低頻度の体細胞変異を検出するための野生型ブロッキングPCR

野生型ブロッキングポリメラーゼ連鎖反応(WTB-PCR)は、DNAサンプル中の高存在量野生型対立遺伝子の増幅を阻害しながら、低存在量の変異対立遺伝子を選択的に増幅することにより点変異を検出します。

WTB-PCRは、ロックされた核酸、または相補的な鎖に特異的に結合するサンプルの野生型DNA鎖に相補的なLNA含有の修飾オリゴヌクレオチドを利用します。LNA結合は、DNAポリメラーゼの活性をブロックし、野生型テンプレートDNAの伸長を阻害します。

WTB-PCRを実行するには、ヌクレアーゼフリーの蒸留水中でdNTP、LNA、およびターゲット特異的フォワードおよびリバースプライマーを含むマスターミックスを取ります。

耐熱性DNAポリメラーゼ含有溶液をチューブに加え、混合物をPCRプレートのウェルにピペットで入れます。野生型DNAと変異型DNAを含むゲノムDNAサンプルをウェルに加え、PCRを開始します。

PCR中、高温を介した変性により二本鎖DNAが分離されます。分離された鎖はプライマーがアニールするためのテンプレートとして機能し、LNAは相補的な野生型DNA鎖に結合し、ブロッカー-野生型DNAハイブリッドを形成します。より高い温度では、DNAポリメラーゼはdNTPを添加し、プライマーDNAテンプレートを伸長します。

DNA-DNA複合体よりもLNA-DNAハイブリッドの融解温度が高いと、無傷のままに保たれます。LNAの修飾は、最終的にDNAポリメラーゼがLNA-DNAハイブリッドを伸長させるのをブロックし、その伸長を阻

数回のPCRサイクルにわたって、LNAを介したブロッキングは、サンプル中の野生型バリアントと比較して変異型アンプリコンの数を増加させ、それらの選択的検出を助けます。

フォワードプライマーとリバースプライマーは、相補的なシーケンシングプライマーのアニーリングを可能にするために、5'-M13配列で設計されました。ブロッキングオリゴヌクレオチドを、長さが約10〜15塩基になり、変異体濃縮が望まれる野生型テンプレートを相補するように設計します。

オリゴが短いほど、ミスマッチの識別が改善されます。高い標的特異性を達成するには、ブロッキングヌクレオチドを過剰に使用しないことが重要です。

ブロッキングオリゴヌクレオチドを設計するには、まずOligo ToolsのWebサイトに移動します。「オリゴ T_M 予測」ツールを選択します。新しいウィンドウが開きます。ブロックする野生型テンプレートの配列を「オリゴ配列」ボックスに貼り付けます。ブロッカーベースの前にプラス記号を追加してマークします。「計算」ボタンをクリックして、DNAブロッカー_{ハイブリッドのお}およそのTMを決定します。計算された融解温度が下のボックスに表示されます。

ブロッキングオリゴを、熱サイクル中の伸長温度より摂氏10〜15度高い融解温度にするように設計します。ここで、延長温度は摂氏72度です。溶融温度を調整するには、ブロッキングベースを追加、削除、または置き換えます。3〜4つのブロックCまたはGベースを長時間ストレッチすることは避けてください。

次に、二次構造の形成や自己二量体化を避けるために、Oligo Tools Web サイトのホーム画面に戻り、「Oligo Optimizer」ツールを選択します。新しいウィンドウが開きます。ブロックする野生型テンプレートのシーケンスをボックスに貼り付けます。ブロッキングベースを示すプラス記号を追加します。「二次構造」と「自己のみ」の2つのボックスを選択し、「分析」ボタンを押すと、ハイブリダイゼーションと二次構造のスコアが表示されます。

これらのスコアは、それぞれ自己二量体と二次構造の融解温度の非常に大まかな推定値を表しています。スコアが低いほど最適であり、ブロッカーとブロッカーのペアリングを制限することで達成できます。より低いスコアを達成するために、ブロッキングヌクレオチドを除去または再配置します。ここに示すMyD88用に最適化されたブロッキングオリゴヌクレオチドは、DNAブロッカーのハイブリッド融解温度と十分に低いハイブリダイゼーションおよび二次構造スコアのバランスをとっています。

ミノ酸Q262からI266をカバーするように設計されており、DNAポリメラーゼによる伸長と3'-エキソヌクレアーゼによる分解の両方を阻害する3'反転dTを特徴としています。プライマーが設計されたら、野生型ブロッキングPCRをセットアップし、付属のドキュメントに記載されているように、サーモサイクリングを実行します。