地と遠心分離機を含む新しいチューブに移します。

精製された単核細胞はペレットとして沈殿し、さらなる分析のためにバッファーに再懸濁することができます。

蓋骨を鼻から首まで慎重に切断し、各動物の脳を頭蓋ボックスから10ミリリットルのRPMI培地を含む個々の50ミリリットルのチューブに移します。

チューブをよく混合して付着した赤血球を除去し、吸引によって培地を除去します。各チューブに10ミリリットルの新鮮な培地を加え、脳を個々の100ミリメートルの皿に移します。

各脳をカミソリで細かく刻み、プラスチックピペットを使用して、一度に1つの皿から6ミリリットルの培地で氷冷の7ミリリットルの焼結ガラスホモジナイザーにできるだけ多くの組織を移します。

棒の「緩い」プランジャーを使用して脳を粉砕してから、「タイトな」プランジャーを使用して懸濁液が均一になるまで組織を持ち込みます。次に、得られた組織スラリーを氷上の予冷した15ミリリットルの円錐形チューブに注

すべてのサンプルが均質化されたら、各チューブの容量を新鮮な培地で7ミリリットルに調整してから、チューブあたり3ミリリットルの100%基底膜マトリックスを含む新しい冷却15ミリリットルチューブに各組織懸濁液を追加します。

転して数回混合し、3ミリリットルのピペットを使用して、各組織溶液サンプルの下に1ミリリットルの70%密度勾配溶液を注意深くゆっくりと加えます。

密度勾配遠心分離によって細胞を分離し、すべてのミエリンを完全に除去するように注意しながら、最上層のほぼすべてを除去します。

インターフェースを新しい15ミリリットルのチューブに移し、新鮮な培地で容量を10ミリリットルに調整します。次に、サンプルを再度遠心分離し、上清を除去してから、ペレットをチューブあたり約100マイクロリットルの培地に再懸濁します。

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