エンジニアリング細胞透過性のタンパク質

過去15年間にわたり、細胞機能の操作は、DNAトランスフェクションまたはウイルス導入という古典的なアプローチによって行われてきました。それに続き、別の手法が発展しました。タンパク質導入法では、目的のタンパク質に融合させた小型ペプチドを用いて、生物学的に活性なタンパク質を哺乳類細胞へ直接導入することができ、これにより細胞内への取り込みが促進されます。

DNAを使用しないため、外来遺伝子の不完全な発現（agenesis）のリスクを防ぐことができます。上述の古典的な手法とは対照的に、タンパク質導入法ではタンパク質を滴定可能な形式で導入することが可能です。

さらに、少数の細胞集団や、ポストミトーティックニューロンなどの非分裂細胞も修飾可能です。組換えタンパク質を効率的に発現させるために、Pacizベクターシステムの使用を推奨します。これは、N末端側とC末端側のバリアントからなるモジュール式ベクターシステムです。

どちらのベクターも、精製のために目的遺伝子を容易に挿入することが可能です。ヒスチジンタグに加え、タンパク質導入ドメインも組み込まれています。本研究では、細胞内への取り込みを促進し細胞分布を可能にするHIV由来のドメインを使用しています。

コントロール目的で核局在化信号を加えてベクターを完成させており、融合タグは単純に除去することが可能です。また、これらのタグの配置は、融合タンパク質の特性に大きな影響を与える可能性があります。収量や純度に及ぼす影響、ならびに溶解性や生物学的機能への影響は予測できません。

こんにちは、私の名前はBernard Musです。ドイツのボンドにある再建神経生物学研究所の幹細胞エンジニアリンググループで研究を行っています。こんにちは、私の名前はChristoph Pで、私もHoover研究室のメンバーです。私たちの研究グループでは、生物活性タンパク質をさまざまな哺乳類細胞に直接届けるためにタンパク質導入法を精力的に活用しており、本日はE. coliにおける発現および精製の手順について解説します。

次に、発現、精製、および適用の全手順を例示するため、細胞培養における細胞永続的な融合タンパク質の適用方法について説明します。マウス胚性幹細胞を遺伝的に改変するために、部位特異的組換え酵素Creを利用します。それでは、始めていきましょう。

overnight培養を行うため、-80°Cのグリセロールストックに保存された、すでに形質転換済みの細菌を使用します。これらの細菌は、decre組み換えをコードするベクターをすでに保持しています。ピペットチップを用いて、少量の細菌をチップに削り取り、overnight培養液の入ったビーカーに滴下します。

一晩培養には、最終濃度 0.5% のグルコースおよび 50 µg/mL のカルボニックインスリンを添加した LB 培地を用います。その後、ビーカーを 37 °C に設定したインキュベーターに入れ、部位特異的組換え Cre を発現させます。なお、大規模発現培養には、あらかじめ加温した TB 培地を使用しています。

発現を促進させるため、組換えタンパク質の発現温度である37°Cに温めたTB培地の使用を推奨します。次に、最終濃度が0.5%となるようにTB培地にグルコースを添加します。グルコースは、誘導前の発現培養の増殖過程において、融合タンパク質の基底発現が上昇するのを抑制します。最後に、目的タンパク質をコードするプラスミドを保持している細菌のみの純粋培養を確保するため、最終濃度100 µg/mLとなるようにアンピシリンを発現培養に添加します。

次に、オーバーナイト培養液を用意し、1:50の比率で発現用培養液に接種します。その後、ビーカーを37 °Cに設定したインキュベーターに移します。発現の間、定期的にサンプルを採取し、光学密度（OD）を測定してください。

培養液の光学密度が1.5に達し次第、最終濃度0.5 millimolarのIPTGで細菌を誘導します。1時間の誘導後、発現培養液をチューブに移し、遠心分離により回収します。この際、SLA 3000ローターを使用します。

遠心分離機を4°Cで5,000 rpmの速度で10分間運転します。その後、上清を廃棄し、細菌ペレットを-20°Cで不定期間保存できます。凍結したペレットを、発現培養液1L相当量のLysisバッファーで再懸濁します。

10 mLのlizzaバッファーを使用し、溶液が均一になるまで約15分間待ちます。次に、懸濁液1 mLあたり1 mgのリゾチームを添加します。酵素によって細菌を溶解させるため、溶液を20分間混合します。

続いて、Benson Nucleaseを1000倍希釈で添加し、さらに15分間静置します。これによりDNAが切断され、溶液の粘性が低下します。最後に、超音波発生装置を用いて細胞の完全な溶菌を行います。設定完了後、出力45%で1分30秒間プログラムを作動させます。

ここでの各ステップ（粗溶解物または精製過程のSDS-PAGE解析）のサンプルを採取することを忘れないでください。グリセロールストック内で粗タンパク質が沈殿しやすくなるため、懸濁液1 mLあたり1 mLの氷冷TSBバッファーを添加することが非常に重要です。このステップを省略する場合は、溶液をすぐに混ぜ合わせます。これで粗溶解物の遠心分離準備が整いました。

この目的のために、SS 34ローターを使用します。遠心分離機を4 °Cで17,000 RPMにて30分間回転させます。完了後、上清を慎重に新しい50 ml Falconチューブに移します。

次に、ニッケル抗Aスラリーを上清に加えます。抗Aは、ヒスチジンタグ融合タンパク質を適切に精製するために不可欠な試薬です。ヒスチジンがニッケルイオンと複合体を形成することで、アフィニティー精製が可能になります。その後、パーキングチューブを40 °Cで60分間、穏やかに振とうします。

1時間後、懸濁液を20 mLのカラムに添加し、重力フローで溶液を流します。大規模生産の場合は、懸濁液を複数のカラムに分注することが可能です。その後、15 mMのinnersoleを含むバッファーでカラムを2回洗浄します。

使用する緩衝液の量は、レジンの量によって決まります。洗浄目的の場合、Ni-NTAレジン1 mLに対して2 mLの緩衝液に相当します。洗浄後、レジン量の5倍の洗浄緩衝液をカラムに添加し、タンパク質の溶出準備を整えます。

したがって、250 millimolarのimmunoを含む溶出バッファーを使用します。樹脂の色が緑色に変化することに注目してください。CREタンパク質が高濃度であるため、OID画分が濁ることがあります。

これを防ぐために、溶液を混合してさらにライシスバッファーを追加します。これにより、すべての画分がプールされ、その後ライシスチューブに移されます。ライシスによってオイルが除去されます。まず、高濃度の塩を含むバッファーを用いて最初の透析ステップを行います。1時間後、高塩濃度バッファーを交換し、一晩透析処理を行います。

翌日、透析チューブを高塩濃度バッファーから取り出し、グリセロールバッファーに移します。3～5時間後、グリセロールバッファーを交換し、再び一晩透析を行います。グリセロールバッファーを用いた溶解により、少なくとも3倍に濃縮されたストック溶液が得られます。

ストック溶液は、活性を失うことなく-20°Cで数年間保存することが可能です。品質管理のため、回収したSDS-PAGEサンプルをゲルにロードし、その後染色して確認してください。Cre融合タンパク質は、OID画分において顕著なバンドとして検出されます。適切な濃度のCreリコンビナーゼを使用するために、Bradford法で濃度を決定してください。

哺乳類細胞へ永続的タンパク質を導入する方法について説明します。まず、最高のタンパク質導入効率を得るために、標的細胞を準備します。標的細胞がコンパクトなコロニーを形成して増殖する細胞である場合は、翌日に細胞層が80〜90%のコンフルエンスに達する密度で単層細胞を播種してください。

細胞を分離し、5時間前に単細胞懸濁液の状態にします。タンパク質導入の前に単細胞懸濁液を作成することが重要です。そうしないと、コロニー表面の細胞のみが導入されるためです。培地を吸引し、トリプシン処理を行う前に、PBSで細胞を軽く洗浄します。

血清を含む残りの培地を除去します。PPSオーバーレイを吸引した後、細胞に滴下し、3〜5分間インキュベートします。その後、顕微鏡で確認し、すべてのコロニーが単一細胞に分散しているかを確認してください。

前述の理由から、これは酵母細胞へのタンパク質導入における極めて重要なステップです。剥離した細胞をチューブに移します。チューブを遠心機にセットして遠心分離し、細胞を沈殿させます。上清を吸引し、細胞を再懸濁します。

増殖培地を用いて、細胞を適切な細胞数まで希釈します。これは当然ながら、組織培養容器のサイズによって異なります。ディッシュに入れ、細胞をさらに5時間インキュベートします。

これにより、気泡が底面に付着し、接着して増殖するための十分な時間が確保されます。3クラスの行ストックは、-20°Cで2年以上保存可能です。組み換え細胞永久融合タンパク質を扱う際、このようにオンデマンドで使用できるストック溶液があることは非常に有益です。

細胞がディッシュに接着するまで待機している間に、適切な量のcell permanent creep proteinをcholesterolストックからyourself.Mediaに希釈し、Cトランスダクション培地を準備します。Clareストック溶液はまだ滅菌されていないため、トランスメディアは使用前に滅菌フィルターでろ過する必要があります。シリンジに装着可能なタンパク質結合フィルターの使用を推奨します。

最終的なcreek濃度は、細胞の種類や培地添加剤に依存します。例えば、血清は導入効率に強い負の影響を及ぼします。これは、無血清培地を使用するか、creek濃度を高めることで解消できます。

最高のリコンビネーション効率を可能にする最適条件を決定します。濃度を 0.5 から 10 µM まで段階的に調整してください。インキュベーション時間は 6 から 18 時間の間で、異なる時間をテストすることを推奨します。

5時間のインキュベーション後、標的細胞を取り出し、クロス培地を吸引します。続いて、それをタンパク質導入培地に置換し、細胞をインキュベーターに戻して一晩インキュベートします。その後、D細胞をPBSで軽く洗浄し、タンパク質導入培地を通常のES培地に変更します。

細胞を培養して48時間後、Creリコンビナーゼによる遺伝子発現をX-gal染色で検出することができます。β-ガラクトシダーゼ陽性の表現型を示す細胞は、部位特異的組換えによって遺伝子工学的改変が正常に行われたことを示しています。

これらの細胞は、事前の中介組み換えによりCRE-loxPコンストラクトを保持しています。loxPに挟まれたストップ配列が切り出され、teamプロモーターによって駆動されるluxeレポーター遺伝子が活性化されます。前処理されたレポーター細胞における組み換え効率を評価するために、細胞を固定する必要があります。

培地を吸引し、PBSで細胞を2回洗浄します。4% PFAを加えて細胞を覆い、室温で10分間インキュベートします。その後、PBSでさらに3回洗浄します。最後の洗浄ステップでPBSを吸引した後、ウェルにXal染色溶液を加え、インキュベーター内にて37℃で一晩インキュベートします。

翌日、青色に染色された細胞によってBeal活性をモニタリングできます。組み換え効率は、青色コロニーの数によって決定できます。最適条件下では、90%以上の組み換え効率を達成できるはずです。さて、本日は E. coli から部位特異的なクエリ組み換え酵素を発現および精製する方法について解説しました。

この原理実証研究において、我々はほとんどの塩で組換えを誘導することができました。以上です。皆様の実験の成功をお祈りします。