特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離
February 16th, 2018
マウスの脳からプライマリ ミクログリアの隔離のためのプロトコルが表示されます。この手法は、神経学的な条件の現在の理解の促進に役立ちます。密度勾配遠心法と磁気分離は、純度の高いサンプルの十分な収量を生成する結合されます。さらに、ミクログリアの特性評価のための手順をまとめました。
このプロトコルの全体的な目標は、げっ歯類から高純度のミクログリア集団を単離することです。この方法は、ミクログリア上の幹細胞の免疫調節特性の同定や薬物スクリーニングアッセイの実施など、神経情報分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、培養に長時間必要なく、高純度のミクログリア集団を分離できることです。
この手順を開始するには、はさみの先端を脊柱管の開口部に挿入し、耳道を横方向に切開します。次に、組織を吻に向かってゆっくりとスライドさせて頭蓋骨を露出させます。次に、矢状縫合糸に沿ってブレグマに向かって切開します。
次に、ハサミの先端をブレグマに挿入し、横方向に切開します。その後、頭蓋骨をそっと剥がして脳を露出させます。湾曲した鉗子を使用して、それを取り外し、5ミリリットルの滅菌容器に移します。
洗血ごとに5ミリリットルの氷冷した洗浄剤で2〜3回洗って、血液を取り除きます。層流フードに、5ミリリットルの容器の内容物を氷の上に置かれた小さなペトリ皿に入れます。滅菌メスの刃または滅菌はさみを使用して、小脳と嗅球を取り外してください。
次に、2つの半球を分離するために正中線をカットします。その後、髄膜層を、目に見える血管がある脳の表面に赤みを帯びた非常に薄い細胞層として特定します。皮質を傷つけないように注意しながら、細い鉗子で髄膜層を慎重に剥がします。
髄膜層が壊れた場合は、引き裂かれた破片が完全に取り除かれるまで剥がし続けます。次に、半球を氷上の新しい小さなシャーレに移し、洗浄剤で満たします。滅菌メスの刃で脳を細かく刻みます。
その後、100マイクロリットルのパパインと150マイクロリットルのDNase1を培地に加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。消化後、P1000ピペットを使用して組織を粉砕します。ティッシュペーパーが大きすぎてピペットに入ることができない場合は、滅菌ハサミを使用してピペットの先端を広げることを検討してください。
このプロセスでは、細胞の生存率を低下させる可能性があるため、培地に気泡を導入しないように注意してください。層流フードには、100マイクロメートルのセルストレーナーを備えた50ミリリットルの円錐形チューブを準備します。消化培地と脳片をストレーナーに注ぎます。
滅菌済みの3ミリリットル注射器のプランジャーを使用して、組織が見えなくなるまで粉砕動作で脳の断片を押し込みます。このプロセス全体を通して、フィルターを洗浄媒体で継続的に洗浄します。これにより、ストレーナーに閉じ込められた細胞が洗い流されます。
その後、シングルセル懸濁液を500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、密度勾配培地を10倍滅菌HBSSに9対1の比率で添加することにより、ストックアイソトニックPercollを調製します。DMEMでは30%SIP、one-X HBSSでは70%SIPとして勾配を準備します。
たとえば、10 ミリリットルの 30%SIP を準備するには、7 ミリリットルの DMEM に 3 ミリリットルの SIP を追加します。次に、円錐管から上清を吸引し、DMEM中の30%SIPの8ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁します。全容量を新しい15ミリリットルの円錐管に移します。
その後、トランスファーピペットに70%SIPを充填して70%SIP溶液を下敷きにし、トランスファーピペットを慎重に円錐形チューブの底に押し込みます。先端が底に近づいたら、内容物をトランスファーピペットにそっと押し込みます。続いて、セルを含むSIP層を650Gで遠心分離し、ブレーキゼロと加速4で室温で25分間遠心分離します。
70%Percoll層は、細心の注意を払って下敷きにする必要があります。この界面が破壊されると、細胞層内のミクログリアのトラップに深刻な影響を及ぼし、収量が大幅に減少する可能性があります。次に、チューブの上部から細胞の破片で培地を4ミリリットル吸引して、次のステップで単核細胞の除去を容易にします。
次に、ピペットチップを界面に向かって慎重に下げ、30/70密度勾配培地界面から単核細胞を単離します。曇ったインターフェースから約3ミリリットルを収集し、新しい15ミリリットルの円錐管に移します。その後、混合物を9ミリリットルのHBSSで希釈して、密度勾配媒体の除去を助けます。
単核細胞を含む希釈密度勾配培地界面を500 Gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、1ミリリットルの成長培地で再懸濁します。その後、再懸濁した細胞をトリパンブルーで染色し、血球計算盤を用いて細胞数を計数します。
このステップでは、収集した単核細胞を300 Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、磁気絶縁を妨げるため増殖培地を除去します。以前に得られたのと同じ細胞数を使用して、0.1〜2.5ミリリットルの容量範囲内で2%FBSと1ミリモルEDTAを含むPBS中の1ミリリットルあたり8個の核細胞に1回10個で再懸濁します。次に、PBS中の全量の有核細胞を、新鮮な5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに加えます。
次に、サンプル1ミリリットルあたり50マイクロリットルのCD11b PE標識試薬を追加します。光から保護して室温で15分間インキュベートします。その後、サンプル1ミリリットルあたり70マイクロリットルのセレクションカクテルを追加します。
光から保護して室温で15分間インキュベートします。その後、磁性粒子を5回以上ピペッティングして混合します。50μリットル/ミリリットルを試料に加え、光を避けて室温で10分間インキュベートします。
細胞混合物の総容量が2.5ミリリットル未満の場合は、この容量まで2%FBSを含むPBSと1ミリモルEDTAを補充し、2〜3回静かにピペッティングして混合します。次に、チューブを磁石に入れ、室温で5分間インキュベートします。1回の連続動作で、チューブを含む磁石を2〜3秒間完全に反転させて、上澄み液を注ぎます。
磁石を直立位置に戻し、チューブを磁石から取り外します。その後、手順を繰り返して残りの細胞をカラムから洗い流します。細胞を目的の増殖培地に再懸濁します。
収集容器の側面をすすぎ、チューブの側面から細胞を収集し、収量を最大化します。この図に見られるように、単離された一次ミクログリアは、球状の細胞体と明確な分岐構造を保持しています。以下は、単離されたミクログリアの代表的な事実プロットです。
アネキシンVとヨウ化プロピジウムの併用染色により、LPSによる刺激後のアポトーシス細胞、壊死細胞、または生細胞の分類が可能になり、hAECコンディショニング培地は、コントロールと比較してミクログリアのアポトーシスを大幅に減少させ、この細胞タイプに対する保護の形態を示唆しています。一度習得すると、このテクニックは正しく実行すれば6〜8時間で実行できます。
この方法を実行するときは、Percollのレイヤー化に細心の注意を払うことが重要です。このステップは歩留まりに最も大きな影響を与えるためです。この技術に続いて、食作用機能アッセイやニューロンとの共培養などの他の手順を使用して、初代ミクログリアで選択した細胞タイプの免疫調節特性に関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、この分野の研究者が周産期の脳損傷で原発性ミクログリアをどのように調節できるかを発見する道を開きました。
この技術の意味は、運動機能障害や認知機能障害につながる神経情報に関与することが知られている一次免疫細胞タイプの特性評価を可能にするため、周産期脳損傷の治療と診断にまで及びます。この方法は、脳性麻痺などの運動障害に関する洞察を得ることができますが、アルツハイマー病など、ミクログリアが病因に関与する他の疾患にも適用できます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、培養時間が長い後の潜在的なエピジェネティックな変化を回避するミクログリアの迅速な特性評価のための技術が必要だったときでした。
このビデオを見れば、ミクログリアの高純度集団を分離してダウンストリームの特性評価を行う方法について十分に理解できるはずです。
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概要
この記事では、マウスの脳から一次ミクログリアを分離するための詳細なプロトコルを提示し、神経学的状態の理解を深めます。この方法は、高純度ミクログリアサンプルを効率的に得るために、密度勾配遠心分離と磁気分離を組み合わせています。細胞特性の特徴付けの重要なステップも概説されています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 免疫学
背景
- ミクログリアは神経系で重要な役割を果たしており、その機能を研究するためには分離が不可欠です。
- このプロトコルは、ミクログリアの挙動と他の細胞タイプとの相互作用に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。
- 高純度のミクログリアは、神経学的研究における正確な実験結果に不可欠です。
- このプロトコルは、長時間の培養の必要性を最小限に抑え、新鮮に分離された細胞をすぐに使用できるようにします。
研究の目的
- げっ歯類の脳から純粋なミクログリア細胞を分離するための堅牢なプロトコルを開発すること。
- 神経炎症や他の神経学的障害におけるミクログリアの役割の理解を深めること。
- 薬物スクリーニングや免疫調節研究などの下流アプリケーションを可能にすること。
使用された方法
- 生体外脳組織の分離に続く機械的および酵素分解。
- 生物学的モデルは、ミクログリア分離のためにマウスの脳を使用します。
- 方法には、密度勾配遠心分離と磁気分離が含まれます。
- 主要なステップには、高細胞生存率を確保するための慎重な組織取り扱いと特定のインキュベーション条件が含まれます。
- プロトコル全体を通じて、細胞の分離と特徴付けの高精度技術が強調されました。
主な結果
- このプロトコルは、分析の準備ができた高純度のミクログリア集団を成功裏に得ることができます。
- 分離されたミクログリアは様々なアッセイに使用でき、その機能的特性と反応に関する洞察を提供します。
- この方法により、新鮮に分離された細胞に迅速にアクセスでき、即時の実験ニーズに不可欠です。
- プロトコルの堅牢性が強調され、異なる実験間で再現可能で信頼性の高い結果を確保しています。
結論
- この研究により、研究者はミクログリア細胞を容易に分離できるようになり、健康と疾患におけるその役割のより深い理解を促進します。
- 説明された技術は、神経炎症プロセスと関連する治療法のさらなる探求のための基礎を設定します。
- この方法から得られた洞察は、ミクログリアの機能と神経学的研究におけるその意味に関する知識を進歩させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Rapid isolation and characterization of primary mouse microglia enables high-fidelity modeling of neuroinflammatory mechanisms in early discovery and preclinical research. This protocol delivers high-purity microglial populations without extended culture, supporting robust target validation and functional screening in CNS drug discovery. The approach enhances predictive confidence for neuroimmune modulation strategies and accelerates translational insights into neurodegenerative and neurodevelopmental disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of microglial activation states and polarization in disease-relevant contexts.
- Supports mechanistic de-risking by providing primary cells for functional assays and pathway analysis.
- Facilitates rapid hypothesis testing on microglial responses to candidate therapeutics or environmental stimuli.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary microglia for quantitative in vitro assays, including drug screening and immunomodulation studies.
- Reduces variability and artifacts associated with prolonged culture, improving assay reproducibility and standardization.
- Enables scalable preparation of microglial samples for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for neuroinflammation, perinatal brain injury, and neurodegeneration.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling functional and phenotypic characterization of microglia.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers and therapeutic modulation of microglial activity.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-purity microglia for target validation, mechanistic studies, and functional screening.
- Discovery Biology: Delivers primary microglia for hypothesis-driven interrogation of neuroimmune pathways and cell-type specific responses.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative readouts for compound evaluation and immunomodulatory profiling.
- Analytics: Enables robust measurement of cell viability, apoptosis, and functional phenotypes post-stimulation.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo disease models for neuroinflammatory and neurodegenerative conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for microglial isolation applicable across CNS research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and functional de-risking.
- Operational Value: Streamlines microglial preparation, reducing time and resource requirements for assay development.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling rapid, reproducible functional data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS programs targeting microglial modulation.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in tissue dissection, density gradient centrifugation, and magnetic cell separation.
- Demands access to specialized instrumentation for gradient preparation and cell sorting.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various rodent models but may require optimization for different species or developmental stages.
- Yield and purity are sensitive to procedural precision, particularly during gradient layering and cell collection.
