開発マウス内耳への遺伝子導入によるエレクトロポレーション

ジェーンは、オレゴン健康科学大学オレゴン聴覚研究センターのインビボ、エレクトロポレーション、リン・ワン、ハン・ジャン、ジョン・バーガンディによって、発達中のマウス内耳に移されました。私の名前はジョン・バーガンディです。私の研究室は、オレゴン健康科学大学のオレゴン聴覚研究センターにあります。

私の名前はアンです。私はジョンズ研究室のポスターです。私はAngで、同じくJohns研究室で研究助手をしています。

私たちのプレゼンテーションは4つの部分に分かれています。1つ目は腹側開腹術です。ナトリウムペン、バルビタールベースの麻酔、麻酔の妥当性をテストする方法、角膜保護、手術部位の準備、消毒マウス生存手術データシート、手術スイートの皮膚と腹壁を通る腹側正中線切開、および子宮角の外部化を実演します。

パート2は経子宮マイクロインジェクションです。胚、胚、胚、配向変更、マイクロインジェクション、ピペット、製造、および胚11.5日目と胚12.5日目のオーチスへのマイクロインジェクションのトランスイルミネーションを実証します。パート3はin vivoエレクトロポレーションです。

パドルスタイルの電極配置と、胚の11.5日目マウスOアシストのエレクトロポレーションを実演します。パート 4 は代表的な結果です。我々は、後期胚および出生後早期蝸牛におけるGFPの発現を示す。

これは、胚の11.5日目パート1腹側開腹術での発現プラスミドを用いたOtisのin vivoエレクトロポレーションの結果です。首の後ろの皮膚、尻尾、左後肢を掴むことでダムをしっかりと保持します。ペントバルビタールナトリウムベースの麻酔薬の腹腔内注射は、腹部を70%エタノールで綿棒した後に投与されます。

マウスは、麻酔薬が作用するのを待つために、ホームケージ内に4〜5分間置かれます。足と尾のピンチは、麻酔の適切性を評価するために使用されます。このダムはテールピンチに反応してシャッターを切り、有害な刺激に反応しなくなるまでさらに2分かかります。

滅菌眼軟膏を眼に塗布して、角膜を乾燥から保護します。手術部位を化学薬品ドラフトで準備し、毛皮やフケの広がりを最小限に抑えます。毛皮を細い刃物で剃り、腹壁を覆う皮膚を露出させます。

完全な毛皮除去は、術後の切開の治癒を促進します。腹部の皮膚の消毒は、70%エタノールベタジンと70%エタノールを交互に通過することによって達成されます。常に吻側からコドルまでスワイプし、新しい外科用コットンボールまたはコットンチップアプリケーターを使用してください。

各パスについて、消毒中の呼吸の深さと質を評価して、ダムが反応しないことを確認します 2回目の70%エタノールパスの後、すぐに腹面を滅菌ドレープに置き、加熱されたパッドに2〜3分間置いて温めました。これは、マウス生存手術ログシートに術前データを記録するのに便利な時期です。補足情報として、マウス生存手術のデータシートを添付しています。

データシートとアニマルケアプロトコルを含めることを検討して、施設の動物ケアおよび使用委員会が術前および術後のデータをどのように監視するかを確認できるようにするためです。手術対象者ごとに1枚のログシートを完成させます。私たちは無菌環境で手術を行うことを好みますが、これは通常、げっ歯類には必要ありません。

作業面はブロワーモーターとプレナムハウジングから分離されているため、振動がユーザーに伝わりません。マイクロインジェクションでは、子宮内遺伝子導入を容易にするために層流フードに加えた変更の概略図を補足情報として追加しましたが、重要な変更は、機器の電源コード用の低ワットチャレンジとトラック照明のカットアウトと隠されたレセプタクル、およびアクセサリの電気回路のルーティングパスです。手術室は、電動乳酸リンガーIVバッグ、温浴、XY、Zマニピュレーター、実体蛍光、解剖顕微鏡、光ファイバー光源、手術器具で構成されています。

フットペダルはマイクロインジェクターをトリガーするために使用され、エレクトロピーターはフォーカスに入ります。スコープ手術器具はオートクレーブで滅菌されます。器具は、ガラスビーズ滅菌器を使用するか、ニードルドライバーを再オートクレーブすることにより、マウス間で再滅菌する必要があります。

バリはさみリング鉗子と血管鉗子は必須のツールです。腹側正中線切開、血管鉗子で皮膚をつかみ、ボール先端のハサミで外皮を切除し、切開部を10〜14ミリメートル延長します。linea albaと呼ばれる接続された組織の白い無血管帯を特定し、腹部の腹側正中線は、ボール先端のはさみで線形albaを切開します。

腸や鼠径部の脂肪パッドを傷つけないように注意してください。直ちに無菌の温乳リンガー溶液で腹部を洗浄します。出血がないか、皮膚と腹壁の切開部位を評価します。

鈍い鉗子による直接圧力は、存在する場合は軽度の出血を阻止し、リング先端の鉗子で左右の子宮角を外部化します。鉗子の一方の輪状の端で右の子宮角をそっとつかみ、子宮を正中線切開に向かって引きます。空いている手を使ってダムの外側を優しく操作し、子宮を引っ掛けやすくします。

鉗子は、子宮を圧迫して引き抜くために使用されることはありません。これは子宮血管系または胚を損傷する可能性があるため、左の子宮角に対して外部化手順を繰り返します。すぐに、新たに外部化された子宮角を温めた泌乳リンガー溶液で洗浄し、内部脂肪パッドまたは腸が子宮と外部化する場合は、腸を穏やかに再挿入します。

これは頻繁には発生しません。パート2:子宮マイクロ注射。ダムは長作動距離対物レンズの下に配置され、柔らかいケーブルの光ファイバーライトが子宮壁に対して設置されています。

子宮は空いている手の指で優しく押されます。胚の向きの同定を容易にするため。光ファイバーケーブルからの光は、胚の向きを正確に評価するために必要な最低強度である必要があります。

強い光は子宮に熱を伝達し、合併症を引き起こす可能性があります。光ファイバーライトと子宮を片手で持ち、空いた手の指を使って穏やかな触診で胚の位置を変えます。次の3つのビデオでは、顕微鏡によるECクリップと、子宮のによって観察される一般的な胚の向きを示します。

視聴者は、トランス照明中に見える顕微鏡のビューを見ることになりますが、白黒の子宮のトランス照明では、生体内での胚の向きの検出が可能になります。この例では、胚は腹側表面が視聴者に面して倒立位置にあります。子宮を前後に動かすことで、左右の後肢、尾、左目の頭蓋を検出できます。

この例では、胚は再び倒立位置にあるが、前後軸に対して約90度回転している。子宮をゆっくりと前後に動かすと、左後肢と左肢を定義するパドルの形を見ることができます。後脳も明らかです。

胚は直立位置にあり、左側が視聴者を向いています。新生の第4脳室は、後脳の明るい斑点として検出できます。左目の頭蓋、左の4肢、左後肢も明らかです。

子宮に穏やかな圧力をかけると、胚の向きがわずかに変わり、一次頭静脈の主幹とその前枝と後枝(それぞれ白と黒のアスタリスクでマークされています)を検出できるようになります。これから見ていくように、オーティスは一次頭静脈の前枝と後枝の中間に位置しています。オーティス自体は、トランスイルミネーションによって子宮を通して見ることはできません。

2つの連続したビデオ顕微鏡クリップで、マイクロインジェクションのために胚の向きをオーチスアシストに変更する方法を示します。目標は、外側頭部のオーティスの位置の補間を可能にする胚のランドマークを特定することです。Mesen con、私たちの目標は、胚を背側から外側の位置に向きを変えて、一次頭静脈を特定できるようにすることです。

中脳第4心室と四肢の左脳室は、背側の位置で明らかです。子宮に穏やかな圧力をかけると、胚の向きが背側から後側に移動します。左眼の頭蓋骨、中脳、および第4心室はすぐに明らかです。

アスタリスクで示されている一次頭静脈とその後枝も明らかです。一次頭静脈の前枝は明確に検出されていません。私たちの目標は、再び、胚を向き付けて一次頭静脈を識別できるようにすることですが、子宮マイクロインジェクションに適した高倍率で行います。

子宮血管の脱落膜バンドと左目は、この横方向の視点で見られます。子宮に穏やかな圧力をかけると、胚の位置がずれ、左眼の第4心室を検出できるようになります。アスタリスクでマークされた一次頭静脈とその後枝、一次頭静脈とその枝はアメリカンフットボールの直立形をしています。

耳小胞は子宮を通して見ることはできませんが、直立物の中心にあります。Lynn は、1 つの胚に対して Injection シーケンスを開始しました。彼女は子宮をトランスイルミネーションし、マイクロインジェクションのために胚の向きを変え、ファストグリーンで満たされたマイクロインジェクションピペットをフィールドに持ち込みます。

マイクロインジェクションピペットは、X、Y、zマイクロマニピュレーターによって保持されるピペットホルダーに取り付けられています。マニピュレーターのマグネットスタンドは、テフロンベースの鋼板に取り付けられており、マイクロインジェクションピペットのグロスポジショニングが簡単に行えます。マニピュレーターのフォワードマイクロメータコントロールノブを使用して、針を適切に進めます。

作製ピペットは、初期のオーチス期マウス胚への外傷性マイクロインジェクションに不可欠です。厚肉のホウ素ガラスキャピラリーチューブを水平ピペットプーラーで引っ張ります。得られたAに示すピペットは、Bの矢印で示される約14〜16ミクロンの外径位置で鉗子を使用して手動で破損します。

パネルDに見られるように、ピペットの先端をシャープにするためにピペットを約20度面取りします。引っ張って面取りするためのパラメータマイクロインジェクションピペットは、添付のテキストに記載されています。次の2つのビデオ顕微鏡クリップでは、胚の11.5日目と12.5日目にマウス耳介助へのマイクロインジェクションを示します。私たちの目標は、胚の日、11.5マウスoticsへの子宮マイクロインジェクションを実証することです。

まず、子宮が存在しない状態で耳鼻咽喉科を注射して、正しく標的を絞った注射がどのように現れるかを明確に示します。次に、本物の経子宮マイクロ注射を実演します。この最初の注射では、内臓嚢が押し出されるように子宮を切開し、内臓卵黄嚢を覆う脱落膜バンドを取り除きました。

胎盤は子宮に付着したままで、胚は生きています。子宮を局所的に切除すると、第4脳室、一次頭静脈、その前後の枝、ピペット、および嚢胞のおおよその位置が白で見えます。この注射シーケンスの開始時に、内臓卵黄嚢血管系で血流が検出されます。

ピペットは内臓の卵黄嚢を通って進められ、daiはオーシスノート、背側リンパ管、および直立物の中央にある耳鼻咽喉部の位置に注入されます。耳鼻咽喉科は、一次頭静脈の前枝と後枝の中間にあり、胚の日への子宮マイクロ注射です。11.5 マウス耳鼻咽喉科は、耳介助の位置を推定するために、一次頭静脈とその枝の少なくとも1つの検出を必要とします。

この図の例では、一次頭静脈の前枝と後枝の両方が検出され、OUC 領域は白でマークされています。胚のより現実的な表現は、一次頭静脈の主幹とその枝の1つだけが検出され、一次頭静脈の後枝のみが見られる例であるが、それで耳鼻咽喉科の位置を解釈するには十分である。PTは子宮を通じて進行し、染料が耳鼻腔に注入されます。

羊水腔から色素が排出されるまで30秒待ち、その時点で背側に内リンパ管と前庭が見えます。解剖学的視点を提供するために嚢胞を注入したばかりの胚の低倍率図で結論付けます このビューでは、第4脳室の左目と子宮血管系が見られます。胚の12日目マウス耳嚢胞へのトランスインジェクションとマイクロインジェクション、および後脳の新生第4脳室へのマイクロインジェクションを実証します。

トランスイルミネーションにより、この左側面図の一次頭静脈と目を検出することができます。ピペットは子宮を通って耳小胞に進められ、その内腔を満たすために注入されて死にます。第4脳室を注入するには、胚を90度回転させて後脳の背側図を確認します。

注入された左嚢胞は左側にあります。ピペットは子宮を通って進められ、ローと混合されたファストグリーンです。抱合型デキストランは第4脳室に注入されます。

注入された色素の量はin vivoで中脳に入らないことに注意してください。注射後に蛍光を評価して、第 4 脳室でのデキストランの局在化を検証します。その後、胚は背側から外側の位置に向きを変えます。

この側面図では、内リンパ管はちょうど第4脳室の腹側にあります。In vivo蛍光は、第4脳室におけるデキストランの局在性を検証します。出生時には、エピ蛍光を使用して、第4脳室の緑色蛍光について子犬をスクリーニングします。

後脳に緑色の蛍光を発する顕微鏡の子犬を解剖すると、胚形成パート3の生体内エレクトロポレーション中に操作された内耳があります。嚢胞を発現プラスミドで満たした後、子宮を温めた泌乳リンガー溶液で新たに灌漑する。トランスイルミネーションは、ODU嚢胞を電極場の中心に配置することを容易にします。

光ファイバーライトの金属ヘッドは子宮表面から引っ込められています。矩形波パルス列を開始する前に、次のビデオ顕微鏡クリップで、in vivoでの完全なエレクトロポレーションサイクルを示します。胚の日のエレクトロポレーション、11.5マウス耳嚢胞は、子宮上のパドルスタイルの電極を穏やかに配置する必要があります。

この例では、左耳嚢胞に発現プラスミドが充填され、子宮に授乳リンガーが新たに洗浄されています。陰極は、充填された耳嚢胞に対して横方向に配置され、およびオードは、イオンシーケンスの開始時に内側に配置され、耳嚢胞はパドルフィールドの中心にあります。子宮は穏やかに圧迫され、矩形波パルス列はフットペダルスイッチで開始されます。

理想的には、パルスあたり60〜100ミリアンペアの電流が供給されます。その後、子宮が解放され、すぐに灌漑されます。新たに灌漑された子宮は、リング鉗子による穏やかな圧力によって腹腔に戻されます。

子宮が内在化されると、腹腔内は約4ミルの授乳リンガーで洗い流され、腹腔内に約1ミルの授乳リンガーが残り、腹部手術直後の通常よりも水を飲む量が少なくなる母の水分補給を維持します。腹壁、次に皮膚をニードルドライバーを使用して吸収性縫合糸で閉じます。当社のニードルドライバーにはハサミが内蔵されており、簡単に閉じることができます。

腹壁と皮膚の両方にランニングステッチを好みます。切開部位で追加のサポートを提供するために、他のすべてのステッチをロックします。非ステロイド性抗炎症薬を皮下投与してから、リカバリーケージにダムを留置します。

施設の動物管理および使用委員会がどの予防的鎮痛薬を好むかについては、獣医スタッフに相談してください。.ダムは滅菌ドレープに囲まれ、加熱されたリカバリーケージの床に置かれます。リカバリーケージには、ネスティング材、カバー用の赤いチューブ、ラボチャウ、ウォーターボトルが入っています。

ケージは、手術の翌朝にフィルターボンネットを上にして再組み立てされます。ダムは美しく手入れされ、歩行可能で、後ろ肢でバランスを取りながらオープンケージトップについて尋ねることができます。腹部の縫合線は清潔で乾燥しており、分離、発赤、腫れの形跡はありません。

子宮内遺伝子導入のためのアニマルケアプロトコールの開発について解説した文献を添付しました。この文書には、動物管理および使用委員会と協議して施設固有のプロトコルを設計する際に役立つ可能性のある言語が含まれています。パート4、代表的な結果。

代表的な結果パネルAおよびBは、出生後6日目の仔犬の代表的な蝸牛を示しており、そのオーチスには胚11.5日目に増強された緑色蛍光タンパク質発現プラスミドが注射され、その後エレクトロが注射されました。蝸牛の側壁は、中間期と頂点から取り除かれました。蝸牛の基部から中期までGFPの発現のみが存在し、パネルBに示されている有毛細胞マーカーミオシン7Aの分布に従います。

18.5 マウスのCorde器官 免疫染色 ミオシン7A抗体トランスフェクト細胞は、Cordeの器官全体に分布しています。パネルDは、胚の日の高倍率共焦点投影を示しています。18.5 Cin で染色された corde のマウス器官。7。

GFPの発現は、内有毛細胞と外有毛細胞、指節間細胞、柱細胞、およびTER細胞で検出されます。エレクトロポレーションは、胚の11.5日目にオーチスへの遺伝子導入を媒介し、胚の器官内のすべての構成細胞タイプを生じさせるトランスフェクト前駆細胞