Name: マウスから脳ペリサイトを分離する高出力法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 学ぶマウス脳ペリサイトの高出力分離法。抗生物質不使用で高純度・高収率を実現し、神経疾患研究に有用なin vitro培養系を確立する手法を解説します。

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LTとFGは、プロジェクトSNOWBALLのためのEU共同プログラム -神経変性疾患研究(JPND)の枠組みの中でアジェンス・ナショナル・デ・ラ・レッチェルシュ(ANR、ANR-15-JPWG-0010)によって付与されました。

すべての実験は、動物の使用と取り扱いに関する研究所のガイドラインに従って行われました。フランスの法律に従って、アルトワ大学の動物施設は地元当局によって承認されています(参考:B62-498-5)。欧州連合法(指令2010/63/EU)に準拠して、すべての手続きは、地元の動物のケアと使用委員会(コミテ・デ・エティケ・アン・エクスペリメント・デュ・ノール・パ・ド・カレー、参考:C2EA 75)とフランス研究省(参照:201509011541122)によって承認されました。
1. ソリューションの作成
<ol><li>洗浄バッファーA(WBA)の500 mLを調製する:ハンクのバランス塩溶液(HBSS)で10 mM HEPES溶液。4°Cで保管してください。</li>
	<li>洗浄バッファーB(WBB)の500 mLを調製する:0.1%牛血清アルブミン(BSA)をHBSSで10 mM HEPES溶液で調製する。4°Cで保管してください。</li>
	<li>室温で溶液を一晩混合してWBAで30%デキストラン溶液の300 mLを調製する。使用前に30分間110°Cで溶液をオートクレーブします。オートクレーブ処理後、溶液を室温で2~3時間静置し、溶液を4°Cで保管します。</li>
	<li>冷間デキストラン溶液中に0.1%BSA溶液の100 mLを調製します。3~4分間激しく振り、4°Cで保存します。</li>
	<li>20%子牛血清、2mMグルタミン、50μg/mLゲンタマイシン、1%ビタミン、2%アミノ酸バーサルミディアムイーグル(BME)を基底DMEM培地に溶解し、4°Cで保存することにより、完全なダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)培養培地を調製します。使用前に1ng/mL塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を加えます。</li>
	<li>ペリサイト培養サプリメント(ペリサイト・メディアを備えた)と20%胎児子牛血清(FCS)をペリサイト培養基底媒体に加えて完全なペリサイト・メディアを調製し、4°Cで保存する。</li>
</ol>2. 脳組織の回復と髄腔の除去
<ol><li>一貫性を保つために、抽出のすべてのバッチで同じ年齢と同じ性別のマウスを使用します。病原体のない動物保護施設を使用し、水へのアドリビタムアクセスを提供します。動物の効率と最小限の使用を確保するために、組織材料の損失を避けてください。</li>
	<li>C57BL/6J、生後4~6週齢、雄マウス(ジャンヴィエ研究室、ル・ジェネスト・サン・アイル、フランス)を安楽死させる。</li>
	<li>無菌状態で脳組織を素早く切除し、組織への損傷を避ける。冷リン緩衝生理食塩酸(PBS)を40mLに慎重に配置します。</li>
	<li>冷たいPBSの脳組織をペトリ皿(100 mm x 15 mm)に移す。</li>
	<li>無菌のドライリントフリーワイプに脳組織を置き、湾曲した先端鉗子で小脳、線条体および後頭部神経を取り除きます。<ol>
<li>綿棒で目に見える髄を取り除く。脳組織を逆さまに置き、外側の光のストロークを使用して綿棒でローブを開きます。目に見える血管をすべて取り除く。</li>
		<li>メニンジフリー脳組織を15mLの冷たいWBBでペトリ皿(100mm x 15mm)に入れます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 均質化
<ol><li>組織をDounce組織グラインダーモルタルチューブに移し、鉗子でWBBの3-4 mLを追加します。</li>
	<li>55回「緩い」害虫で組織をミンチ。WBBで「緩い」害虫をすすいでください。今「タイト」害虫25回でスラリーをミンチ。</li>
	<li>スラリーを2つの50 mLチューブに均等に分割し、冷たい30%BSA-デキストランの1.5倍のボリュームを追加し、スラリーを混合するために精力的にチューブを振ります。</li>
</ol>4. 血管分画の分離
<ol><li>チューブを激しく振った後、3,000 x gと4 °Cで25分間チューブを遠心分離します。</li>
	<li>上清(最上のミエリン層と一緒に)を2本の新しいチューブに移し、3,000 x gと4 °Cで25分間チューブを遠心分離します。冷たいWBBを3mL加えて最初の遠心分離からペレットを保持します(ペレットを4°Cに保ちます)。</li>
	<li>ステップ4.2を繰り返し、2番目の遠心分離からペレットを慎重に保存します。</li>
	<li>ステップ4.3からチューブから組織破片でデキストランとミエリンを廃棄します。冷たいWBBでペレットを保存します。</li>
	<li>ステップ4.1からチューブ1とチューブ2の内容物をプールし、冷たいWBBで10 mLの最終容積まで作ります。</li>
	<li>ステップ 4.2 およびステップ 4.3 のチューブに対してこのステップを繰り返します。 注:最後に、3つの遠心分離から3つのチューブがあります。</li>
	<li>ペレットの目に見える塊が残らないまで、10 mLピペットを使用して6つの上下ストロークでペレットを解解分解します。</li>
	<li>真空フィルターアセンブリとナイロンメッシュフィルターの助けを借りて、各チューブのセルサスペンションをフィルタリングします。 メモ:このろ過ステップは、メッシュフィルタを介してより長い/大きな容器を除去するために重要です。</li>
	<li>室温でWBBの平らな先端鉗子またはスクレーパーの助けを借りてフィルターを掻くことによって毛細血管を回復し、再中断する。より多くの毛細血管を回復するために新鮮なフィルターで懸濁液をフィルター</li>
	<li>濾液を2本のチューブに均等に分割し、1,000 x gとRTで7分間遠心分離機を分割します。 注:この遠心分離ステップ中に、酵素溶液を準備します。使用する動物の数に応じて必要なWBBの体積を決定します(材料表を参照)。DNase 1 と 1x の DNase 1 および 1x のトシル L-リシル クロロメタン塩酸塩 (TLCK) を WBB に追加し、37 °C に事前に温めます。</li>
	<li>酵素で事前に温めたWBBでステップ4.10からペレットを1本のチューブに集めます。あらかじめ温めた1xコラゲアーゼ/ディスパーゼを加えます。正確に33分間、37°Cの揺れテーブル水浴にチューブを置きます。</li>
	<li>30 mL のコールド WBB を加えて酵素反応を停止します。1,000 x gと RT で 7 分間の懸濁液を遠心分離します。</li>
	<li>上清を慎重に廃棄し、10 mLピペットを使用して6上下ストロークでWBBのペレットを解解分解します。この手順は、厳密で比較的高速である必要があります。</li>
	<li>1,000 x gと RT で 7 分間の懸濁液を遠心分離します。 メモ:このステップでは、培養皿からコーティングを捨て、室温でDMEMで1回洗いす。RTで少なくとも1時間の培養皿をコートする。</li>
	<li>ステップ4.14で得られたチューブから上清を廃棄し、新しい完全なDMEM媒体でペレットを解離し、6ウェルプレートの9ウェル(それぞれ1ウェルの9.6cm2)で細胞(0日目、P0)をプレートする。</li>
</ol>5. 脳ペリサイトの増殖
<ol><li>細胞培養物を滅菌インキュベーターで37°Cおよび5%CO2で維持します。24時間後(1日目)の培養媒体を、破片を慎重に取り除いて細胞をめっきして交換してください。1日目以降、48時間ごとにカルチャーメディアを変更します。</li>
	<li>細胞培養を少なくとも7〜8日間観察する。この時間までに、内皮一層の上部の細胞増殖は観察可能であるべきである。</li>
	<li>8~10日目に細胞を通過させる(合流性に応じて)ペリサイト培養培地中のゼラチン被覆培養プレート上の通路1(P1)に。2 日ごとにカルチャ メディアを変更します。細胞を6~7日間観察します。細胞は、17日目に通路2(P2)に再び連続して分割される[および24日目の通路3(P3)は必要な場合のみ]、ゼラチン被覆板中のペリサイト培地で増殖する。 注:細胞は、ほぼ80-90%の合流性で実験/観察の準備ができている必要があります。</li>
</ol>

<ol><li>Azevedo, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+modulate+myelination+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pericytes modulate myelination in the central nervous system.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (8), 5523-5529 (2018).</li>
<li>Hall, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+pericytes+regulate+cerebral+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease.</a> Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).</li>
<li>Gianni-Barrera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-BB+regulates+splitting+angiogenesis+in+skeletal+muscle+by+limiting+VEGF-induced+endothelial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">PDGF-BB regulates splitting angiogenesis in skeletal muscle by limiting VEGF-induced endothelial proliferation.</a> Angiogenesis. 21 (4), 883-900 (2018).</li>
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<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor-B+enhances+glioma+angiogenesis+by+stimulating+vascular+endothelial+growth+factor+expression+in+tumor+endothelia+and+by+promoting+pericyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor-B enhances glioma angiogenesis by stimulating vascular endothelial growth factor expression in tumor endothelia and by promoting pericyte recruitment.</a> American Journal of Pathology. 162 (4), 1083-1093 (2003).</li>
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<li>Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+simple+method+for+culturing+pericytes+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain.</a> Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD146+coordinates+brain+endothelial+cell-pericyte+communication+for+blood-brain+barrier+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD146 coordinates brain endothelial cell-pericyte communication for blood-brain barrier development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (36), 7622-7631 (2017).</li>
<li>Thomsen, M. S., Birkelund, S., Burkhart, A., Stensballe, A., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+deposition+of+basement+membrane+proteins+by+primary+brain+capillary+endothelial+cells+in+a+murine+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and deposition of basement membrane proteins by primary brain capillary endothelial cells in a murine model of the blood-brain barrier.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (5), 741-754 (2017).</li>
<li>Yamazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Cell+Senescence+Contributes+to+Blood-Brain+Barrier+Breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Vascular Cell Senescence Contributes to Blood-Brain Barrier Breakdown.</a> Stroke. 47 (4), 1068-1077 (2016).</li>
<li>Crouch, E. E., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+isolation+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+mouse+brain+microregions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions.</a> Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).</li>
<li>Ozerdem, U., Grako, K. A., Dahlin-Huppe, K., Monosov, E., Stallcup, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+proteoglycan+is+expressed+exclusively+by+mural+cells+during+vascular+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">NG2 proteoglycan is expressed exclusively by mural cells during vascular morphogenesis.</a> Developmental Dynamics. 222 (2), 218-227 (2001).</li>
<li>Stallcup, W. B., You, W. K., Kucharova, K., Cejudo-Martin, P., Yotsumoto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+Proteoglycan-Dependent+Contributions+of+Pericytes+and+Macrophages+to+Brain+Tumor+Vascularization+and+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">NG2 Proteoglycan-Dependent Contributions of Pericytes and Macrophages to Brain Tumor Vascularization and Progression.</a> Microcirculation. 23 (2), 122-133 (2016).</li>
<li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

脳のペリサイトは、NVUの不可欠な部分であり、BBB24の誘導および維持に積極的な役割を果たしている。同様に、異なる神経変性疾患および血管病理におけるこれらの細胞の役割は興味深い。したがって、効率的な高出力プライマリペリサイト細胞モデルは、インビトロ研究のための効率的なプラットフォームを提供します。
原発性ペリサイトの単離のために提案されている様々なプロトコルがあります(図4)。Tigges et al.17は髄質を有する皮質組織を含む方法を示唆した。このアプローチは、6匹のマウス(パパイン/DNase酵素による37°、70分の消化)からの組織の圧入、続いて21Gおよび18G針を介した崩壊ステップである。このプロトコルは、少なくとも2つのコラーゲンIが6ウェルプレートのウェルをコーティングした1ステップ分離(22%BSA/PBS溶液中の遠心分離)を示唆している。細胞は、ペリサイト増殖を促進するために通過細胞のためのペリサイト増殖培地(PGM)の3以降の通過まで内皮細胞増殖培地(ECGM)に維持される。別の同様のアプローチでは、Chen et al.18は、37°Cで90分間コラゲナーゼ/DNaseで組織を殺菌カミソリブレードと組織消化でダイシングすることにより組織解離を提案した。細胞のワンステップ分離(22%BSAで遠心分離)に続いて、ミエリン層を除去し、ペレットをECGMで2回洗浄する。マイクロ容器は、6ウェルプレートをコーティングしたコラーゲン3ウェルにめっきされています。合流に達した後、細胞は2回通過し、後にPGMで維持される。結局、細胞が3の比率で渡された場合、プロトコルの開始時に10匹のマウスを使用した場合にのみ、6ウェルプレートの27ウェルを得ることができます。
Thomsenらにおいて、著者らは2段階酵素消化19を介して脳ペリサイトの単離を示唆している。髄細か月と白物を取り除き、脳のサンプルを小さく切る。組織片は、20%BSAで分離の1ステップに続いて、37°Cで75分間コラゲナーゼ/DNase Iで最初の酵素反応を受ける。ペレットを回収し、37°Cで50分間コラゲナーゼ/ディスパーゼ/DNase Iでさらに消化する。このステップの後に、33%パーコール勾配でマイクロ容器分離が行われ、さらに一度洗浄される。マイクロ容器は、コラーゲンIV/フィブロネクチンコーティングされた35ミリメートルの皿に播種されています。ペリサイトの増殖は、10日間DMEMにおいて10%FCSおよび硫酸ゲンタマイシンによって支持される。別の2段階酵素消化アプローチでは、山崎らから、低温DMEM20における切除組織のミンチを示唆する。最初の酵素反応では、サンプルをコラゲナーゼ/DNase Iで37°Cで75分間処理する。1段階遠心分離の後、ペレットは再び一度洗浄され、2番目の酵素反応は37°Cで60分間コラゲナーゼ/ディスパスで開始される。ワンステップ分離の後、ペレットを再懸濁し、22%BSA溶液で遠心分離する。最後に、微小血管ペレットを再懸濁し、6ウェルプレートにめっきする。5つのマウス脳の場合、6ウェルプレートの1ウェルをめっきすることができます。ペリサイトを得るために、内皮培養物は、マウス脳内皮細胞(mBEC)培地IIに維持されながら、スライスを通過させられる。クラウチおよびドエッチ20は、FACSによるペリサイト精製法を示唆する。マウス脳の皮質および心室-心室-心室-心室-心室領域からの組織サンプルは、微小解剖され、メスで十分に細かくミンチされる。コラゲナーゼ/ディスパーゼ酵素インキュベーションを37°Cで30分間インキュベートした後、消化された組織をミエリンから分離し、22%v/vパーコール溶液で遠心分離した破片。細胞懸濁液は、FACS分析および選別のために蛍光結合抗体でインキュベートされる。選別された細胞は、24ウェルプレートのコラーゲンコーティングされたウェルでめっきされる。1つの皮質は、24ウェルプレートの1ウェルで1つのめっきに十分な細胞を生み出すことを示唆している。
たとえ生産的であっても、これらの方法には、単一のバッチ分離のための動物の数が多い場合から、非常に限られた量の出力まで、いくつかの制限が伴います。
この提案されたプロトコルの開発中に、我々は高出力を得することに成功しました:わずか10匹のマウスから6ウェルプレートの9ウェル。この端に、髄腔の除去は組織からの大きな血管の1段階の除去を保障する。Dounce組織グラインダーは、脳などの軟組織に適しています。また、緩い害虫によるサンプル還元、タイトな害虫との均質化を保証し、不必要な細胞損傷を防ぎます。一次細胞培養プロトコルの主な目的の1つは、組織の最小限の無駄と脳血管系の拡張検索です。提示されたプロトコルでは、これはデキストランBSA注入組織ホモジネートの反復遠心分離によって達成される。3段階の遠心分離アプローチは、組織ホモジネートから大量の血管系を回収するのに役立ちます。これはマイクロ容器の3倍の高められた回復を提供する。分離後、濾過は、平滑筋細胞関連大血管の排除を支持する次の重要なステップです。前に述べたように、酵素消化のために異なる酵素の組み合わせが提案されている。DNaseとコラゲナーゼ/ディスアーゼは、細胞の塊を減らし、単一細胞をそれぞれ単一の細胞を分離するために使用されますが、このような侵襲的な環境で細胞死を防ぐことが非常に重要であり、それによって最終的な収率が増加するTLCKによって防止されます。最初は、最初の通路は内皮単層を成長させ、後に単層上の付着したペリサイトの増殖を支持する。一次内皮細胞の生存率は通過時に減少するため、ペリサイト検索の確率を高める。さらに、このプロトコルは内皮細胞汚染の回避を保障する別のパセリジングを採用する。なお、P2からの細胞数が多いほど、細胞のさらなる通過への依存性が低下する。さらに、平滑筋細胞によってペリサイトの増殖が追い越される可能性を減らし、はるかに高い速度で増殖する。
より高い出力を達成するためには、温度と時間に関して重要かつ正確に実行する必要があるいくつかのステップがあります。BSA-デキストランにホモジネートした組織の混合は速いはずです。遠心分離ステップ後のペレット解離は、細胞死を防ぐために迅速であるべきです。さらに、酵素消化の33分は精密と注意を払って行われるべきである。このプロトコルの制限の1つは、内皮単層が成長し、ペリサイトの成長をさらに促進することが許される7〜8日間の持続時間である。明らかに、マイクロ血管の単離はbtterであり、単層の成長はより速く、したがってペリサイトの数が増加する。ペリサイトの増殖をさらにサポートするのに十分な数の微小血管分率を確保するために、各抽出で10未満のマウスを使用しないことをお勧めします。前述の点を注意深く従えば、脳ペリサイト培養に所望の細胞密度を容易に達成することができる。
in vitroモデルは、神経疾患中のNVUの他の細胞間の病態生理学的関連性およびコミュニケーションに関するより多くの情報を得るために誘導体モデルの開発のための実行可能なプラットフォームを提供する。単離されたペリサイトは、バイセル細胞培養(内皮またはグリア細胞を有する)および三細胞培養(内皮およびグリア細胞)モデルに組み込むことができる。これらのモデルの開発については、ここでは説明していません。結論として、このプロトコルは、より高い出力を有する一次細胞の単離のための1つのアプローチと、脳ペリサイト生物学に関連する体外研究のためのより良いプラットフォームを提供する。

脳ペリサイトは、血液脳関門(BBB)、グリア細胞、細胞外マトリックスおよびニューロンの脳内皮細胞を有する機能単位を含む神経血管ユニット(NVU)の必須成分である。ペリサイトは、分子および細胞情報の交換のためのインターフェースの1つとして機能する中枢神経系(CNS)の調節された機能に不可欠な部分です。
脳のペリサイトは、脳マイクロ血管のアブラル側に埋め込まれており、1を確立し、2 BBB生理学を維持するために不可欠です。いくつかの最近の研究はまた、血管新生3および血管成熟4における脳ペリサイトの役割を強調している、内皮形態形成5および生存6、および脳コレステロール代謝を制御する。重要なことに、これらのプロセスのいずれにおいても調節障害は、神経変性疾患の病因的特徴である。
実際、ペリサイトは、正常なBBB機能といくつかの神経疾患の進行に対するその保護のための機能的な必要性である。変性生理学およびペリサイトの喪失は、アルツハイマー病8の進行における共通分母であり、白質機能障害9時の神経喪失、多発性硬化症10、敗血症性脳症11、急性期虚血性脳卒中12および他の神経疾患における。ペリサイトはまた、腫瘍転移13に役立つ。興味深いことに、ペリサイトはまた、神経学的外傷および障害の後に救助の役割を示すことが示されている:脳1のレミエリ化において、虚血性脳卒中、脊髄損傷14および血管新生を促進する。神経学的外傷および障害の病態生理学的症状を補強するペリサイトの感受性は、それら潜在的な治療標的16となる。
BBBのペリサイトのインビトロ研究モデルは、広範な研究を行うための重要なツールです。これらのモデルはBBBのより働くモデルを表すことによってより精巧な研究のためのプラットホームを提供する。例えば、これらのモデルは、ペリサイト内およびNVUの他の細胞型の間で細胞生理学を理解するために使用することができる。また、in vitroモデルは、新薬や分子がペリサイトに及ぼす薬理学的影響をテストするための直接的な調査ツールです。これらのモデルはまた、神経疾患に関連するペリサイトの病態生理学的役割を理解するために使用することができる。それにもかかわらず、in vitroモデルの開発は、実験的な自由を可能にするために出力を増加する必要があります。これらのモデルは、簡単かつ迅速であり、使用される実験動物の数を減らす必要があります。さらに、このようなモデルを二重および三重細胞培養モデルに開発する能力が望ましい。
開発されたプロトコルは数多くあります。Tigges et al.17,Chen et al.18,Thomsen et al.19,Yamazaki et al.20, クラウチとドエッチ21によって提案されたプロトコルは、ほとんどの必需品を満たす称賛すべきアプローチである。これらの方法はすべて効果的な結果をもたらすが、多数の実験動物への依存は、これらのプロトコルの共通分母のままである。そのため、ペリサイトを最大限の効率で単離・精製できる高出力法の開発が必須となる。このプロトコルでは、第2の通路の後に得られた細胞の純度が、いくつかのペリサイトマーカーで検証される。ペリサイト17の古典的マーカーとして用いられている血小板由来成長因子受容体β(PDGFR-β)と、ペリサイト媒介血管形態形成22及び血管化23のマーカーであるNG2(ニューロングリア抗原2)について確認した。また、ペリサイト17、18で発現する分子の1つとして報告されている分化146(CD146)のクラスターについても確認した。
ここでは、マウス(野生型またはトランスジェニック)からの一次ペリサイトの抽出のためのプロトコルを提示し、前述のすべての要件を高出力で満たす。原発性脳ペリサイトに対して抗生物質および免疫配管遊離選択ベースの増殖方法を採用し、インビトロ研究を行うための効率的なモデルとなる。

<table><tbody><tr><td>アミノ酸 BME</td><td>Sigma</td><td>B-6766</td> は <td>4°C で保存します。</td></tr><tr><td>基礎DMEM培地</td><td>Invitrogen</td><td>316000083</td><td>4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>基本的な線維芽細胞成長因子</td><td>シグマ</td><td>F-0291-20</td><td>°Cで保存。</td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ</td><td>A-8412</td>は<td>4°Cで保管します。</td></tr><tr><td>コラゲナーゼディスパーゼ</td><td>Sigma</td><td>10269638001</td><td>滅菌PBS-CMFに10倍ストック溶液を調製します。0.22 &mu;mシリンジフィルターと-20°Cで保存します注:プロトコルの酵素消化ステップの場合、抽出用の10匹のマウスのすべてのセットについて、300 μ;10xコラゲナーゼディスパーゼのLが必要です。</td></tr><tr><td>デキストラン</td><td>Sigma</td><td>31398</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>11284932001</td><td>1000 mg を 10 ml 滅菌水に溶解して 1000X ストック溶液を調製し、-20°C で保存します。</td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマ</td><td>G-2500</td><td>滅菌PBS-CMF(8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、0.2 g/L KH2PO4、2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O)、pH 7.4)で0.2%ゼラチン溶液を作製し、ワーキングコーティングを調製します。溶液を120°Cで最低20分間オートクレーブします。Cおよび室温で保存してください。培養皿は、4°Cで少なくとも4時間コーティングする必要があります。</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Biochrom AG</td><td>A-2712</td><td>4°Cで保存</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>メルク</td><td>I.00289-20</td><td>°Cで保管。</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H-8264</td><td>4°Cで保存</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-0887</td><td>4°Cで保存</td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>BDバイオコート</td><td>354230</td> 最終<td>濃度が85 & microになるように、冷たいDMEMでストックを1:48の比率で希釈することにより、マトリゲルの作業コーティング溶液を準備します。g / cm2です。細胞培養皿は、室温で少なくとも1時間コーティングする必要があります。</td></tr><tr><td>Pericyte Medium-mouse</td><td>Sciencell研究所</td><td>1231</td><td>4°Cで保存</td></tr><tr><td>トシルリジンクロロメチルケトン</td><td>シグマ</td><td>T-7254</td><td>WBAの10.88 mLに16 mgを溶解してWBAの1000倍ストック溶液を調製し、4 mM溶液を作り、4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>ビタミン</td><td>Sigma</td><td>B-6891</td>は<td>-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>機器 要件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ろ過ツール</td><td>セファー、ナイロンメッシュ、60ミクロンの気孔率</td><td></td><td></td></tr><tr><td>実験装置</td><td>スイングバケットローター遠心分離機</td><td></td><td></td></tr><tr><td>攪拌機</td><td></td><td></td><td></td>付きウォーターバス</tr><tr><td>層流フード:BSL2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス製品(すべての部品は熱になります滅菌済み)</td><td>ガラス乳棒</td><td></td><td></td>付きオンスティッシュグラインダー</tr><tr><td>乳棒I:0.0035 - 0.0065インチ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乳棒II:0.0010 - 0.0030インチ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>粗い多孔性フリットガラスフィルターサポートベース</td><td></td><td></td><td></td>付き真空フィルターアセンブリ</tr><tr><td>外科解剖ツール(熱滅菌するすべてのコンポーネント)</td><td>鉗子、はさみ、ブンゼンバーナー、綿綿棒, ゲージ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスから脳ペリサイトを分離する高出力法

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

近年、脳ペリサイトは血管生物学や病理学の広範な研究の焦点となっています。血液脳関門形成と生理学におけるペリサイトの重要性は現在実証されているが、その分子基盤はほとんど未知のままである。神経疾患における脳ペリサイトの病態生理学的役割は興味深く、非常に重要であるため、in vitroモデルは十分に適切であるだけでなく、これらの研究のために異なる技術を組み込むことができる。脳ペリサイトの抽出のためのin vitroモデルとしていくつかの方法が提案されているが、高出力の抗生物質フリープロトコルが望ましい。最も重要なことは、抽出あたりの出力を増加させる方法は、より多くの動物の使用量を減らす。
ここでは、十分に高い出力で脳ペリサイトを抽出するための簡単かつ効率的な方法を提案する。マウス脳組織ホモジネートは、組織破片と微小血管ペレットの分離のためのBSA-デキストラン溶液と混合される。3段階の分離を提案し、続いて濾過を行い、マイクロ容器に豊富な濾液を得る。この方法により、10匹のマウスから得られる微小血管断片の量は、6ウェルプレートの種子9ウェル(それぞれ9.6cm2)に十分である。最も興味深いことに、このプロトコルを使用すると、ユーザは通路2で27ペリサイトリッチウェル(それぞれ9.6cm2)を得ることができます。ペリサイト培養物の純度は、古典的なペリサイトマーカーの発現によって確認される:NG2、PDGFR-βおよびCD146。この方法は、ペリサイトに関する生理学的および病態生理学的研究のための効率的かつ実現可能なin vitroツールを示す。

このプロトコル(図1)は、P0での播種時に9つのウェル(6ウェルプレート)を効率的に得られます(図2A(P0:Day 1))。
P0からP2まで、内皮細胞(白矢印で示される)およびペリサイトの徐々な増加(黒い矢印で示される)を観察できる特定の形態学的特徴があります。P0では、微小血管から発達する細長い内皮細胞が存在する(図2A、P0:3日目)が存在する一方、このような細長い細胞の存在量はP1では減少し、P2では存在しない。逆に、ペリサイトはP2に豊富に存在する四角形の細胞として現れる(図2A、P2:18日目)。
P2におけるペリサイト培養の純度を確認するために、定量PCR(図2B)、免疫細胞化学(図2C)、ウェスタンブロット(図3)を用いて、NG2、CD146、PDGFR-βのペリサイトマーカーとしての発現を確認した。P2のペリサイトは、全マウス脳(Ms Br)抽出物における発現と比較した場合、CD146、NG2およびPDGFR-βのより高いレベルを発現する。対照として、内皮マーカーオクルージンおよびCD31の発現、アストロサイトマーカーグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)およびミクログリアマーカーCD11bもP2に存在しない観察された。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60588/60588fig01.jpg"> 図 1: プロトコルの概要このアウトラインは、ガラス害虫グラインダーとの組織崩壊から始まり、デキストランと濾過における3段階の分離から始まるペリサイト抽出のための重要なステップを表しています。このプロトコルは、33分の酵素消化ステップを採用する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60588/60588fig1alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60588/60588fig2a.jpg"> 図2:細胞形態とマーカー発現(A)増殖のP0、P1およびP2段階におけるペリサイトの位相コントラスト画像。P0の豊富な内皮細胞は白い矢印で示される。彼らの数はP1で減少し、彼らはP2で消えました。ペリサイトは黒い矢印で示される。(B) P1およびマウス脳(Ms Br)試料中のペリサイトを有するP2のペリサイトにおけるPCRによるCD146、NG2およびPDGFR-β発現の解析(C)CD146、PDGFR-βおよび、NG2の陽性免疫染色を示すP2におけるペリサイトの代表的な画像。スケールバー:50μm(20倍倍)と20μm(40倍倍)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60588/60588fig2alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60588/60588fig03.jpg"> 図3:細胞培養物の代表的な純度。P146、PDGFR-β、NG2、オククルディン、GFAP、CD31、CD11bおよびチューブリン発現の分析は、P2およびマウス脳(Ms Br)サンプルにおけるペリサイトにおけるウェスタンブロッティングによる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60588/60588fig3alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60588/60588fig4a.jpg"> 図4:組織崩壊、精製、濃縮および酵素消化の異なる方法の代表的な比較。公開された各プロトコルは、各プロトコルに使用される動物の数に関する指標と要約されます。出力は、シード時に得られる井戸の数に関しても示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60588/60588fig4alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

我々は、マウス脳ペリサイトの抽出のためのプロトコルを提示する。抗生物質フリー濃縮指向のペリサイト抽出に基づいて、このプロトコルは、高純度と高収率を提供するインビトロ研究のための貴重なツールであり、したがって、使用される実験動物の数を減少させる。

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

近年、脳の脳の機能は神経疾患や脳機能に明らかになってきた。したがって、これらの細胞に対する信頼性の高い培養方法の開発が不可欠である。マウス脳のペリサイトの抽出のための私達のプロトコルは、体外研究のための信頼性の高いツールを表し、高純度および細胞収量のペリシテを提供するため。アヌプリヤ・メヘラとの手順を実証することは、私の研究室の技術者ルーシー・デフックです。特定の病原体を含まない4〜6週齢の雄C57BL/6マウスから無菌乾燥糸状拭きに脳を配置し、湾曲した先端鉗子を使用して小脳、線条体、後頭部神経を除去することから始めます。綿棒を使用して、目に見える髄のすべてを取り除き、脳組織を逆さまにします。軽い外側のストロークでローブを開き、目に見える血管をすべて取り除きます。その後、15ミリリットルの冷たい洗浄バッファーを含む100ミリメートルのペトリ皿に髄歯を含むペトリ皿に入れ、組織を均質化B.To、脳サンプルをDounce組織グラインダーモルタルチューブに移し、3〜4ミリリットルの洗浄バッファーBをチューブに加える。緩い害虫を使用して組織を55回ミンチし、洗浄バッファーBで害虫を洗い流し、タイトな害虫で組織スラリーを25回ミンチします。均質化の終わりに、2つの50ミリリットルチューブ間のスラリーを均等にアリコートし、冷たい30%ウシ血清アルブミンデキストランの1.5倍の体積を加える。その後、スラリーを混ぜるためにチューブを激しく振ります。血管分画を単離するために、遠心分離によって細胞を沈降させ、上清を2つの新しい管に移す。ペレットを洗浄バッファー B に氷の上に保管します。氷上の冷たい洗浄バッファーBの3ミリリットルにペレットを再懸濁します。収穫した上清を遠心分離し、さらにこのステップを繰り返します。上澄み液を捨ててペレットを3ミリリットルの洗浄バッファーB.に再懸濁させ、プールされた細胞懸濁液の最終容積を新鮮な冷たい洗浄バッファーBで10ミリリットルに持ち込み、さらにペレットの残りの塊が見えないまで10ミリメートルのピペットで細胞を6回解離し、真空フィルターとナイロンメッシュサスペンションを使用します。ペトリ皿にストレーナーを置き、新鮮な洗浄バッファーBでメッシュをクリアし、毛細血管を回復するために削ります。次に、新しいフィルターで 2 回目の濾過を行います。2つのチューブ間で濾液を均等に分割し、遠心分離によって細胞を収集します。上清を捨てた後、ペレットを酵素と共に温めた洗浄バッファーBを含む単一のチューブにプールし、プレウォームドコラゲナーゼ/ディスパーゼをチューブに加えます。冷たい洗浄バッファーBの30ミリリットルで反応を停止する前に、正確に37°Cで33分間振るテーブル水浴にチューブを置き、遠心分離によって細胞を収集し、慎重に上清を捨てます。洗浄バッファーB内のペレットを6回迅速に慎重に再懸濁し、再度懸濁液を遠心分離する。上清を捨てた後、ペレットを完全なDMEM培地の18ミリリットルで再懸濁し、6ウェルプレートをコーティングした3つのマトリゲルの9つの井戸に完全なDMEMで2ミリリットルの細胞懸濁液を種付けします。細胞培養液を無菌37°C5%の二酸化炭素インキュベーターに24時間入れてから、各ウェルから破片を慎重に取り除き、新鮮なDMEM培地を加えます。48時間後、48時間ごとに各ウェルで培地を交換します。細胞が100%合流に達した8日目から10日目に、新しいゼラチンコーティングされた6ウェルプレートにペリサイト培養培地中の細胞を通過させ、さらに6〜7日間細胞培養器に戻し、モニタリングを行う。その後、17日目に再び細胞をペリサイト培地で新しいゼラチンコーティングプレートに分割する。通路0から2に、内皮細胞とその後の徐々に増加する前皮細胞を同定することができる特定の形態学的特徴がある。通路ゼロ培養では、微細血管から発達する細長い内皮細胞が豊富に存在する。この量は、通過1の後に減少し、通過2の後に不在です。それどころか、初期培養では四国間細胞としては、四角四方形細胞として現れ、継いで2個ほどに豊富になる。NG2、CD146、およびPDGFRベータの発現の評価は、定量PCR、免疫細胞化学、およびウェスタンブロットによるペリサイト培養の純度を評価するために使用することができる。酵素消化は、プロトコルの成功のための重要なステップです。酵素濃度とインキュベーション時間を厳重に監視してください。

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Research

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