薄層クロマトグラフィーによるミコール酸バリアントの分離:極性に基づいてマイコバクテリア細胞壁脂質を分離する方法

マイコバクテリアの細胞壁には、ミコール酸のさまざまな変種、つまり保存されたアルファ鎖を持つ長鎖脂肪酸が含まれています。それらのベータ鎖には構造の違いが存在し、その結果、異なるミコール酸の極性に変化が生じます。

薄層クロマトグラフィー、またはTLC(液体クロマトグラフィー技術)を使用してバリアントを分離するには、マイコバクテリアの細胞壁脂質を目的の有機溶媒に取ります。固定相として機能する吸着剤の薄層で事前にコーティングされたTLCプレートの基部近くに脂質を見つけます。

有機溶媒(移動相)の入ったジャーにプレートを入れ、液面がサンプルスポットより下にあることを確認し、マイコール酸の早期拡散を防ぎます。

実行中、移動相は毛細管現象によってプレート上の吸着剤層の小さな細孔を通って上昇します。最終的に、ミコール酸は溶媒に溶解し、上向きに移動します。

より極性のマイコール酸変異体は、分子間力を介して極性固定相によって一時的に吸着され、それらの上向きの動きを妨げます。極性の低いマイコール酸は、非極性移動相に残り、さらに移動します。

移動の違いにより、マイコール酸の変異体が離散的なバンドに分離します。

完了したら、乾燥したプレートにリン酸染色をスプレーします。プレートを加熱して脂質の存在下で汚れを減らし、バンドに濃い緑色

TLCでサンプルを分析するには、TLCチャンバーの片方の壁をろ紙で覆います。チャンバーの角にワセリンを加えてチャンバーを密閉します。溶媒混合物をろ紙の上にデカントし、残りの量の溶媒をTLCチャンバーの底に加えます。TLCチャンバーを少なくとも20分間閉じて飽和させます

、ガラス管内の脂質を200〜1,000マイクロリットルのクロロホルムに溶解し、毛細管ガラス管を使用して10マイクロリットルの脂質クロロホルム懸濁液をTLCプレートに直接塗布します。サンプルを 5 分間乾燥させた後、プレートを飽和した TLC チャンバーに挿入し、移動相を TLC に通します。

溶媒がプレートの上端から1センチメートルに達したら、シリカが完全に乾燥するまでプレートを層流下に置きます。次に、乾燥したプレートに15〜20ミリリットルの10%モリブダトリン酸エタノール水和物をプレートが明るい黄色になるまでスプレーし、プレートを摂氏120度で2〜5分間加熱します。