多量-PAGE：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法
May 5th, 2017
新規二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）システムが提示されるに結合アミン反応性タンパク質架橋剤を用いて修飾されていない組織溶解物から天然タンパク質複合体を安定化し、分離するための方法。
このプロトコールの全体的な目標は、研究者がポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して組織溶解物から抽出された天然タンパク質複合体を捕捉、分離、および分析できるようにすることです。この方法は、天然に近い条件下で不安定なタンパク質会合を安定化させることができるため、タンパク質を研究する研究者を支援し、タンパク質の同定とその後の分析を可能にします。この技術の主な利点は、一般的な生物学的方法を使用しているため、広く適用でき、個々の研究者の目標に合わせて調整できることです。
この手順を開始するには、テキストプロトコルに記載されている青色のネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動を準備します。電極を電源に接続し、ゲル内のタンパク質を150ボルトで電気泳動し、色素バンドが分離層に約2cm進行します。この時点で、電源を停止して切断します。
電気泳動装置を分解した後、ゲルカセットのガラス板を分離します。スタッキングレイヤーを取り外して廃棄します。染料前面の下端のすぐ下にあるゲルを慎重にカットし、できるだけ滑らかでまっすぐにカットするように注意します。
その後、未使用のジェルを捨てます。ジェルストリップの端に沿って未使用の部分を切り取ります。ストリップを小さな容器内の10ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水に慎重に入れ、表記法で30分間穏やかに混合して平衡化します。
平衡化後、PBSを廃棄し、さらに10ミリリットルと交換します。500マイクロリットルの25ミリモルDSPをジメチルスルホキシドに溶解してPBSにピペットし、前と同じように30分間混合を続けます。30分後、DSP溶液を注ぎます。
0.375モルHSCL、pH 8.8の10ミリリットルで、未反応のDSPをクエンチするために2%ドデシル硫酸ナトリウムを含んでいます。15分間表記を続けます。ゲルストリップが急冷している間に、標準的な方法に従ってSDS-PAGEゲル溶液を調製します。
重合試薬は添加しないでください。急冷後、青色のネイティブゲルストリップを室温に戻し、ストリップを新しいゲルカセットにキャストします。これを行うには、ゲルを慎重に手に取り、清潔なゲルカセットスペーサープレートに置きます。
ストリップを元の向きから反転させ、染料の前面の下部が新しいカセットの上部に最も近いように向きを変えます。ストリップの上端がカバープレートの上端と同じになるようにストリップを配置します。染料の前面がガラスプレートの水平端と平行であることを確認してください。
切除したストリップの片側をスペーサー壁の1つに押し付け、反対側にゲルを注ぎ、タンパク質標準またははしごをロードするためのスペースを確保します。ジェルストリップの下端にギザギザや凹凸がある場合は、慎重に切り取ります。ゲルストリップが正しく配置されたら、カバープレートをスペーサープレートの上に置きます。
やさしく圧力をかけて、閉じ込められた気泡を押し出します。メーカーの指示に従って、ゲル注入装置の組み立てを続けます。トッププレートを装着すると、ゲルストリップがずれることがあります。
ストリップをトッププレートの端に少しぶら下げると、ヘラで調整してずれを修正できます。分離ゲルバッファーに重合試薬を添加し、血清学的ピペットを使用して調製したゲルカセットに注ぎます。ゲルカセットを切除した青色のネイティブPAGEゲルストリップの約2cm下に充填し、スタッキング層のためのスペースを確保します。
次に、注がれたゲルの上に100マイクロリットルのブタノールを加え、ブタノールを注ぎ出す前に、分離層の重合に30分間待ちます。次に、重合試薬をスタッキングゲル溶液に加えます。血清ピペットを使用して、スタッキング層を注ぎ、ゲルカセットに残っているすべての空きスペースを埋めます。
スタッキング層を注ぐときにゲルカセットを傾けて、ゲルストリップの下のスペースを満たし、気泡が閉じ込められないようにします。スタッキングゲルバッファーがゲルストリップの下の空きスペースを埋めたら、ゲルカセットを徐々に水平な足場に戻します。切除したゲルストリップの隣の空きスペースをスタッキングゲルバッファーで埋め続けます。
次に、スタッキング層を30分間重合させます。スタッキング層が重合した後、注入装置からゲルカセットを取り出し、蒸留水ですすぎ、製造元の指示に従って電気泳動装置を組み立てます。1x SDS-PAGEランニングバッファーで内部チャンバーを完全に満たします。
次に、製造元が指定したレベルまで外側のチャンバーを満たします。切除したゲルストリップの隣のスペースに、分子量ラダーまたは適切なタンパク質標準液をロードします。電極を電源に取り付け、サンプルを120ボルトで電気泳動します。
クマシー色素がゲルから流れ出したら、ランを停止し、電源を切断します。エレクトロブロッティングおよび抗体ベースのタンパク質検出の標準的な方法を使用してゲルを分析します。ここでは、マルチマーPAGEのバリデーションをイムノブロットで示しています。
捕捉されたキネシン複合体はジフィオ-3-イトールによって切断され、高分子量凝集体が小さな置換基を架橋することによって形成されることを示しています。ここに描かれているように、SDSまたはTritonの濃度を上げて処理した脳ライセートは、モノマーのα-シヌクレインの検出を増加させ、可溶性オリゴマーテトロマーの検出を減少させました。ここでは、ラット脳ライセート中の可溶性複合体を捕捉するために使用したmultimer-PAGEの代表的な結果を示します。
タンパク質はイムノブロットで検出しました。各タンパク質の予想単量体重量は、レーンの下に示されています。同様に、膜結合複合体の捕捉をここに示します。
Multimer-PAGEは、SDHA呼吸複合体2ブロットに示されているように、複合体の捕捉に失敗することがあります。これについて考えられる説明についての議論は、テキストプロトコルで見つけることができます。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約8時間で完了します。
このビデオを見れば、天然タンパク質複合体のゲル内架橋と、それに続くゲルの再キャストと二次SDS-PAGEによる分離の方法について十分に理解できるはずです。アクリルアミドの取り扱いは非常に危険であり、ゲルをキャストする際には個人用保護具を着用する必要があることを忘れないでください。この手順に続いて、分離された安定化複合体をゲルから溶出または切り出すことができ、研究者のニーズに応じて免疫検出や質量分析など、さまざまな手段で分析できます。
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概要
このプロトコルは、組織溶解物からネイティブタンパク質複合体を安定化し分離するための新しい二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）システムの方法を提示します。これは、ほぼネイティブ条件下でのタンパク質相互作用の分析を可能にします。
主要な研究要素
科学分野
- 生化学
- プロテオミクス
- 電気泳動
背景
- タンパク質複合体の理解は多くの生物学的研究にとって重要です。
- ネイティブタンパク質相互作用は不安定で分析が困難な場合があります。
- 一般的な生物学的方法によってこの技術の応用が容易になります。
- この方法はタンパク質分析に合わせたアプローチを可能にします。
研究目的
- 組織溶解物からネイティブタンパク質複合体を捕捉し分析すること。
- タンパク質相互作用の安定化により、より良い同定を可能にすること。
- 研究者にとって広く適用可能な方法を提供すること。
使用方法
- ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動の準備。
- 150ボルトでのタンパク質の電気泳動。
- ゲル内の染料バンドの進行のモニタリング。
- アミン反応性のタンパク質架橋剤の利用。
主な結果
- ネイティブタンパク質複合体の成功的な安定化。
- 組織溶解物におけるタンパク質の効果的な分離。
- ほぼネイティブ条件下でのタンパク質相互作用の同定。
結論
- この方法はタンパク質複合体の分析を強化します。
- 様々な研究目標に適応可能です。
- 一般的な方法の利用により研究者のアクセシビリティが高まります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Multimer-PAGE enables biopharma R&D teams to stabilize and resolve native protein complexes from tissue lysates under near-native conditions, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By preserving labile protein associations that are often lost in conventional purification, the method improves predictive confidence in pathway analysis and complex-based drug target identification. This approach enhances translational continuity from discovery through preclinical evaluation by providing reproducible, quantitative readouts of complex formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing native protein interactions without perturbing non-covalent bindings.
- Operational Value: Uses accessible blue-native and SDS-PAGE techniques familiar to most molecular biology teams, reducing specialized training needs.
- Predictive Value: Supports functional target validation by stabilizing complexes for downstream identification via immunoblot or mass spectrometry.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates resolved complex profiles that can serve as quantitative biomarkers for assay standardization across screening campaigns.
- Operational Value: Relies on inexpensive, widely available reagents and equipment, enabling scalable implementation in core facilities.
- Assay Readiness: Produces SDS-PAGE-separated complexes compatible with downstream detection methods like immunodetection, supporting high-content screening integration.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by preserving complex integrity for validation in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of complex formation under varying conditions (e.g., detergent or SDS exposure), informing target robustness.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on complex stability and abundance, reducing late-stage attrition due to mechanistic uncertainty.
Pipeline & Workflow Integration
Multimer-PAGE fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, providing a mechanistic bridge to preclinical validation by enabling analysis of native protein complexes in tissue-derived samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by capturing endogenous complexes from unmodified tissue lysates.
- Screening: Enables assay development through reproducible complex separation and detection, facilitating compound effect evaluation on target engagement.
- Analytics: Delivers quantitative separation of protein complexes via secondary SDS-PAGE, allowing comparison of conditions or treatments.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining complex stability for validation in disease models, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability rather than a single-use assay, adaptable across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein interaction networks.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through standardized gel-based workflows and familiar electrophoresis techniques.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets, minimizing investment in poorly validated mechanisms.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of complex formation and stability in native contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native PAGE and SDS-PAGE techniques, including gel casting and electrophoretic separation.
- Depends on access to electrophoresis apparatus, power supplies, and standard reagents such as DSP crosslinker and SDS.
- Necessitates cross-team standardization for consistent complex capture and detection across discovery and preclinical groups.
- Involves adaptation considerations for different tissue types and complex sizes, as separation efficiency may vary with molecular weight.
- Limited by challenges in resolving extremely large complexes and potential variability in crosslinking efficiency, as noted in source material.
