ネイティブタンパク質複合体を分離するためのMultimer-PAGE:青色のネイティブPAGEとSDS-PAGEからなるハイブリッド分離技術により、組織ライセートからインタクトな多量体タンパク質を分離します

多量体タンパク質複合体は、さまざまな生物学的プロセスに不可欠です。

マルチマー-PAGEによって天然状態のタンパク質複合体を分離するには、目的の複合体を含む組織ライセートを採取します。ライセートをBlueネイティブPAGEのゲルアセンブリにロードします。

青色陰イオン色素を含むアルカリ性ランニングバッファーをシステムに充填し、電源に接続します。アルカリ性のpHでは、色素分子がタンパク質複合体に結合し、変性することなく全体的に負の電荷を帯びます。この負に帯電した無傷のタンパク質複合体は、青いバンドとしてゲル内を移動します。

最小限の実行に続いて、無傷のタンパク質が分離ゲルに移動するのを待って、複合体を含むストリップを切除します。架橋剤を含む溶液でストリップをインキュベートし、その反応基が近位タンパク質のアミン基と相互作用し、多量体複合体を安定化させます。

架橋溶液を急冷試薬に置き換えて、未反応の架橋剤の活性を沈静化します。SDS(陰イオン性界面活性剤)を加えると、本来のサイズと構成を維持しながら、無傷のタンパク質複合体に均一な負の電荷が与

処理したストリップを新しいカセットに入れ、新しいSDS-PAGEゲルに再キャストします。電気泳動中、負に帯電した架橋タンパク質複合体は正の陽極に向かって移動し、ゲル内で高分子量バンドとして現れます。

この手順を開始するには、テキストプロトコルに記載されているように、青色の天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動の準備をします。電極を電源に接続し、色素バンドが分離層に約2センチメートル進むまで、ゲル中のタンパク質を150ボルトで電気泳動します。この時点で、電源を停止して切断します。

電気泳動装置を分解した後、ゲルカセットのガラス板を分離します。スタッキング層を取り外して廃棄します。

染料の前面の下端のすぐ下にあるゲルを慎重にカットし、このカットをできるだけ滑らかでまっすぐにするように注意します。次に、未使用のジェル片を捨てます。ジェルストリップの端に沿って未使用の部分を切り取ります。

ストリップを小さな容器に10ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水に慎重に入れ、章動によって30分間穏やかに混合して平衡化します。平衡化後、PBSを廃棄し、別の10ミリリットルと交換します。

ジメチルスルホキシドに溶解した500マイクロリットルの25ミリモルDSPをPBSにピペットで入れ、以前と同様に30分間混合を続けます。30分後、DSP溶液を注ぎます。2%ドデシル硫酸ナトリウムを含む0.375モルのTris-HCl、pH 8.8、10ミリリットルを加えて、未反応のDSPを急冷します。章動を15分間続けます。

ゲルストリップが急冷されている間に、標準的な方法に従ってSDS-PAGEゲル溶液を調製します。重合試薬は添加しないでください。急冷後、青色のネイティブゲルストリップを室温に戻し、ストリップを新しいゲルカセットにキャストします。

これを行うには、ゲルを慎重に持ち上げ、清潔なゲルカセットスペーサープレートに置きます。ストリップの向きを前の方向から反転させ、染料前面の下部が新しいカセットの上部に最も近い方向にします。

ストリップの上端がカバープレートの上端と同じになるようにストリップを配置します。染料の前面がガラス板の水平端と平行であることを確認してください。切除したストリップの片側をスペーサー壁の1つに押し付け、反対側にゲルを注ぎ、タンパク質標準またははしごをロードするためのスペースを残します。ゲルストリップの下端にギザギザや凹凸のある部分がある場合は、慎重に切り取ります。

ゲルストリップが正しく配置されたら、カバープレートをスペーサープレートの上に置きます。穏やかな圧力を加えて、閉じ込められた気泡を押し出します。製造元の指示に従って、ゲル注入装置の組み立てを続けます。

天板を装着するとゲルストリップがずれることがあります。ストリップを天板の端に少しぶら下げておくと、へらで調整してずれを修正できます。

分離ゲルバッファーに重合試薬を加え、血清学的ピペットを使用して調製したゲルカセットに注ぎます。ゲルカセットを切除した青色のネイティブPAGEゲルストリップの約2センチメートル下まで満たし、スタッキング層のためのスペースを残します。次に、注いだゲルの上に100マイクロリットルのブタノールを加え、ブタノールを注ぐ前に分離層の重合に30分間待ちます。

次に、重合試薬をスタッキングゲル溶液に加えます。血清学的ピペットを使用して、スタッキング層を注ぎ、ゲルカセット内の残りの空きスペースをすべて埋めます。スタッキング層を注ぐときにゲルカセットを傾けて、ゲルストリップの下のスペースを埋め、気泡が閉じ込められないようにします。

スタッキングゲルバッファーがゲルストリップの下の空きスペースを埋めたら、ゲルカセットを徐々に水平な足場に戻します。切除したゲルストリップの隣の空きスペースを、ほぼオーバーフローするまでスタッキングゲルバッファーで埋め続けます。次に、スタッキング層を30分間重合させます。

スタッキング層が重合したら、製造元の指示に従って、注入装置からゲルカセットを取り出し、蒸留水ですすぎ、電気泳動装置を組み立てます。

内部チャンバーを1X SDS-PAGEランニングバッファーで完全に満たします。次に、メーカーが指定したレベルまで外チャンバーを満たします。切除したゲルストリップの隣のスペースに、分子量ラダーまたは適切なタンパク質標準試料をロードします。

電極を電源に取り付け、サンプルを120ボルトで電気泳動します。クマシー染料がゲルから落ちたら、実行を停止し、電源を切ります。エレクトロブロッティングと抗体ベースのタンパク質検出の標準的な方法を使用してゲルを分析します。