phiC31インテグラーゼ媒介部位特異的導入遺伝子インテグレーション:ハマダラカベクターへの部位特異的導入遺伝子インテグレーションのためのマイクロインジェクション技術

phiC31インテグラーゼは、導入遺伝子(外来遺伝子)の宿主ゲノムへの部位特異的組換えを触媒するファージ由来の組換え酵素です。Anopheles宿主への導入遺伝子の組み込みには、適切なバッファー中のAnopheles胚から始めます。

Anophelesゲノムは、遺伝子統合のための付着部位と視覚的選択のためのシアン蛍光マーカーで事前に設計されています。次に、目的の導入遺伝子カーゴ、付着部位、赤色蛍光マーカー、およびプラスミド骨格成分を運ぶ少量のドナープラスミドをバイアルに加えます。次に、遺伝子をコードするインテグラーゼを運ぶヘルパープラスミドの最適な容量を追加します。次に、プラスミド混合物をマイクロシリンジにロードします。

胚細胞の起源部位である胚の後極にプラスミドをそっと注入すると、細胞質がわずかに動きます。胚の中に入ると、ヘルパープラスミドはインテグラーゼ酵素の合成を開始します。

インテグラーゼ酵素は、ドナープラスミドと宿主ゲノムの間の部位特異的組換えを媒介します。したがって、導入遺伝子とドナープラスミドからの赤色蛍光マーカーは、アノフェレスゲノムの組換え付着部位内に組み込まれます。その後、注入された胚を生理学的条件下で孵化させ、断続的に渦巻きさせます。

数日以内に、胚は幼虫に孵化します。蛍光顕微鏡下では、遺伝子の組み込みに成功したアノフェレスの幼虫は、宿主ゲノムをマークするシアン蛍光と、ドナープラスミドからの導入遺伝子をマークする赤色蛍光の両方を発現します。

エンドトキシンフリーの精製キットを使用して、ドナープラスミドとヘルパープラスミドを精製します。目的の導入遺伝子を運ぶattBタグ付きドナープラスミドとインテグラーゼを運ぶヘルパープラスミドを組み合わせて、ドナープラスミドのマイクロリットルあたり350ナノグラム、およびヘルパープラスミドのマイクロリットルあたり150ナノグラムの最終濃度の混合物を取得します。

冷100%エタノールの2.5容量に0.1体積の3モル酢酸ナトリウムを加えてDNAを沈殿させます。そして、ボルテックス。白い沈殿物がすぐに見えるはずです。ペレットを洗浄し、注入バッファーに再懸濁して、マイクロリットルあたり500ナノグラムの総最終濃度に達します。次に、それぞれ10〜15マイクロリットルのアリコートを準備し、摂氏マイナス20度で保管します。

マイクロインジェクションの72時間前に、目的のドッキングラインから生後4〜7日の蚊と野生型の蚊に血液を供給します。25ミリモルの塩化ナトリウムで、胚の後極を45度の角度で標的にすることにより、Anopheles gambiae胚マイクロインジェクションを実行します。

ロカーボンオイルで、後極を30度の角度でターゲットにすることにより、Anopheles stephensi胚のマイクロインジェクションを実行します。注射後すぐに、卵を滅菌蒸留水で満たされたシャーレに移し、昆虫の状態に戻します。孵化したら、G₀幼虫を毎日塩蒸留水を入れたトレイに移し、蛹に戻します。