エンジニアリング細胞透過性のタンパク質

細胞機能の操作は、過去15年以内にDNAトランスフェクションまたはウイルス形質導入の古典的なアプローチを通じて達成できます。別の方法が進化しました。タンパク質形質導入の生物学的活性タンパク質は、目的のタンパク質に融合した小さなペプチドを使用して哺乳動物細胞に直接送達することができ、細胞の取り込みを促進します。

DNAを使用しないため、労作性無形成のリスクが防止されます。上記の古典的な方法とは対照的に。タンパク質形質導入により、滴定可能な方法でタンパク質を送達することができます。

さらに、小さな細胞集団だけでなく、有糸分裂後ニューロンなどの非分裂細胞も調節できます。組換えタンパク質を効率的に発現するために、Pacizベクターシステムの使用をお勧めします。これは、エンドターミナルとCターミナルバリアントで構成されるモジュラーベクトルシステムです。

どちらのベクターも、精製手段として目的の遺伝子を簡単に挿入できます。ヒスチジンタグは、タンパク質形質導入ドメインと同様に組み込まれています。私たちの場合、HIウイルスからの接触が細胞の取り込みを促進し、細胞の分布につながりました。

核局在化信号は、核融合タグを簡単に取り外すことができる制御上の理由から、ベクターを完成させます。また、これらのタグの配置は、融合タンパク質の特性に大きな影響を与える可能性があります。収量と純度、販売性、生物学的機能への影響は予測できません。

こんにちは、私の名前はBernard Musで、ドイツのボンドにあるInstitute of Reconstructive Neurobiologyの幹細胞工学グループで働いています。こんにちは、私の名前はクリストフ・Pで、フーバー研究所のメンバーでもあります。私たちのワークグループは、タンパク質形質導入技術を集中的に活用して、さまざまな哺乳動物細胞に生物学的活性タンパク質を直接送達します。今日は、大腸菌の発現と精製のプロセスをご案内したいと思います。

その後、細胞培養における細胞永久融合タンパク質の適用方法を示し、発現、精製、および適用の全手順を例示したいと思います。私たちは、部位特異的組換えクリー族を利用して、マウスのオン性幹細胞を遺伝子改変します。わかった。さあ、始めよう。

一晩培養するために、摂氏マイナス80度のグリセロールストックに保存されたすでに形質転換された細菌を利用します。これらの細菌には、デクレ組換えをコードするベクターがすでに含まれています。パイパーチップを使用して、パイパーチップに少量のバクテリアを引っ掻き、一晩培養したビーカーに落とします。

一晩培養は、最終濃度がOH 0.5%のグルコースを補給したLB培地と、1mlあたり50マイクログラムの炭酸インスリンで構成されています。次に、ビーカーを摂氏37度で稼働するインキュベーターに入れ、部位特異的なRecombinate Creeを発現させます。戦前の結核メディアを大規模な表現文化に活用しています。

発現を早めるために、組換えタンパク質の発現中の温度を表す摂氏37度まで温めた結核培地の使用をお勧めします。次に、最終濃度oh 0.5%で結核培地にグルコースを添加しますグルコースは、誘導前の発現培養物の成長中に融合タンパク質の基礎発現の増加を防ぎます。最後に、アンピシリンを最終濃度100マイクログラム/mLで発現培養物に添加し、デクリータンパク質をコードするプラスミドをまだ保持している細菌のみを含む純粋な培養を保証します。

私たちは今、一晩培養を行い、発現培養を1対50の割合で接種することができます。その後、ビーカーは摂氏37度の温度で稼働するインキュベーターに移されます。サンプルを採取して、式全体を通して定期的に光学密度を測定する必要があります。

培養物が光学密度1.5に達するとすぐに、細菌は最終濃度OH0.5ミリモルのIPTGで誘導されます。1時間の誘導後、発現培養物をチューブに移し、続いて遠心分離機で回収します。この目的のために、SLA 3000ローターを使用しています。

遠心分離機は、4 度の順行性で 10 分間、毎分 5 、 000 ラウンドの速度で稼働しています。その後、スナットは廃棄され、バクテリアペレットはマイナス20°Cで無期限に保存できます。凍結したペレットは、1リットルの発現培養物に対応する控訴であるリザバッファーに再懸濁されます。

10mlのリザバッファーを使用し、溶液が均一になるまで約15分待ちます。次に、懸濁液の1MLごとに1ミリグラムのリゾチームが追加されます。溶液を20分間混合して、酵素が細菌を壊します。

続いて、Benson Naseを1〜1000の希釈でさらに15分間添加すると、DNAが切断され、非粘性溶液が得られます。最後に、細胞の溶解を確実にするためにソンターが使用されます。このプログラムは、認定完了後、45%の電力で1分半実行されます。

ここでのすべてのステップのサンプル、精製の粗溶解物またはSDSページ分析を採取することを忘れないでください。現在、懸濁液1MLあたり1mlの氷冷TSBバッファーを追加することが非常に重要です。これは、デクリータンパク質がグリセロールストック内に沈殿する傾向があるためです。このステップをスキップすると、溶液はすぐに混合され、粗雑なものは遠心分離の準備が整います。

この目的のために、SS 34ローターを使用します。遠心分離機は、摂氏 4 度で 30 分間 17 、 000 RPM で運転されています。終了すると、Centrifuge IncはS上清を新鮮な50 mLのFalconチューブに慎重に移しました。

次に、上清ニッケルにニッケル抗Aスラリーを追加します。抗Aは、ヒスチジンテック融合タンパク質の適切な精製に不可欠な試薬です。ヒスチジンはニッケルイオンと複合体を形成し、アフィニティー精製が可能になり、40°Cで60分間駐車チューブを静かに振る。

1時間後、懸濁液を20 MLのカラムに適用し、重力流で溶液を通過させることができます。大規模な生産では、サスペンションを複数のコラムに分割することが可能です。次に、15ミリモルのインナーソールを含むバッファーでカラムを2回洗浄します。

適用されるバッファーの量は、樹脂の量によって異なります。2MLSのニッケルNTAは、洗浄手段として1mlの樹脂に相当します。洗浄後、5つの樹脂容量の洗浄バッファーをカラムに置き、タンパク質を逃れる準備が整いました。

そのため、免疫濃度が250ミリモルの溶出バッファーを使用します。そのため、樹脂の色が緑に向かってどのように変化するかに注目してください。CREタンパク質の濃度が高いため、OID画分が濁ることがあります。

これを防ぐには、溶液を混合し、lysバッファーを追加すると、すべてのフラクションがプールされ、続いて溶解チューブに移されます。溶解は、高濃度の塩を含有するバッファーに対して行われる第1の透析器ステップを脱落させる。1時間後、高塩分緩衝液を交換し、透析手順を一晩中適用します。

翌日、透析チューブを高塩分緩衝液から取り出し、グリセロール緩衝液に移します。3〜5時間後、グリセロール緩衝液を交換し、再び一晩透析を行います。グリセロール緩衝液に対する溶解により、少なくとも3倍の濃縮ストック溶液が得られます。

ストック溶液は、活性を損なうことなく、マイナス20°Cで数年間保存できるようになりました 品質保証のために、収集したSDSページサンプルをゲルにロードし、その後染色することができます。Kamasiの場合、Cree融合タンパク質はOID画分の顕著なバンドとして検出できます。乗組員の組み換えに適切な濃度を使用するには、レッドフォードアッセイで濃度を決定する必要があります。

哺乳類の細胞に永久的なタンパク質を適用する方法。まず第一に、最高のタンパク質形質導入効率を達成するために、標的細胞を調製します。あなたのターゲット細胞がコンパクトなコロニーで成長したyes細胞である場合に備えて、翌日に80〜90%のコンフルエンス細胞層をもたらす密度で単層細胞を見てください。

細胞を分離し、体細胞に分離し、5時間前に単一細胞懸濁液でそれらを確認します。タンパク質形質導入の前に単一細胞懸濁液を作製することが重要です。そうしないと、コロニーの表面にある空気細胞しか輸血できないからです。メディアを熱望し、トライイン治療の前にPPSで空気細胞を短時間観察します。

残りのものを取り除きます はい、血清を含むグロスメディア。PPSオーバーレイ細胞を滴下して吸引した後、3〜5分間インキュベートします。次に、すべてのコロニーが単一細胞に溶解しているかどうかを顕微鏡で確認します。

今述べた理由は、これが「はい」細胞へのタンパク質形質導入のための重要なステップであるからです。分離した細胞をチューブに移します。チューブをテーブルに入れ、細胞を遠心分離してスピンダウンさせ、スーパーエージェントを吸引して細胞を再懸濁します。

増殖培地中のPは、細胞を適切な細胞数に希釈します。もちろん、それは組織培養のサイズによります。ディッシュは、空気細胞をさらに5時間インキュベートします。

これにより、エアセルが底部に付着して付着するのに十分な時間が与えられます。3クラスのローストックは、マイナス20度で2年以上保管できます。組換え細胞の永久融合タンパク質を扱う場合、オンデマンドで使用できるこのようなストックソリューションがあることは非常に有益です。

細胞が皿に付着するのを待っている間、C形質導入培地を準備することができます コレステロールストックから細胞永久クリープタンパク質の適切な量を自分自身に希釈するだけです。メディア。クレアストック溶液はまだ無菌ではないため、トランスメディアは適用前に無菌ろ過する必要があります。ローブタンパク質結合フィルターにねじ込むことができるシリンジの使用をお勧めします。

最終的なクリーク濃度は、細胞の種類または培地サプリメントに依存します。例えば、血清は形質導入効率に強い悪影響を及ぼします。これは、無血清培地を使用するか、クリークの濃度を上げることで克服できます。

最高の組換え効率を実現できる最適な条件を見つけます。OH 0.5から10マイクロモルまでの濃度を水和物化します。6時間から18時間の間で異なるインキュベーション時間をテストすることをお勧めします。

5時間のインキュベーション後、ターゲット細胞を取り出し、クロスメディアを吸引します。その後、タンパク質形質導入培地に交換し、一晩インキュベーションした後、空気細胞をインキュベーターに戻します。D細胞をPPSで短時間洗浄し、タンパク質形質導入培地を正常なES培地に交換しました。

細胞のインキュベーションから48時間後、Cree vent遺伝子の発現はxulを介して検出できます。陽性のbega表現型を持つ細胞の染色は、部位特異的な組換えによって遺伝子操作に成功しています。Creeレポート。

細胞は、事前に培われた組換え時にLaeコンストラクトを使用するCREを保有しています。ロックPフランクストップシーケンスが切除され、チームプロモーターによって駆動されるラックスレポーター遺伝子が活性化されます。前処理されたレポーターエアセルの組換え効率を評価するには、細胞を固定する必要があります。

吸引液を4%PFA含有PBSオーバーレイ細胞で細胞を2回洗浄し、室温で10分間細胞をインキュベートします。その後、PBSで細胞を再び3回洗浄します。Xal Stain溶液での最後の洗浄ステップからPBSをウェルに吸引した後、インキュベーター内で細胞を37度で一晩インキュベートします。

翌日、Bealの活動はブルーカラー細胞によって監視できます。組換え効率は、ブルーコロニーの数で決まります。最適な条件下では、90%を超える組換え効率を達成できるはずですさて、今日は、大腸菌からサイト固有のクエリ組換えを発現および精製する方法を示しました。

この原理証明研究では、ほとんどの塩で組換えを誘導することができました。さて、これで完了です。あなたのExperiments.Iで頑張ってください。