JoVE 実験百科事典
生物学的技法
0 回視聴 • 6:59 分 • July 8th, 2025
多量体タンパク質複合体は、さまざまな生物学的プロセスに不可欠です。
マルチマー-PAGEによって天然状態のタンパク質複合体を分離するには、目的の複合体を含む組織ライセートを採取します。ライセートをBlueネイティブPAGEのゲルアセンブリにロードします。
青色陰イオン色素を含むアルカリ性ランニングバッファーをシステムに充填し、電源に接続します。アルカリ性のpHでは、色素分子がタンパク質複合体に結合し、変性することなく全体的に負の電荷を帯びます。この負に帯電した無傷のタンパク質複合体は、青いバンドとしてゲル内を移動します。
最小限の実行に続いて、無傷のタンパク質が分離ゲルに移動するのを待って、複合体を含むストリップを切除します。架橋剤を含む溶液でストリップをインキュベートし、その反応基が近位タンパク質のアミン基と相互作用し、多量体複合体を安定化させます。
架橋溶液を急冷試薬に置き換えて、未反応の架橋剤の活性を沈静化します。SDS(陰イオン性界面活性剤)を加えると、本来のサイズと構成を維持しながら、無傷のタンパク質複合体に均一な負の電荷が与
えられます。処理したストリップを新しいカセットに入れ、新しいSDS-PAGEゲルに再キャストします。電気泳動中、負に帯電した架橋タンパク質複合体は正の陽極に向かって移動し、ゲル内で高分子量バンドとして現れます。
この手順を開始するには、テキストプロトコルに記載されているように、青色の天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動の準備をします。電極を電源に接続し、色素バンドが分離層に約2センチメートル進むまで、ゲル中のタンパク質を150ボルトで電気泳動します。この時点で、電源を停止して切断します。
電気泳動装置を分解した後、ゲルカセットのガラス板を分離します。スタッキング層を取り外して廃棄します。
染料の前面の下端のすぐ下にあるゲルを慎重にカットし、このカットをできるだけ滑らかでまっすぐにするように注意します。次に、未使用のジェル片を捨てます。ジェルストリップの端に沿って未使用の部分を切り取ります。
ストリップを小さな容器に10ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水に慎重に入れ、章動によって30分間穏やかに混合して平衡化します。平衡化後、PBSを廃棄し、別の10ミリリットルと交換します。
ジメチルスルホキシドに溶解した500マイクロリットルの25ミリモルDSPをPBSにピペットで入れ、以前と同様に30分間混合を続けます。30分後、DSP溶液を注ぎます。2%ドデシル硫酸ナトリウムを含む0.375モルのTris-HCl、pH 8.8、10ミリリットルを加えて、未反応のDSPを急冷します。章動を15分間続けます。
ゲルストリップが急冷されている間に、標準的な方法に従ってSDS-PAGEゲル溶液を調製します。重合試薬は添加しないでください。急冷後、
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