Name: 特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学ぶマウス脳からの高純度ミクログリア分離法。密度勾配遠心と磁気分離を組み合わせ、神経炎症や薬物スクリーニング研究に有用な細胞を迅速に調製するプロトコルを解説します。

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著者が明らかに何もありません。

ミクログリアは、環境刺激によって変更両方 pro - と抗炎症、能力を持っています。前の研究は、ミクログリアの活性化の変調は神経保護を与えることができる示されています。ニューロンに保護を提供して損傷を修復する能力は、これらの複雑な細胞の現在の理解を促進するためのより多くの研究を必要とします。したがって、高純度プライマリ ミクログリアの分離は重要かつ有用な手法です。これは非常に純粋なプライマリ ミクログリア 2 日以内の in vitro実験の準備を取得する比較的簡単な方法です。
マウスの脳からプライマリ ミクログリアの分離のための文献に記載されているプロトコルの範囲があります。主な課題は十分なサンプル、生存率と純度の高いを効率的に生成します。このプロトコルの主な利点は、培養時間を必要とせず非常に純粋なサンプルの収量です。したがって、メソッドが 2 週間から 2 日間に短縮、これは容易に高速な結果。評価の手順は、ミクログリア、これらの複雑な細胞の現在の理解を向上させる情報の堅牢な機能を得られます。プロトコルは、2 つの現在のアプローチ - 密度勾配遠心法と磁気分離を...

炎症、低酸素虚血および出血から周産期の期間中に取得した損傷は長期的後遺症の配列を持つことができます。周産期の脳損傷の複雑な病態は炎症や虚血後の神経細胞と軸索の死1理論します。生得の免疫反応は、傷害2につながるイベントの連鎖で重要な役割を果たしています。
ミクログリア、中枢神経系 (CNS)、内居住者の免疫細胞は、傷害3の最初の反応です。ミクログリアは、4の環境保護や毒性、依存する容量を持つプラスチック電池種類です。走化性、食作用、抗原提示、サイトカインや活性酸素種4、5の生産に関与しています。老齢ミクログリアは常に環境を調査し、外国または有害物質4の存在によってアクティブ化されます。活性化は、中枢神経系の保護4で重要な炎症応答に します。これらの M1「炎症」表現型ミクログリア主に抗原提示と病原体4の死に関与しています。にもかかわらず、神経保護の炎症反応の重要な役割は、自由なまたは長期の炎症が神経損傷4につながる有害なにできます。ただし、特定の環境の刺激にさらされると、ミクログリアは抗炎症の表現型を表わすことができます。これら pro 修復 M2 ミクログリア創傷治癒と修復6各種のサイトカインを放出する重要な役割があるし、他の溶性メディエーター レセプター炎症、貪食能を増加し、促進する修復4, 7. ミクログリアの役割は多様であり、再髄鞘化8、脳卒中モデル9で酸素とグルコース枯渇中に神経細胞を保護して神経突起を推進運転オリゴデンドロ サイト分化脊髄損傷は、10をモデル化します。
これらのグリア細胞の研究を理解および neuroinflammation への応答の処理で重要な側面を表します。記述のプロトコル アミロイド疾患におけるミクログリアの変調方式の治療の可能性をさらに調査できます。
ミクログリア活性化神経の役割への変調は、条件11,12,13の範囲で観察されています。したがって、現在の理解と活性化ミクログリアの変調をさらに勉強して改善は重要なin vitroとin vivoの両方を含むさまざまなモデルの使用を必要とします。In vitroの研究より効率、低いコストと能力孤立セル人口を調査するための重要なツールを表します。
ミクログリア マウス脳から効率的に良い生存率および高純度と高収率のサンプルを生成する課題の分離のための文献に記載されているプロトコルの範囲があります。プライマリ ミクログリアの分離の一般的に使用される方法は、磁気分離と混合培養の揺れです。個人的な経験を通して、磁気の列を妨げ細胞の残骸の高度があったことが分られました。したがって、次のプロトコルは、CD11b 磁気分離に続いて初期密度勾配遠心法手順を組み込んだに利用されました。下記プロトコルは、十分な量の非常に純粋なサンプルを生成する最適化されています。その高純度と短い期間のために有利である-1 つは、2-3 週間培養することがなく 2 日以内の試金を実行できます。このプロトコルは、プライマリ マウスアストロの隔離のため潜在的適応ことができます。

<table><tbody><tr><td>DMEM、低グルコース、ピルビン酸</td><td>Gibco</td><td>11885084</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌薬 (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI グレード II ウシ膵臓由来</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>パパイン産 パパイヤラテックス、緩衝液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3125-100mg</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定、熱不活性化</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (1X)</td><td>Gibco</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (10X)</td><td>Gibco</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>18770</td><td>EasySep マグネットバリアント</td></tr><tr><td>EasySep 磁石</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep バッファー</td><td>StemCell Technologies</td><td>20144</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>Gibco</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン (2.5%) (10X)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>精製ラット 抗マウス CD16/CD32 (マウス BD FC Block&trade;)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5mL丸底高透明度PP試験管、スナップキャップ付き、滅菌</td><td>コーニング</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>175cm&sup2;ベントキャップ付きアングルネック細胞培養フラスコ</td><td>Corning</td><td>431080</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌由来のリポ多糖類 O127:B8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5024</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルTC処理マイクロプレートサイズ96ウェル、透明、ポリスチレン、丸底</td><td>コーニング</td><td>CLS3799</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(粉末、95%)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>ラビット アンチイバ1</td><td>ワコー</td><td>01919741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgGハンド&L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>FACS 抗体</td><td>企業名</td><td>カタログ番号</td><td></td></tr><tr><td>V450,ラット,抗マウス,CD45,30-F11,RUO</td><td>BD Biosciences</td><td>560501</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 CD11b&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>45-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>ZombieNIR</td><td>Biolegend</td><td>423105</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P35361</td><td></td></tr><tr><td>Annexin.V_FITC</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-060</td><td></td></tr><tr><td>プロポジウムヨウ化物溶液</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-233</td><td></td></tr></tbody></table>

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

ミクログリア、脳内の居住者の免疫細胞は、炎症や中枢神経系に傷害の最初の反応です。最近の研究は、動的、プロ炎症性と抗炎症の表現型を想定しての対応するミクログリアを明らかにしました。M1 (炎症) と M2 (pro 修復) 表現型プレイ アミロイド条件周産期の脳損傷など展示異なる重要な役割機能ある特定の環境刺激に応答します。ミクログリア活性化の変調は神経保護ミクログリアが脳損傷の治療の可能性あるかもしれませんが示唆を与えるに指摘されています。しかしより多くの研究は病気におけるミクログリアの役割を理解するために必要なこのプロトコルを容易にします。プロトコルは下記を組み合わせた磁気分離、体外実験のために使用できる主要な小グリア細胞の純度の高いサンプルの生産と細胞の残骸を減らすために密度勾配の遠心分離プロセス、2-3 週間培養の必要があります。さらに、評価手順は、ミクログリア、偏光の私達の理解を改善するための研究を支援し、これらの細胞のプライミング再生医療の分野で強力な影響を持っている情報の堅牢な機能を得られます。

ここで説明した方法を使用して、ミクログリアの純粋な人口は分離できるので、体外と FACS 解析を用いた特性評価のために準備することができます。そもそも、18 動物まで使用できます選別、約 450,000 600,000 ミクログリア細胞の期待利回りあたり。最初に単離細胞の純度を確認することが重要だし、CD45 と CD11b ミクログリアの同定、2 つのマーカーの染色で FACS 解析を行ったように証明できる面倒、ミクログリアによって表現される多くのマーカーはまた表明しました。大食細胞、およびこれらの 2 つのマーカーの使用は、正確かつ信頼性の高い定量をことができます。具体的には、ミクログリア CD45、中枢神経系と末梢のマクロファージで高発現と比較しての低表現し、CD11b 陽性があります (図 1)。この特定の分離から 89.3% の純度が報告されました。CD11b の汚損の後、我々 はことを注意してください私たちの主のミクログリアが (より小さいより多くとより分岐し、はっきりと unram...

マウスの脳からプライマリ ミクログリアの隔離のためのプロトコルが表示されます。この手法は、神経学的な条件の現在の理解の促進に役立ちます。密度勾配遠心法と磁気分離は、純度の高いサンプルの十分な収量を生成する結合されます。さらに、ミクログリアの特性評価のための手順をまとめました。

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

このプロトコルの全体的な目標は、げっ歯類から高純度のミクログリア集団を単離することです。この方法は、ミクログリア上の幹細胞の免疫調節特性の同定や薬物スクリーニングアッセイの実施など、神経情報分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、培養に長時間必要なく、高純度のミクログリア集団を分離できることです。この手順を開始するには、はさみの先端を脊柱管の開口部に挿入し、耳道を横方向に切開します。次に、組織を吻に向かってゆっくりとスライドさせて頭蓋骨を露出させます。次に、矢状縫合糸に沿ってブレグマに向かって切開します。次に、ハサミの先端をブレグマに挿入し、横方向に切開します。その後、頭蓋骨をそっと剥がして脳を露出させます。湾曲した鉗子を使用して、それを取り外し、5ミリリットルの滅菌容器に移します。洗血ごとに5ミリリットルの氷冷した洗浄剤で2〜3回洗って、血液を取り除きます。層流フードに、5ミリリットルの容器の内容物を氷の上に置かれた小さなペトリ皿に入れます。滅菌メスの刃または滅菌はさみを使用して、小脳と嗅球を取り外してください。次に、2つの半球を分離するために正中線をカットします。その後、髄膜層を、目に見える血管がある脳の表面に赤みを帯びた非常に薄い細胞層として特定します。皮質を傷つけないように注意しながら、細い鉗子で髄膜層を慎重に剥がします。髄膜層が壊れた場合は、引き裂かれた破片が完全に取り除かれるまで剥がし続けます。次に、半球を氷上の新しい小さなシャーレに移し、洗浄剤で満たします。滅菌メスの刃で脳を細かく刻みます。その後、100マイクロリットルのパパインと150マイクロリットルのDNase1を培地に加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。消化後、P1000ピペットを使用して組織を粉砕します。ティッシュペーパーが大きすぎてピペットに入ることができない場合は、滅菌ハサミを使用してピペットの先端を広げることを検討してください。このプロセスでは、細胞の生存率を低下させる可能性があるため、培地に気泡を導入しないように注意してください。層流フードには、100マイクロメートルのセルストレーナーを備えた50ミリリットルの円錐形チューブを準備します。消化培地と脳片をストレーナーに注ぎます。滅菌済みの3ミリリットル注射器のプランジャーを使用して、組織が見えなくなるまで粉砕動作で脳の断片を押し込みます。このプロセス全体を通して、フィルターを洗浄媒体で継続的に洗浄します。これにより、ストレーナーに閉じ込められた細胞が洗い流されます。その後、シングルセル懸濁液を500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、密度勾配培地を10倍滅菌HBSSに9対1の比率で添加することにより、ストックアイソトニックPercollを調製します。DMEMでは30%SIP、one-X HBSSでは70%SIPとして勾配を準備します。たとえば、10 ミリリットルの 30%SIP を準備するには、7 ミリリットルの DMEM に 3 ミリリットルの SIP を追加します。次に、円錐管から上清を吸引し、DMEM中の30%SIPの8ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁します。全容量を新しい15ミリリットルの円錐管に移します。その後、トランスファーピペットに70%SIPを充填して70%SIP溶液を下敷きにし、トランスファーピペットを慎重に円錐形チューブの底に押し込みます。先端が底に近づいたら、内容物をトランスファーピペットにそっと押し込みます。続いて、セルを含むSIP層を650Gで遠心分離し、ブレーキゼロと加速4で室温で25分間遠心分離します。70%Percoll層は、細心の注意を払って下敷きにする必要があります。この界面が破壊されると、細胞層内のミクログリアのトラップに深刻な影響を及ぼし、収量が大幅に減少する可能性があります。次に、チューブの上部から細胞の破片で培地を4ミリリットル吸引して、次のステップで単核細胞の除去を容易にします。次に、ピペットチップを界面に向かって慎重に下げ、30/70密度勾配培地界面から単核細胞を単離します。曇ったインターフェースから約3ミリリットルを収集し、新しい15ミリリットルの円錐管に移します。その後、混合物を9ミリリットルのHBSSで希釈して、密度勾配媒体の除去を助けます。単核細胞を含む希釈密度勾配培地界面を500 Gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、1ミリリットルの成長培地で再懸濁します。その後、再懸濁した細胞をトリパンブルーで染色し、血球計算盤を用いて細胞数を計数します。このステップでは、収集した単核細胞を300 Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、磁気絶縁を妨げるため増殖培地を除去します。以前に得られたのと同じ細胞数を使用して、0.1〜2.5ミリリットルの容量範囲内で2%FBSと1ミリモルEDTAを含むPBS中の1ミリリットルあたり8個の核細胞に1回10個で再懸濁します。次に、PBS中の全量の有核細胞を、新鮮な5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに加えます。次に、サンプル1ミリリットルあたり50マイクロリットルのCD11b PE標識試薬を追加します。光から保護して室温で15分間インキュベートします。その後、サンプル1ミリリットルあたり70マイクロリットルのセレクションカクテルを追加します。光から保護して室温で15分間インキュベートします。その後、磁性粒子を5回以上ピペッティングして混合します。50μリットル/ミリリットルを試料に加え、光を避けて室温で10分間インキュベートします。細胞混合物の総容量が2.5ミリリットル未満の場合は、この容量まで2%FBSを含むPBSと1ミリモルEDTAを補充し、2〜3回静かにピペッティングして混合します。次に、チューブを磁石に入れ、室温で5分間インキュベートします。1回の連続動作で、チューブを含む磁石を2〜3秒間完全に反転させて、上澄み液を注ぎます。磁石を直立位置に戻し、チューブを磁石から取り外します。その後、手順を繰り返して残りの細胞をカラムから洗い流します。細胞を目的の増殖培地に再懸濁します。収集容器の側面をすすぎ、チューブの側面から細胞を収集し、収量を最大化します。この図に見られるように、単離された一次ミクログリアは、球状の細胞体と明確な分岐構造を保持しています。以下は、単離されたミクログリアの代表的な事実プロットです。アネキシンVとヨウ化プロピジウムの併用染色により、LPSによる刺激後のアポトーシス細胞、壊死細胞、または生細胞の分類が可能になり、hAECコンディショニング培地は、コントロールと比較してミクログリアのアポトーシスを大幅に減少させ、この細胞タイプに対する保護の形態を示唆しています。一度習得すると、このテクニックは正しく実行すれば6〜8時間で実行できます。この方法を実行するときは、Percollのレイヤー化に細心の注意を払うことが重要です。このステップは歩留まりに最も大きな影響を与えるためです。この技術に続いて、食作用機能アッセイやニューロンとの共培養などの他の手順を使用して、初代ミクログリアで選択した細胞タイプの免疫調節特性に関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、この分野の研究者が周産期の脳損傷で原発性ミクログリアをどのように調節できるかを発見する道を開きました。この技術の意味は、運動機能障害や認知機能障害につながる神経情報に関与することが知られている一次免疫細胞タイプの特性評価を可能にするため、周産期脳損傷の治療と診断にまで及びます。この方法は、脳性麻痺などの運動障害に関する洞察を得ることができますが、アルツハイマー病など、ミクログリアが病因に関与する他の疾患にも適用できます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、培養時間が長い後の潜在的なエピジェネティックな変化を回避するミクログリアの迅速な特性評価のための技術が必要だったときでした。このビデオを見れば、ミクログリアの高純度集団を分離してダウンストリームの特性評価を行う方法について十分に理解できるはずです。

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、密度勾配遠心分離を使用してマウスの脳から単核細胞の分離を行います。単離された単核細胞懸濁液は、さらなるダウンストリーム分析に使用できます。...

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ミクログリア生物学の成功の調査の一つの鍵は、CNS組織からの単離の間にex vivoでミクログリア免疫機能の維持である。蛍光イメージング、免疫細胞、および炎症誘発性刺激リポ多糖（LPS）とパム3 CSK 4（PAM）を用いたELISA次のミクログリアの活性化によって評価されるように、高純度と免疫機能細胞培養で回転振盪結果を経由してミクログリアを分離する。...

マウス新生児から保護免疫表現と機能皮質ミクログリアの分離

ここでは、in vitroの実験のために出生後の仔マウス（1日目）からミクログリアを分離するためのプロトコルを提示します。分離のこの即興方法は、高収率および高純度、ミクログリア生物学を解明する目的で、広範囲の実験を可能にする別の方法を超える有意な利点の両方を生成します。...

強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離

ミクログリアの機能の詳細を理解するための努力は、生体内で成熟したミクログリアの特性を要約ミクログリア培養モデルの欠如によって妨げられています。このプロトコルは定義されている培地条件下で高度分岐し成熟ラット...

動的なを促進するために齧歯動物のミクログリアの分離と培養分岐無血清培地の形態

成体マウス脳半球の異なる解剖領域からミクログリアを分離するためのプロトコルを提供し、続いて全長転写物の深い単一細胞RNAシーケンシングのための半自動化ライブラリ製剤を提供する。この方法は、健康と疾患におけるミクログリアの機能的不均一性を解明するのに役立ちます。...

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

ここでは、柱状磁気活性化細胞選別を利用して、脱髄疾患の動物モデルにおける原発性ミクログリアを単離および精製するためのプロトコルを提示する。...

脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離

この研究は、単離された脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いた全体的なヒストン修飾の定量化のためのプロトコルについて説明しています。この研究には、データ収集に使用されたミクログリア分離プロトコルも含まれています。...

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

私たちは、磁気活性化セルソーティング(MACS)を使用して、マウスの視床下部(または同等の小さな脳構造)からミクログリア細胞を比較的短時間で単離するためのプロトコルについて説明します。MACSで選別された視床下部ミクログリアは、 ex vivo 分析に使用でき、 in vitro...

磁気活性化細胞選別による灌流したばかりの成体マウス脳からの視床下部ミクログリアの単離  

学ぶマウス脳からの高純度ミクログリア分離法。密度勾配遠心と磁気分離を組み合わせ、神経炎症や薬物スクリーニング研究に有用な細胞を迅速に調製するプロトコルを解説します。

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリミクログリアの分離

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特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

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