走査型電子顕微鏡による膜フリル形成の定量化

外部刺激装置は細胞を活性化し、さまざまな細胞活動に不可欠な三次元円形膜突出、または膜フリル形成を誘導します。

膜のフリル形成を視覚化するには、ベースにカバーガラスを含むマルチウェルプレートから始めます。カバーガラスの上部には培養マクロファージがあります。

これらのマクロファージを細胞を活性化する刺激分子で処理し、細胞骨格の再編成と膜突出の形成を促進します。細胞を固定液で重ね、タンパク質を架橋し、細胞構造を保存します。

完全な脱水のためにアルコール濃度を上げて固定マクロファージを処理します。臨界点乾燥機を使用してこれらのマクロファージを乾燥させ、水の痕跡を除去してイメージングを向上させます。

導電性テープを使用して、カバーガラスを走査型電子顕微鏡(SEM)の試料ホルダーに取り付けます。スパッタは、マクロファージを含むカバーガラスを薄い金属層でコーティングし、イメージング中の良好な電子伝導性を確保します。

カバーガラスをSEMチャンバーに入れます。電子ビームをカバーガラスに集束させます。電子ビームは金属でコーティングされたマクロファージの膜に当たり、膜表面から低エネルギーの二次電子を生成します。

3次元の突起は、膜の他の部分とは異なる方法で電子を散乱させ、細胞表面のこれらの特徴を強調します。検出器は、さまざまな細胞表面領域から散乱した電子を収集し、コントラスト画像を生成します。

SEM画像では、マクロファージが暗く見え、表面に明るい円形の突起があり、フリルの形成が確認されています。

まず

、オートクレーブ鉗子を使用して、滅菌ガラスカバーガラスを24ウェルプレートのウェルに入れます。次に、RAW264.7マクロファージを1ミリリットルあたり10〜⁶細胞の密度でカバーガラスに播種し、プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%の加湿インキュベーターで一晩インキュベートします。

翌日、各ウェルの培地を500マイクロリットルの新鮮な完全培地と交換し、次に、DMSOなどのビヒクルコントロールまたはEIPAなどのマクロピノサイトーシス阻害剤でマクロファージを30分間前処理します。次に、膜のフリルを促進するために、1マイクロモルのPMA溶液または1ミリリットルあたり100ナノグラムのマクロファージコロニー刺激因子などのマクロピノサイトーシス刺激剤で細胞を30分間処理します。

走査型電子顕微鏡用にセルを固定するには、ウェルから培地を吸引し、カバーガラスを氷冷PBSで2回洗浄します。次に、カバーガラスを固定液中で室温で30分間インキュベートし、続いて摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、細胞単層を乱すことなく、穏やかに洗浄し、カバーガラスを500マイクロリットルの0.1モルカコジル酸ナトリウムで15分間インキュベートします。500マイクロリットルの蒸留水で2回洗浄した後、カバーガラス