特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

このプロトコルの全体的な目標は、げっ歯類から高純度のミクログリア集団を単離することです。この方法は、ミクログリア上の幹細胞の免疫調節特性の同定や薬物スクリーニングアッセイの実施など、神経情報分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、培養に長時間必要なく、高純度のミクログリア集団を分離できることです。

この手順を開始するには、はさみの先端を脊柱管の開口部に挿入し、耳道を横方向に切開します。次に、組織を吻に向かってゆっくりとスライドさせて頭蓋骨を露出させます。次に、矢状縫合糸に沿ってブレグマに向かって切開します。

次に、ハサミの先端をブレグマに挿入し、横方向に切開します。その後、頭蓋骨をそっと剥がして脳を露出させます。湾曲した鉗子を使用して、それを取り外し、5ミリリットルの滅菌容器に移します。

洗血ごとに5ミリリットルの氷冷した洗浄剤で2〜3回洗って、血液を取り除きます。層流フードに、5ミリリットルの容器の内容物を氷の上に置かれた小さなペトリ皿に入れます。滅菌メスの刃または滅菌はさみを使用して、小脳と嗅球を取り外してください。

次に、2つの半球を分離するために正中線をカットします。その後、髄膜層を、目に見える血管がある脳の表面に赤みを帯びた非常に薄い細胞層として特定します。皮質を傷つけないように注意しながら、細い鉗子で髄膜層を慎重に剥がします。

髄膜層が壊れた場合は、引き裂かれた破片が完全に取り除かれるまで剥がし続けます。次に、半球を氷上の新しい小さなシャーレに移し、洗浄剤で満たします。滅菌メスの刃で脳を細かく刻みます。

その後、100マイクロリットルのパパインと150マイクロリットルのDNase1を培地に加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。消化後、P1000ピペットを使用して組織を粉砕します。ティッシュペーパーが大きすぎてピペットに入ることができない場合は、滅菌ハサミを使用してピペットの先端を広げることを検討してください。

このプロセスでは、細胞の生存率を低下させる可能性があるため、培地に気泡を導入しないように注意してください。層流フードには、100マイクロメートルのセルストレーナーを備えた50ミリリットルの円錐形チューブを準備します。消化培地と脳片をストレーナーに注ぎます。

滅菌済みの3ミリリットル注射器のプランジャーを使用して、組織が見えなくなるまで粉砕動作で脳の断片を押し込みます。このプロセス全体を通して、フィルターを洗浄媒体で継続的に洗浄します。これにより、ストレーナーに閉じ込められた細胞が洗い流されます。

その後、シングルセル懸濁液を500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、密度勾配培地を10倍滅菌HBSSに9対1の比率で添加することにより、ストックアイソトニックPercollを調製します。DMEMでは30%SIP、one-X HBSSでは70%SIPとして勾配を準備します。

たとえば、10 ミリリットルの 30%SIP を準備するには、7 ミリリットルの DMEM に 3 ミリリットルの SIP を追加します。次に、円錐管から上清を吸引し、DMEM中の30%SIPの8ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁します。全容量を新しい15ミリリットルの円錐管に移します。

その後、トランスファーピペットに70%SIPを充填して70%SIP溶液を下敷きにし、トランスファーピペットを慎重に円錐形チューブの底に押し込みます。先端が底に近づいたら、内容物をトランスファーピペットにそっと押し込みます。続いて、セルを含むSIP層を650Gで遠心分離し、ブレーキゼロと加速4で室温で25分間遠心分離します。

70%Percoll層は、細心の注意を払って下敷きにする必要があります。この界面が破壊されると、細胞層内のミクログリアのトラップに深刻な影響を及ぼし、収量が大幅に減少する可能性があります。次に、チューブの上部から細胞の破片で培地を4ミリリットル吸引して、次のステップで単核細胞の除去を容易にします。

次に、ピペットチップを界面に向かって慎重に下げ、30/70密度勾配培地界面から単核細胞を単離します。曇ったインターフェースから約3ミリリットルを収集し、新しい15ミリリットルの円錐管に移します。その後、混合物を9ミリリットルのHBSSで希釈して、密度勾配媒体の除去を助けます。

単核細胞を含む希釈密度勾配培地界面を500 Gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、1ミリリットルの成長培地で再懸濁します。その後、再懸濁した細胞をトリパンブルーで染色し、血球計算盤を用いて細胞数を計数します。

このステップでは、収集した単核細胞を300 Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、磁気絶縁を妨げるため増殖培地を除去します。以前に得られたのと同じ細胞数を使用して、0.1〜2.5ミリリットルの容量範囲内で2%FBSと1ミリモルEDTAを含むPBS中の1ミリリットルあたり8個の核細胞に1回10個で再懸濁します。次に、PBS中の全量の有核細胞を、新鮮な5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに加えます。

次に、サンプル1ミリリットルあたり50マイクロリットルのCD11b PE標識試薬を追加します。光から保護して室温で15分間インキュベートします。その後、サンプル1ミリリットルあたり70マイクロリットルのセレクションカクテルを追加します。

光から保護して室温で15分間インキュベートします。その後、磁性粒子を5回以上ピペッティングして混合します。50μリットル/ミリリットルを試料に加え、光を避けて室温で10分間インキュベートします。

細胞混合物の総容量が2.5ミリリットル未満の場合は、この容量まで2%FBSを含むPBSと1ミリモルEDTAを補充し、2〜3回静かにピペッティングして混合します。次に、チューブを磁石に入れ、室温で5分間インキュベートします。1回の連続動作で、チューブを含む磁石を2〜3秒間完全に反転させて、上澄み液を注ぎます。

磁石を直立位置に戻し、チューブを磁石から取り外します。その後、手順を繰り返して残りの細胞をカラムから洗い流します。細胞を目的の増殖培地に再懸濁します。

収集容器の側面をすすぎ、チューブの側面から細胞を収集し、収量を最大化します。この図に見られるように、単離された一次ミクログリアは、球状の細胞体と明確な分岐構造を保持しています。以下は、単離されたミクログリアの代表的な事実プロットです。

アネキシンVとヨウ化プロピジウムの併用染色により、LPSによる刺激後のアポトーシス細胞、壊死細胞、または生細胞の分類が可能になり、hAECコンディショニング培地は、コントロールと比較してミクログリアのアポトーシスを大幅に減少させ、この細胞タイプに対する保護の形態を示唆しています。一度習得すると、このテクニックは正しく実行すれば6〜8時間で実行できます。

この方法を実行するときは、Percollのレイヤー化に細心の注意を払うことが重要です。このステップは歩留まりに最も大きな影響を与えるためです。この技術に続いて、食作用機能アッセイやニューロンとの共培養などの他の手順を使用して、初代ミクログリアで選択した細胞タイプの免疫調節特性に関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、この分野の研究者が周産期の脳損傷で原発性ミクログリアをどのように調節できるかを発見する道を開きました。

この技術の意味は、運動機能障害や認知機能障害につながる神経情報に関与することが知られている一次免疫細胞タイプの特性評価を可能にするため、周産期脳損傷の治療と診断にまで及びます。この方法は、脳性麻痺などの運動障害に関する洞察を得ることができますが、アルツハイマー病など、ミクログリアが病因に関与する他の疾患にも適用できます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、培養時間が長い後の潜在的なエピジェネティックな変化を回避するミクログリアの迅速な特性評価のための技術が必要だったときでした。

このビデオを見れば、ミクログリアの高純度集団を分離してダウンストリームの特性評価を行う方法について十分に理解できるはずです。