固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにおける金属浸出の定量
2020年1月17日
固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて調製した試料に導入した金属を容易に定量するためのアッセイを提示する。この方法は、比色金属指標としてヒドロキシナフトールブルーを使用し、UV-Vis分光光度計を検出器として使用する。
我々の方法は、平均的な生化学者が固定化された金属親和性クロマトグラフィーを使用して分離されたサンプルが遷移金属で汚染されているかどうかを迅速に判断することを可能にするので、重要である。主な利点は、アッセイを行うことができる容易さです。このアッセイは、ほとんどの生化学ラボに共通する計器と技術を使用しており、簡単かつ迅速に実装できます。
この記事では、ニッケル NTA カラムで分離されたサンプルにこの方法を適用しますが、この方法は他の金属アフィニティ樹脂と共に使用できます。初めてユーザーは、既知の濃度のニッケルストック溶液でこの方法を試してみてください。これにより、スペクトルの変化に示されたワークフロー、サンプルカラー、および樹脂に慣れ親しみます。
手順を実証するには、私の研究室の技術者コール・スウェインです。まず、UV-Vis分光光度計をオンにしてウォームアップします。280ナノメートルの光吸光度を有するダイオードアレイUV-Vis分光光度計を用いて、タンパク質を定量化する測定対象のクロマトグラフィー画を決定する。
トリス、HEPES、MOPS、リン酸緩衝液など、7~12の間のPHを有する10~100ミリモルのサンプルバッファーを得る。調製したストック溶液の1ミリリットルごとに120ミリグラムのHNB試薬を用いて、サンプルバッファー内のHNB分散液の体積分量で12%の重量を調製する。647ナノメートルでデータを収集するために分光光度計を設定します。
サンプルバッファーで満たされたクベットを使用して、分光光度計をブランクにします。合計アッセイ量のミリリットル当たり50マイクロリットルのHNBストックを含むキュベットで制御溶液を調製します。コントロールを室温で最低3分間インキュベートします。
コントロールサンプルの吸光度を647ナノメートルで測定し、記録します。サンプルバッファーと適切に希釈したタンパク質画分の 2850 マイクロリットルと HNB ストックの 150 マイクロリットルを混合することによってアッセイサンプルを準備します。サンプルを室温で最低3分間インキュベートします。
測定する各分数について、スペクトル記録を繰り返します。希釈が不十分な場合には、647ナノメートルでの全スペクトルバンドがなくなっている。あまりにも強い希釈を伴いながら、サンプルはコントロールと区別できません。
各サンプル中の金属の濃度を決定するために、まずHNB制御から647ナノメートルで各サンプル吸光度の差を見つける。DFがアッセイ画分の希釈因子である式を用いてマイクロモル中の金属濃度を決定し、デルタA-B-S 647は647ナノメートルでの吸光度変化、負の2に対する3.65倍の10倍はHNBの絶滅係数を表し、lはクベットの光学経路をセンチメートルで表す。本研究では、MSP1E3D1の単離からニッケルイオンに対してアッセイされた画分の代表的スペクトルにおける中性PHにおける遊離HNBのスペクトルをここに示す。
HNB制御と比較して647ナノメートルでの吸光度の低下が観察され、これは遷移金属の存在下でのHNB複合体の形成に対応した。このアッセイの応用を実証するために、2つのタグ付き膜足場タンパク質、MSP1E3D1、MSP2N2、およびジオバクター硫黄減少から、新規の3ヘム、c型シトクロムGSU0105を分析した。GSU0105の各画分のタンパク質とニッケルイオン含有量は互いに有意にシフトし、最もタンパク質を含むMSP1E3D1およびMSP2N2の画分もニッケル含有量が最も高かった。
また、動員された金属親和クロマトグラフィーを用いて収集した分画の中で金属含有量が均等に分布しないことも示した。すべてのサンプルでブランクを適切かつ一貫して混合し、すべてのサンプルでブランクのインキュベーション時間を均等にすることが最も重要です。特に関心のあるタンパク質の分画は、原子吸光分析またはICPMSでさらに分析して、金属汚染を確認し、キレートまたは強結合タンパク質金属イオンを検査することができます。
遷移金属浸出検出以外にも、この技術は、タンパク質への遷移金属イオンの結合親和性を測定するために使用することができます。試料中に存在するHNBおよび任意のニッケルは、それぞれ眼および皮膚に刺激を与える。手袋と目の保護を含む標準PPEは、方法の間に使用する必要があります。
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概要
本記事では、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて調製した試料中の金属量を定量するための簡便なアッセイを紹介します。この手法では、比色指示薬としてヒドロキシナフトールブルーを用い、検出にはUV-Vis分光光度計を使用します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 生化学
- 分析化学
- 金属アフィニティークロマトグラフィー
背景
- 遷移金属によるサンプルの汚染は、実験結果に影響を及ぼす可能性があります。
- 固定化金属アフィニティークロマトグラフィーは、生化学において一般的な手法です。
- 金属汚染を検出するための既存の方法は、複雑であるか、あるいは専用の装置を必要とする場合があります。
- 生化学研究室での日常的な分析に適した、簡便でアクセスの容易な方法が求められています。
研究目的
- 試料中の金属汚染を検出するための簡便なアッセイを提供すること。
- 生化学者が試料の純度を迅速に評価できるようにすること。
- 金属定量の際、一般的な実験器具を容易に利用できるようにすること。
使用した手法
- 比色指示薬としてのヒドロキシナフトールブルーの使用。
- 検出のためのUV-Vis分光光度法の適用。
- ニッケルNTAカラムおよびその他の金属アフィニティー樹脂を用いた試験。
- 既知濃度のニッケルストック溶液を用いた初期試験。
主な結果
- 本アッセイにより、金属汚染の迅速な評価が可能です。
- 結果は標準的なラボ技法を用いて得ることができます。
- 本手法は、さまざまな金属親和性レジンに適応可能です。
- ユーザーは、初回試験を通じてワークフローに習熟することができます。
結論
- 提案されたアッセイにより、金属汚染の検出が簡便になります。
- 一般的なラボ設備を用いており、平均的な生化学者が容易に実施可能です。
- 本手法により、金属アフィニティークロマトグラフィーで調製したサンプルの信頼性が向上します。
よくある質問
産業界における重要性
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）カラムからの金属溶出は、酵素活性を阻害し、バイオ医薬品の研究開発におけるアッセイの信頼性を損なう遷移金属汚染を引き起こします。本プロトコルでは、汎用的なUV-Vis分光光度計とヒドロキシナフトールブルー（HNB）を用いて、このような汚染を定量するための簡便かつ容易に実施可能な手法を提示し、特殊な装置を使用せずに日常的な品質管理を可能にします。標準的な研究室設備でナノモーラーレベルの感度を実現することで、本アッセイは初期段階のターゲットバリデーションおよびタンパク質精製ワークフローにおけるデータの完全性をサポートします。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 観察された酵素阻害が標的の生物学的特性によるものか、あるいは金属汚染に起因するものかを判別することを可能にし、標的バリデーションにおける偽陽性を減少させます。
- 運用的価値： 既存のUV-Vis分光光度計と一般的な緩衝液を使用するため、新しい設備投資を行うことなく、探索チーム全体で迅速に導入することが可能です。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 647 nmで金属イオンの定量的読み取りを可能にし、IMAC精製における溶出レベルとフラクション純度の相関関係を明らかにします。
- 運用上の価値： タンパク質バリアントやレジン間での汚染評価を標準化し、Hisタグタンパク質調製に向けた再現性のあるアッセイ開発を支援します。
トランスレーショナル＆前臨床研究
- 科学的価値： 機能解析に先立ち、精製タンパク質がメタルフリーであることを確認することで、その後のターゲット結合研究における予測信頼性を向上させる。
- 運用の価値： タンパク質バッチの出荷基準を設けることで、前臨床薬効試験への移行前に、継続または中止の判断を可能にする。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法はIMAC精製と、その後の生化学的または生物物理学的特性解析との間に位置づけられ、酵素反応速度論、結合アッセイ、または構造解析を行う前の、サンプルの純度を確認するためのチェックポイントとして機能します。
- 探索生物学：酵素活性またはタンパク質相互作用データにおける金属介在性のアーティファクトを排除することで、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：精製タンパク質画分に、化合物スクリーニングの結果を歪ませる可能性のある阻害性遷移金属が含まれていないことを確認し、アッセイの準備を万全にします。
- 分析：647 nmにおける吸光度変化の定量値を算出し、ロット間比較のためのマイクロモーラー濃度の金属濃度計算を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：金属汚染がターゲットのバリデーションやバイオマーカーの測定を妨げないようにすることで、精製品質を前臨床試験の継続性に結びつけます。
- エンタープライズ再利用：樹脂の種類やターゲットタンパク質に関わらず、あらゆるIMACベースの精製に適用可能な再利用可能なQCステップとして機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 酵素ベースのアッセイにおける一般的な生化学的ノイズの原因を排除することで、ターゲットバリデーションの信頼性を向上させます。
- 運用の価値： 定義されたインキュベーションおよび測定パラメータを用いた比色法を採用することで、ラボ間の再現性と標準化を強化します。
- 戦略的価値： 未検出の金属阻害による実験失敗のリスクを軽減し、リード化合物同定キャンペーンにおける資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 確認された純度に基づいてタンパク質ターゲットのリスク調整後の優先順位付けを可能にし、初期探索におけるより適切なリソース配分を支援します。
実施上の検討事項
- UV-Vis分光光度法およびHNB試薬の基本的な溶液調製に関する知識が必要です。
- 石英キュベットおよび647 nmの吸光度測定が可能な分光光度計の使用環境に依存します。
- 正確なdelta-AB値を算出するためには、一貫したサンプルの希釈およびインキュベーション時間の管理が不可欠です。
- 強い固有吸光度を持つタンパク質や、647 nmで色干渉を起こすタンパク質については、最適化が必要な場合があります。
- 高い信頼性で金属定量を行う必要がある場合は、AASやICPMSなどの直交する方法と組み合わせて確認することが推奨されます。
