Name: 多量-PAGE：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学ぶ 組織リゾレートからの天然タンパク質複合体の捕捉と分離法。ブルーネイティブPAGEとSDS-PAGEを組み合わせた二次元電気泳動システムにより、不安定なタンパク質相互作用を近天然条件下で安定化し、複合体の同定と解析を可能にします。

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NIH / NIDA DA034783でサポートされています。私たちは、多量-PAGEでの技術支援のためブライアン・A・キリンガー感謝します。

1.組織調製<ol><li> 4X BN-PAGE試料緩衝液（200mMのビス（2-ヒドロキシエチル）アミノ - トリス（ヒドロキシメチル）メタン（BIS-TRIS）の10mLの、200mMのNaCl、40％のw / vのグリセロール、0.004％ポンソーS、pHが7.2を準備）。 注：このストック溶液は、事前に行われ、4℃で保存することができます。 </li><li> 1×商用プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む750μLのdH 2 Oで4倍のサンプルバッファー250μLに希釈します。ボルテックスし、氷上で寒さ。 </li><li>クリーンダウンスホモジナイザーの30ストロークで1 mLの1Xの氷冷BN-PAGEサンプル緩衝液中に標的組織20mgを均質化します。 注：この実証実験では、標的組織が全体のラットの脳組織です。均質化の後、試料を可溶化した膜タンパク質の電気泳動を可能にするために、中性洗剤等の2％ジギトニンで処理してもよいです。 </li><li> 1.5mLのマイクロ遠心チューブにホモジネートを転送し、そして不溶性の細胞内容物をペレット化するために30分間、14,000×gで遠心分離。 AFTERの遠心分離は、氷の上にきれいなチューブに上清をデカント。 </li><li>ビシンコニン酸（BCA）または類似のタンパク質定量アッセイを用いて上清のタンパク質濃度を測定するために、製造業者の指示に従います。 </li><li>ホモジネート試料（単数または複数）が、界面活性剤が含まれている場合、0.25％クマシーにホモジネート溶液をもたらすのに十分な、水溶液中の5％クーマシーブルーG-250の量を加えます。 </li></ol> 2. BN-PAGE <ol><li> ランニングバッファーを1×500mLのを作るために0.002％クーマシーブルーを含有する475ミリリットルのdH 2 Oに25 mLの20倍ブルーネイティブ（BN）泳動緩衝液ストック（1.0Mビス-トリス、1.0 Mトリシン、pHが6.8）を希釈します。 <ol><li>サンプルは界面活性剤が含まれている場合、代わりに0.02％クーマシーを含有する1×ランニングバッファー250mLのと何を含まない別の250ミリリットルを加えます。 </li></ol></li><li> 4°Cまで冷却バッファ（S）。 </li><li>きれいにし、製造者の指示に従ってカセットを注入ポリアクリルアミドゲルを組み立てます。 </li><li&gt;標準レシピ7に記載の BNポリアクリルアミドゲル（10％Tスタッキング層、6％T解決層）を注ぎ、そしてウェルコームを置き。 </li><li>ゲルが重合した後、のdH 2 Oを用いてカセットをリンスし、製造者の指示に従って電気泳動装置を組み立てます。 </li><li> ウェルコームを取り外し、1×BN-PAGEランニング緩衝液で井戸を埋めます。サンプルがロードされるまで緩衝液で全内部チャンバを充填避けます。 <ol><li>サンプルは界面活性剤を含む場合は、0.02％クーマシーブルーを含有する緩衝液でウェルを満たします。 注：4°Cで、手順2.7から2.9を実行します。 </li></ol></li><li>ゲルローディングチップを用いて、所望のウェルに20μgのタンパク質を含有するホモジネートの体積をピペット。未使用のウェルに1×BN-PAGEサンプル緩衝液の等量をピペット。 注：に追加したホモジネートの適切な量を計算するためにBCAアッセイから決定されたタンパク質の濃度を使用し井戸。 </li><li> サンプルがロードされた後、1×BN-PAGEランニング緩衝液を用いて、内部チャンバを充填します。ゲルが完全にバッファに沈めていることを確認します。次に、製造者によって示されるレベルに1×ランニングバッファーと外側室を満たします。 <ol><li>サンプルは界面活性剤を含む場合は、0.02％クーマシーブルーを含有する1×緩衝液、及び染料を含まない1×ランニングバッファーと外側チャンバと内部チャンバを充填します。 </li></ol></li><li>電源に電極を接続し、染料バンド層を解決するに〜2cmに進行するまで、150 Vでゲル中のタンパク質を電気泳動。停止し、電源を切断します。 </li></ol> 3.架橋注：4°Cで、手順3.1から3.6を実行します。 <ol><li>電気泳動装置を分解し、ゲルカセットのガラス板を分離します。スタッキング層を取り外して捨てます。 </li><li>注意深くだけ染料前面の下縁下ゲルを切りました。取るこのカットとして滑らかで真っ直ぐとして可能にするように注意し、その後ゲルの未使用部分を捨てます。これは、ホモジネート試料中のすべてのタンパク質が含まれていますポリアクリルアミドゲルの〜2cm幅、水平方向のストリップを、残します。 </li><li>ゲルストリップの縁に沿って任意の未使用部分を切り取ります。 </li><li>注意深く小さな容器に10mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中にストリップを配置し、そして穏やかに平衡化する30分間章動によって混合します。 </li><li>平衡化後、破棄し、別の10 mLのPBSに置き換えます。ピペット500μLの25mM DSPはPBSにジメチルスルホキシドに溶解し、そして30分間、上記のように（ステップ3.4）混合を続けます。 </li><li> DSP溶液をオフに注ぎます。未反応のDSPをクエンチするために、2％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む0.375 Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリス-HCl）、pHが8.8の10ミリリットルを加えます。 15分間章動を続行します。 </li></ol> 4. SDS-PAGE <ol><li>ゲルストリップが急冷されている間、SDS-PAを準備標準的な方法9に従ってGEゲル溶液。重合試薬を追加しないでください。 </li><li> 急冷した後、室温にΒΝゲルストリップを返し、新しいゲルカセットの中にストリップをキャスト。 <ol><li>これを行うには、慎重にゲルをピックアップし、クリーンゲルカセットのスペーサプレートの上に置きます。 </li><li>オリエントストリップ色素フロントの底部（ 即ち 、BN-PAGE中に遠くに移動側は新たなカセットの上部に最も近いなければならない新たなカセットの上部に最も近いので、ゲルストリップは、その前から反転されなければなりませんオリエンテーション）。 図3を参照してください。 </li><li>その上縁があっても、カバープレートの上端がされる場所であるようにストリップを配置する（ すなわち 、それは新たなゲルの上部にあるであろう）。色素の先端がガラス板の水平エッジに平行であることを確認します。 </li><li>トンの余地を残し、スペーサ壁の一つに対して切除されたストリップの一方の側を押してくださいゲルのために彼の他の側面を注入すると、タンパク質の標準またはラダーをロードします。 </li><li>ゲルストリップの下端は、任意のギザギザや不均一な領域が含まれている場合は、慎重にそれらを切り取ります。存在する場合、それらは、ゲル中にトラップ気泡が注ぐだろう。 </li><li>ゲルストリップが正しく配置されると、スペーサプレートの上にカバープレートを置きます。閉じ込められた気泡を押し出すために穏やかな圧力を適用します。 </li><li>製造業者の指示に従ってゲル注入装置を組み立てるために続けます。 </li></ol></li><li>分離ゲル緩衝液に重合試薬を追加し、及び血清学的ピペットを使用して、調製したゲルカセットにそれを注ぎます。スタッキング層のための余地を残すために、切除したBN-PAGEゲルストリップ下の約2 cmのゲルカセットを記入してください。 </li><li>注ぎゲルの上に100μLのブタノールを追加し、解決層の重合のために30分を許可します。ブタノールをオフに注ぎます。 </li><li> スタッキングゲル溶液に重合試薬を追加します。 serologを使用してiCalのピペット、ゲルカセット内の残りのすべての空のスペースを埋めるためにスタッキング層を注ぎます。 <ol><li>それはゲルストリップの下の空間を満たすように、スタッキング層が注がれ、気泡がトラップされないようにゲルカセットを傾けます。 </li><li>スタッキングゲル緩衝液はゲルストリップの下の空のスペースを埋めるように、徐々にレベル足場にゲルカセットを返します。 </li><li>ほぼオーバーフローそれまでは、次のスタッキングゲル緩衝液を用いて切り出したゲルストリップに空きスペースを埋めるために続けます。 </li></ol></li><li>スタッキング層は、30分間重合することができます。 注：ゲルが重合されている間10×SDS-PAGEのランニング緩衝液（250mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）、1.9 Mグリシン、1％SDS）を作ります。これはまた、予め作られ、室温で保存することができます。 </li><li> 1xの作業バッファを作るために450ミリリットルのdH 2 Oに50 mLの10倍のSDS-PAGEランニングバッファーの株式を希釈します。 </li><li>スタッキング層が重合した後、注入からゲルカセットを除去装置は、のdH 2 Oでリンスし、そして製造者の指示に従って電気泳動装置を組み立てます。 </li><li>次いで、製造業者によって示されるレベルに外側チャンバを満たす、1×SDS-PAGEのランニング緩衝液で完全に内部チャンバを充填します。 </li><li>次分子量ラダーまたは適切なタンパク質標準で切り出し、ゲルストリップにスペースをロードします。 </li><li>電源に電極を取り付け、そしてクマシー色素がゲルをオフに実行すると120 V.でサンプルを電気泳動、停止して電源を切断します。 </li><li> 10結合抗体によるエレクトロ及びタンパク質検出の標準的な方法を用いてゲルを分析します。 </li></ol>

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</ol>

著者は、開示することは何もありません。

タンパク質間相互作用は、生き物が行っすべてのタスクのために重要です。このため、彼らは厳しい調査と研究の対象となっています。多量-PAGEは、捕捉分離、およびタンパク質複合体の広い範囲を分析するための新規な方法です。我々は以前に疾患関連タンパク質のαシヌクレイン11のoligimerizationを研究への適用可能性を実証しています。しかし、 図2に示されているように、多くのタンパク質複合体に拡張可能です。タンパク質複合体を研究する他の方法と比較した場合、多量-PAGEは、その単純さと簡潔さのが有利です。組織サンプルから完全に分離されたSDSゲルまでの時間は約8時間です。検出は、典型的なウェスタンブロットによって行うことができるので、プロトコルはプルダウン実験に関連したものよりもはるかに低い検出限界で、未修飾組織溶解物に対して行うことができます。さらに、ほとんどの設備の整った分子生物学的ラボratoriesは少し先行投資と技術を実行することができるようになります。後で説明するように、多量-PAGEに関連した課題の多くは、トラブルシューティング、研究の各タンパ...

<html>正常な細胞機能は、タンパク質-タンパク質相互作用1、2に依存しています。その結果、ヒトの疾患は、しばしば、種々のタンパク質複合体3の組立及び動作の摂動によってマークされます。このような相互作用を特徴付ける能力は極めて重要です。これらの相互作用を検出するための現在の手段は、多くの場合、それらの相互作用パートナーのプルダウンに続いて、標的タンパク質の精製を必要としています。従来の精製は、分画遠心分離、沈殿、及び/又はクロマトグラフィー4によって達成されます。これらの方法は、時間がかかる各標的タンパク質のために変更しなければならない、としばしば低い収率につながります。近代的な精製法は、捕捉分子5に結合されたビーズを搭載したカラム上の免疫沈降または抽出し、タンパク質をターゲットにするペプチドタグの融合を伴いますこれは多くのタンパク質に拡張可能であるが「&gt; 6。、それは潜在的にそれらの通常の結合パートナーに対する親和性の異なる構築物をもたらす、標的の配列の改変を必要とする。いくつかのタンパク質-タンパク質相互作用の微妙な性質は、この方法が適用できない場合があり手段多くのシナリオである。さらに、タンパク質 - タンパク質相互作用をマッピングするために使用されるプルダウンアッセイは、制限された自由度とベイトタンパク質の非天然レベルに起因する正確な細胞画像を、キャプチャしないことができます。 理想的には、タンパク質複合体は、精製またはプルダウンを必要とせず、その天然状態で検出することができました。ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN-PAGE）をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）にあまり変性の代替として開発され、そして生物学的サンプル7からのいくつかのタンパク質との複合体の分離を可能にしました。しかし、BN-PAGE中のタンパク質は、LARに基づいて分離しますサイズ、電荷、立体構造、および他の分子との会合を含む変数のGE番号。これらの要因の相互作用は、多くの場合、タンパク質の同時分離、凝集体形成、および不十分なタンパク質バンドの解像度をもたらします。二次元ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、いくつかを解決し、すべてではないが、これらの問題8の。 天然の分離に関連する合併症を回避するために、何人かの著者は、組織溶解物4のタンパク質複合体を捕捉するために、例えばジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のようなアミン反応性架橋試薬（DSP）を使用します。これらの治療の溶解物は、変性およびタンパク質複合体の本来のサイズと化粧を維持しながら、SDS-PAGEによって分離することができます。しかしながら、架橋試薬ので、別の分子の近接性に基づいて、および組織溶解物中のタンパク質は、多くの自由度を有し、確率的に相互作用することができ、非特異的バックグラウンドの交差反応特に濃縮したサンプルでは、​​リンカーが高くなります。これは解釈が難しい結果につながる可能性があります。 ここでは、複合体混合物中のタンパク質集合体を分離および検出するために、マルチマー - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（マルチマー-PAGE）と呼ばれるハイブリッドBN-PAGE / SDS-PAGE法の使用を実証する。最初に、細胞溶解物をBN-PAGEを介してポリアクリルアミドゲルに懸濁する。次いで、溶解物含有ゲルを架橋試薬DSPと反応させる。疑似的に固定化され、ゲル上でわずかに分離された場合、タンパク質は非特異的に反応する可能性が低くなり、バックグラウンドの架橋剤の反応性が低下する。架橋後、ゲルバンドを摘出し、SDS-PAGEにより分離する。次いで、得られたゲルを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に典型的に関連する任意の手段によって分析することができる。この方法は、未精製の組織ライセート中の天然タンパク質複合体の分離および検出を可能にし、追加の精製またはプルダウを必要としないn個。

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&epsilon;-アミノカプロン酸</td><td>シグマ</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド</td><td>Acros有機物</td><td>164855000</td><td>有毒です。</td></tr><tr><td>アクリルアミド/ビサクリラミド 37.5:1 (40%T ストック溶液)</td><td>BioRad</td><td>161-0148</td><td>毒性。</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td></td><td>Σ A3678</td><td></td></tr><tr><td>ヤギからの抗ウサギIgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>ビシンコニン酸アッセイキット</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris</td><td>Sigma</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>ΣA9647</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブタノール</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1</td><td></td></tr><tr><td>化学発光基質キット</td><td>ThermoFisher</td><td>24078</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie blue G-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>ジチオビス(プロピオン酸スクシンイミジル)</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>22585</td><td></td></tr><tr><td>ドライ無脂ミルク</td><td>LabScientific</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>ストッププロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー78430</td><td></td></tr>塩<tr><td>酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A144SI-212</td><td>滴定用。苛性。</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A412-4PVDF</td><td>膜活性化用。毒性。</td></tr><tr>ウサギ<td>サンタクルス</td><td>バイオテクノロジーsc-7011-R</td><td></td>N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミンシグマT9281<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>N,N'-メチレンビスアクリルアミド</td><td>アクロス有機物</td><td>16479</td>毒性<td>からの</td></tr>モノクローナル抗&α;-シヌクレインIgG。<tr><td>NP40</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-872</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (tween-20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene fluoride transfer membranes</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウムモノベーシック</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Thermo Scientific</td><td>88265</td><td></td></tr><tr><td>SDS 溶液 (10% w/v)</td><td>BioRad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム モノベーシック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>トリシン</td><td>シグマ</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>トリス ベース</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (0.5 M バッファー、pH 6.8)</td><td>BioRad</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1.5 M バッファー、pH 8.8)</td><td>BioRad</td><td>161-0798</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント<</td></tr><tr><td>strong>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE Imagequant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9558-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJソフトウェア</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 マイクロプレートリーダー</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Former + スタンド</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロフュージ 22R 遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL ダウンス ホモジナイザー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td><td></td><td></td></tr>ック <tr><td>超音波組織ホモジナイザー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>FB120220</td><td></td></tr></tbody></table>

多量-page：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

単一タンパク質やペプチドを精製し、研究するための多くのよく開発された方法があります。しかし、ほとんどの細胞機能は、それらの結合は、非共有結合および精製技術により、容易に乱されるので、多くの場合、調査が困難であるタンパク質複合体の相互作用のネットワークによって行われます。この作業は、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて修飾されていない組織から天然タンパク質複合体を安定化し、分離する方法を記載しています。組織溶解物は、タンパク質がゲルに短い距離を移動するまで、電流が印加され、非変性ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル上にロードされています。移行されたタンパク質を含むゲルストリップは、次いで、切除し、共有結合タンパク質複合体を安定化アミン反応性架橋試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、と共にインキュベートします。架橋複合体を含有するゲルストリップは、次いでドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルにキャストされ、そしてT彼複合体が完全に分離されています。この方法は、それが安価で習得が容易であることを意味、技術と最も分子生物学者になじみの材料に依存しています。それは十分に非常に大きな複合体を分離する能力が制限され、かつ普遍的に成功していないものの、この方法は、十分に研究された複合体の多種多様をキャプチャすることができた、と関心の多くのシステムに可能性が適用されます。

この実証実験では、多量-PAGEは、全ラット脳溶解液で行われました。得られた分離されたタンパク質をポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜にブロットし、次いで複合体を形成することが知られているタンパク質に対する抗体でプローブしました。 図1は、2つの手段によってプロトコルの検証を示します。まず、架橋されたタンパク質が観察されたより高い分子量種が架橋試薬によって形成されている意味、還元剤の添加により切断可能であり、プロトコルの他のコンポーネント（ 図1A）に起因しないことを実証しています。第二に、我々は、架橋は、架橋が複合体タンパク質に特異的であり、ゲル上の近接を閉じるために起因するランダム反応性が最小化されることを意味し、界面活性剤（ 図1B）の添加に対して感受性であることを示しています。 図2は、その方法がRESPをキャプチャするために失敗したことを示していますiratory複合体IIが、それ以外は両方可溶性および膜結合複合体を捕捉する...

新規二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）システムが提示されるに結合アミン反応性タンパク質架橋剤を用いて修飾されていない組織溶解物から天然タンパク質複合体を安定化し、分離するための方法。

多量-PAGE：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

このプロトコルの全体的な目的は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、組織溶解液から抽出した天然状態のタンパク質複合体を捕捉、分離、および解析できるようにすることです。この手法は、通常であれば不安定なタンパク質間相互作用を天然に近い条件下で安定化させ、それらの同定とそれに続く解析を可能にするため、タンパク質を研究する研究者の助けとなります。この技術の主な利点は、一般的な生物学的手法を用いるため汎用性が高く、個々の研究者の目的に合わせて調整できることです。この手順を開始するにあたり、テキストプロトコルに従ってブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動の準備を行います。電極を電源に接続し、色素帯が分離ゲルに約2 cm進むまで、150 Vでタンパク質の電気泳動を行います。この時点で、泳動を停止し、電源を切断します。電気泳動装置を分解した後、ゲルカセットのガラス板を分離します。スタッキング層を取り除いて廃棄します。色素前線の下端のすぐ下でゲルを慎重に切り取り、この切断面ができるだけ滑らかで直線的になるように注意してください。次に、使用しなかったゲルの断片を廃棄します。ゲルストリップの縁にある不要な部分を切り落とします。ストリップを小さな容器に入れた10 millilitersのリン酸緩衝生理食塩水に慎重に配置し、平衡化させるために30分間、緩やかに攪拌します。平衡化後、PBSを廃棄し、新たに10 millilitersのPBSに交換します。ジメチルスルホキシドに溶解した25 millimolarのDSPを500 microliters、PBSにピペットで加え、同様に30分間混合し続けます。30分後、DSP溶液を注ぎ出して除きます。未反応のDSPをクエンチさせるため、2% sodium dodecyl sulfateを含む0.375 M HSCL（pH 8.8）を10 milliliters加えます。この状態で15分間保持します。ゲルストリップのクエンチ処理中に、標準的な方法に従ってSDS-PAGEゲル溶液を調製します。重合試薬は添加しないでください。クエンチ後、ブルーネイティブゲルストリップを室温に戻し、新しいゲルカセットにキャストします。その際、ゲルを慎重に拾い上げ、清潔なゲルカセットスペーサープレートの上に配置してください。ストリップを、前の向きから反転させ、染料前線の底部が新しいカセットの上部に最も近くなるように向けます。ストリップの上端が、カバープレートの上端が位置する場所と揃うように配置します。染料前線がガラスプレートの水平方向の端と平行であることを確認してください。切り出したストリップの一方をスペーサー壁の片側に押し付け、もう一方の側にはゲルの注入およびタンパク質標準品またはラダーを負荷するためのスペースを空けておきます。もしゲルストリップの下端にギザギザしていたり不均一な箇所がある場合は、注意深く切り落としてください。ゲルストリップが正しく配置されたら、スペーサープレートの上にカバープレートを重ねます。緩やかに圧力をかけ、内部に閉じ込められた気泡を押し出します。メーカーの指示に従って、ゲルの注入装置の組み立てを続けます。トッププレートを設置する際、ゲルストリップがずれることがあります。ストリップの上端をトッププレートから少しはみ出させておくと、スパチュラで調整してズレを修正できるため便利です。分離ゲルのバッファーに重合試薬を加え、セロロジカルピペットを用いて調製済みのゲルカセットに注ぎます。スタッキング層のためのスペースを確保するため、切り出したBlue Native PAGEゲルストリップの約2 cm下までゲルカセットを満たします。次に、流し込んだゲルの上にブタノールを100 µL加え、分離ゲルの重合のために30分間放置した後、ブタノールを捨てます。続いて、スタッキングゲルの溶液に重合試薬を加えます。セロロジカルピペットを用いて、ゲルカセットの残りの空きスペースをすべて埋めるようにスタッキング層を流し込みます。スタッキング層を注入する際、ゲルストリップの下の空間を満たし、気泡が閉じ込められないようにゲルカセットを傾けます。スタッキングゲルのバッファーがゲルストリップ下の空隙を満たすにつれて、徐々にゲルカセットを水平に戻します。切り出されたゲルストリップに隣接する空隙に、バッファーが溢れそうになるまでスタッキングゲルのバッファーを注入し続けます。次に、スタッキングゲルを30分間重合させます。スタッキングゲルが重合した後、ゲルスロットをキャスティング装置から取り出し、蒸留水で洗浄し、製造元の指示に従って電気泳動装置を組み立てます。内部チャンバーに1x SDS-PAGE running bufferを完全に満たします。次に、製造者が指示するレベルまで外槽を満たします。切り出したゲルストリップの隣の領域に、分子量マーカーまたは適切なタンパク質標準をロードします。電極を電源に接続し、120 Vでサンプルの電気泳動を行います。クマシー染料がゲルの下端まで流れたら、電気泳動を停止し、電源を切断します。標準的なエレクトロブロッティングおよび抗体を用いたタンパク質検出法を用いて、ゲルを解析します。ここでは、イムノブロットによるmultimer-PAGEのバリデーションを示します。捕捉されたキネシン複合体はdiphyo-3-itolによって切断され、高分子量凝集体がより小さな構成要素の架橋によって形成されていることが示されました。ここでは、SDSまたはTritonの濃度を上げて処理した脳ライセートにおいて、単量体alpha-synucleinの検出が増加し、可溶性オリゴマー四量体の検出が減少した様子が示されています。ここでは、ラット脳ライセート中の可溶性複合体を捕捉するために用いたmultimer-PAGEの代表的な結果を示します。タンパク質は免疫ブロットによって検出された。各タンパク質の予想される単量体重量を各レーンの下に示している。同様に、膜結合複合体のキャプチャーについてもここに示す。SDHA呼吸複合体IIのブロットに示されているように、Multimer-PAGEでは時に複合体を捕捉できないことがあります。この原因として考えられる説明については、テキストプロトコルに記載されています。この手法を習得し、適切に実施できれば、約8時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、天然タンパク質複合体のゲル内架橋、それに続くゲルの再キャスティング、および二次SDS-PAGEによる分離の手法を十分に理解できるはずです。アクリルアミドの取り扱いは極めて危険であるため、ゲルのキャスティング時には必ず個人用保護具を着用してください。本手順に従って分離・安定化させた複合体は、ゲルから溶出させるか切り出すことができ、研究者のニーズに応じて、免疫検出や質量分析を含む多くの手法で分析することが可能です。

multimer-page-method-for-capturing-resolving-protein-complexes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

細胞透過性架橋剤DSP [ジチオビス -...

不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

このビデオでは、我々は青いネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN - PAGE）により、多タンパク質複合体（MPCは）の特性について説明します。最初の次元では、透析の細胞溶解物を、個々のMPCを識別するために、BN - PAGEによって分離される。二次元目SDS -...

細胞溶解物からの多タンパク質複合体の解析のための青いネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN - PAGE）

このビデオでは、組織ホモジネートからネイティブタンパク質複合体を分離するための多量体PAGEについて説明します。この手法は、青色のネイティブPAGE技術とSDS-PAGE技術のハイブリッドです。分離された複合体は、細胞機能におけるそれらの役割について特徴付け、研究することができます。...

ネイティブタンパク質複合体を分離するためのMultimer-PAGE:青色のネイティブPAGEとSDS-PAGEからなるハイブリッド分離技術により、組織ライセートからインタクトな多量体タンパク質を分離します

ここでは、極低温固体ミリングによって、哺乳動物細胞を破壊し、得られた細胞粉末から細胞抽出物を生成し、そして抗体結合ミクロンスケールの常磁性ビーズ上にアフィニティー捕捉により、目的のタンパク質複合体を単離するためのプロトコルを説明します。...

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

ここでは、ラベルフリーの定量的質量分析法を用いたタンパク質相関プロファイリングに続く親和性タンパク質複合体の精製と青ネイティブPAGEによるそれらの分離のためのプロトコルを提示します。この方法は、異なるタンパク質複合体へのインタラクトームを解決するのに便利です。...

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

タンパク質複合体の建築はその機能は欠かせません。様々...

化学架橋と複合体タンパク質複合体の建築を学びそのまま蛋白質の複合体の質量分析法を組み合わせた

本稿では、二分子の相補性の親和性の浄化 (BiCAP) のプロトコルについて説明します。この手法は競合結合パートナーで形成された複合体と同様、国連複合体の個々 のタンパク質を除く、特定の分離と任意の 2...

解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体

タンパク質とタンパク質代謝の相互作用は携帯電話のすべての機能のために重要です。ここで、選択の蛋白質のこれらの相互作用の平行分析を可能にするプロトコルについて述べる。私達のプロトコルは、植物細胞培養用に最適化されたし、質量分析を用いたタンパク質と代謝物の検出と親和性の浄化を結合します。...

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

マイクロトームを用いて汎用性の高い解起性BN-MSプロトコルを高解像度の複合プロファイリング用に提示する。...

クライオスライシングBN-MS解析による高解像度複合プロファイリング

このプロトコルは、質量測光と新しいマイクロ流体システムを組み合わせて、低親和性のタンパク質間相互作用を調査します。このアプローチは、溶液中の高濃度の錯体を急速に希釈することに基づいており、低親和性測定を可能にし、質量測光の適用範囲を広げます。...

マイクロ流体と質量測光の結合によるマイクロモル濃度でのタンパク質複合体形成の解析

学ぶ 組織リゾレートからの天然タンパク質複合体の捕捉と分離法。ブルーネイティブPAGEとSDS-PAGEを組み合わせた二次元電気泳動システムにより、不安定なタンパク質相互作用を近天然条件下で安定化し、複合体の同定と解析を可能にします。

多量-PAGE：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法

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