マウス脳血管の単離:マウス脳サンプルから無傷の血管を単離するためのプロトコル

脳血管は、密接に接続された内皮細胞の層に囲まれています。これらの細胞は、周皮細胞や星状細胞などの細胞成分とともに、周囲に基底膜を持っています。

周囲のニューロンやグリア細胞から脳血管を分離するには、均質化バッファーに浸したマウスの脳を含むビーカーを取ります。細かく刻む。脳組織を均質化して解離し、ニューロン、グリア細胞、脳血管を放出します。この治療法は、ニューロンを取り巻くミエリン鞘も破壊します。

ホモジネートをチューブに移し、遠心分離して容器をペレット化します。ニューロンやグリア細胞などの軽い成分は上清に残りますが、ミエリンはペレットの周囲に緻密な界面層を形成します。

上清を廃棄し、適切な密度勾配培地にミエリン層を付着した容器ペレットを再懸濁します。遠心分離機で血管をペレット化し、上清の上部に浮遊する脂肪が豊富なミエリンのバンドを取得します。使用済み培地と一緒にミエリンバンドを取り除き、ペレットを新しいバッファーに再懸濁します。

容器が通過できないほど小さいフィルターを含むフィルターアセンブリを使用して、原油容器の調製を濾します。フィルターを緩衝液の入った新しいビーカーに移します。濾紙をそっとこすって容器を取り外し、さらなる分析のために保管します。

スを使ってマウスの首から鼻にかけて皮膚を切開し、皮膚を後ろに引っ張ります。頭蓋骨をPBSで洗って汚染された毛を取り除き、嗅球の前方にある頭蓋骨にハサミを挿入します。はさみを開いて頭蓋骨を2つに分けて破り、へらで脳を取り除きます。

次に、側脳室から脈絡叢を解剖し、氷上の20ミリリットルのB1溶液を含む150ミリリットルのビーカーに脳を移します。次に、2 本のメスを使用して脳を 2 ミリメートルの組織片に激しく切り刻み、自動 Dounce ホモジナイザーを使用して、氷上で 400 rpm で 20 ストロークの間組織を均質化します。

容器を精製するには、ホモジネートを50ミリリットルのプラスチックチューブに移し、スイングローター遠心分離機で組織スラリーを回転させます。主にミエリンからなる大きな白い界面が血管ペレットの上部に形成されます。上清を捨てます。

20ミリリットルの氷冷B2溶液を加え、チューブを1分間激しく振ってください。2回目の遠心分離後、ミエリンは上清の表面に緻密な白い層を形成します。チューブをゆっくりと回転させて、B2溶液が注がれるときに壁に沿って流れるようにし、上清とともにミエリンを捨てます。

次に、吸収紙で包んだプラスチックピペットを使用して、容器ペレットに触れないように注意しながらチューブの壁から残留液を取り除き、氷の上でチューブを逆さまにします。次に、ペレットを1ミリリットルの氷冷B3溶液に再懸濁し、続いてさらに5ミリリットルのB3溶液を加え、血管が凝集体を形成しないように注意します。

次に、ベッカーフラスコの上に20ミクロンのナイロンメッシュフィルターを置き、10ミリリットルの氷冷B3溶液でフィルターを平衡化します。容器の準備をフィルターに注ぎ、さらに40ミリリットルの氷冷B3溶液で容器を注意深くすすいでください。

次に、清潔な鉗子を使用して、すぐにフィルターを30ミリリットルの新鮮なB3溶液の入ったビーカーに移し、軽く振ってフィルターから容器を取り付けます。ビーカーの中身を50ミリリットルのプラスチックチューブに注ぎます。次に、遠心分離後、ペレットを1ミリリットルの氷冷B3溶液に再懸濁します。