サイズ排除クロマトグラフィーに基づく細菌細胞外小胞の分離:グラム陰性細菌外膜小胞の不均一集団をそのサイズに基づいて分離する技術

適切な培養条件下では、グラム陰性菌は貨物を運ぶ外膜小胞(OMV)を上清に放出します。これらの小胞は、細胞コミュニケーションを媒介する不均一なサイズの小さな球形構造です。

OMVの異なるサイズのサブ集団を分画するには、マトリックスをサポートするために、ベースに適切なフィルターを備えた空のサイズ排除クロマトグラフィーカラムを取ります。

定義された孔径の化学的に不活性な球状ビーズからなるゲルろ過マトリックスでカラムを充填し、大型のOMVが侵入しないようにサイズが最適であることを確認します。最適な精製のために、ビーズの乾燥を防ぐために適切なバッファーでカラムを平衡

OMV、タンパク質凝集体、および核酸の異なるサイズの亜集団を含む細菌培養上清をカラムの上部にロードします。サンプルを重力で動かします。

サンプルがカラムを通過すると、細孔に入らない大きなOMVがゲルビーズ間の粒子間空間を通って移動し、最初に溶出されます。一方、より小さなOMVはマトリックス細孔を貫通し、より長い経路をたどり、後で溶出します。

集体と核酸はサイズが小さいため、マトリックス内のさまざまな細孔に入り、カラム内での保持時間が最も長くなり、最後の画分として溶出します。個別のOMV溶出液を収集し、さらなる分析のために保存します。

まず、ガラス棒を使用してゲルろ過媒体のストックボトルを混合し、カラムを充填するのに必要な量と約50%の過剰分をガラスボトルに注ぎます。ビーズを落ち着かせ、余分な液体をデカントします。ビーズを溶出バッファーに再懸濁して、約70%ゲルと30%バッファーの最終溶液にし、真空下で溶液を脱気します。

カラムをリングスタンドに垂直位置に取り付け、カラムに溶出バッファーを充填して壁を濡らしてから、約1センチメートルしか残らないまでバッファーを排出します。次に、ゲルビーズを慎重にカラムにピペットで入れ、同時に余分なバッファーを排出してビーズが沈降しないようにし、カラムがカラムリザーバーの底から約2センチメートル下の高さまで充填されるまで

サンプルをロードする前に、真空下で溶出バッファーを脱気します。カラム容量の約2倍の溶出バッファーでカラムを洗浄します。緩衝液がゲル層の上部に達したら、表面を乱すことなく、1リットルあたり100〜200ナノモルの外膜小胞サンプル2ミリリットルをゲル層の上に慎重に加え、サンプルをゲルに入れます。

ゲル層を乱すことなく、溶出バッファーをゆっくりとカラムに加え、50ミリリットルのチューブをカラムの下に置きます。カラムの乾燥を防ぐため、同時にカラム上部に溶出バッファーを添加します。

20ミリリットルの溶出液を集めた後、1.5ミリリットルのチューブのラックをカラムの下に置きます。各チューブに合計 96 個の 1 ミリリットル画分を収集します。サンプルを採取しながら、溶出バッファーをカラムに連続的に加えます。カラムを洗浄するには、1 カラム容量の 0.1 モル水酸化ナトリウムをカラムに通し、続いて 2 カラム容量の溶出バッファーを流します。