走査型電子顕微鏡による膜フリル形成の定量化

外部刺激装置は細胞を活性化し、さまざまな細胞活動に不可欠な三次元円形膜突出、または膜フリル形成を誘導します。

膜のフリル形成を視覚化するには、ベースにカバーガラスを含むマルチウェルプレートから始めます。カバーガラスの上部には培養マクロファージがあります。

これらのマクロファージを細胞を活性化する刺激分子で処理し、細胞骨格の再編成と膜突出の形成を促進します。細胞を固定液で重ね、タンパク質を架橋し、細胞構造を保存します。

完全な脱水のためにアルコール濃度を上げて固定マクロファージを処理します。臨界点乾燥機を使用してこれらのマクロファージを乾燥させ、水の痕跡を除去してイメージングを向上させます。

導電性テープを使用して、カバーガラスを走査型電子顕微鏡(SEM)の試料ホルダーに取り付けます。スパッタは、マクロファージを含むカバーガラスを薄い金属層でコーティングし、イメージング中の良好な電子伝導性を確保します。

カバーガラスをSEMチャンバーに入れます。電子ビームをカバーガラスに集束させます。電子ビームは金属でコーティングされたマクロファージの膜に当たり、膜表面から低エネルギーの二次電子を生成します。

3次元の突起は、膜の他の部分とは異なる方法で電子を散乱させ、細胞表面のこれらの特徴を強調します。検出器は、さまざまな細胞表面領域から散乱した電子を収集し、コントラスト画像を生成します。

SEM画像では、マクロファージが暗く見え、表面に明るい円形の突起があり、フリルの形成が確認されています。

、オートクレーブ鉗子を使用して、滅菌ガラスカバーガラスを24ウェルプレートのウェルに入れます。次に、RAW264.7マクロファージを1ミリリットルあたり10〜⁶細胞の密度でカバーガラスに播種し、プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%の加湿インキュベーターで一晩インキュベートします。

翌日、各ウェルの培地を500マイクロリットルの新鮮な完全培地と交換し、次に、DMSOなどのビヒクルコントロールまたはEIPAなどのマクロピノサイトーシス阻害剤でマクロファージを30分間前処理します。次に、膜のフリルを促進するために、1マイクロモルのPMA溶液または1ミリリットルあたり100ナノグラムのマクロファージコロニー刺激因子などのマクロピノサイトーシス刺激剤で細胞を30分間処理します。

走査型電子顕微鏡用にセルを固定するには、ウェルから培地を吸引し、カバーガラスを氷冷PBSで2回洗浄します。次に、カバーガラスを固定液中で室温で30分間インキュベートし、続いて摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、細胞単層を乱すことなく、穏やかに洗浄し、カバーガラスを500マイクロリットルの0.1モルカコジル酸ナトリウムで15分間インキュベートします。500マイクロリットルの蒸留水で2回洗浄した後、カバーガラスを500マイクロリットルの段階的なエタノールシリーズで2回洗浄し、各洗浄で10分間のインキュベーションを行います。

臨界点乾燥を行うには、カバーガラスを臨界点乾燥機に入れ、100%エタノールで覆い、電源ボタンを押して二酸化炭素タンクを開きます。温度が摂氏30度に下がるまで、クールボタンを約0秒間押します。次に、チャンバーウィンドウに気泡が表示されるまで、充填ボタンを押します。

次に、パージ排気からのエタノールの臭いが消えるまでパージボタンを押します。次に、温度が摂氏0度に下がるまで、冷却ボタンをもう一度押します。[塗りつぶし]ボタンと[パージ]ボタンをもう一度押してオフにします。次に、炭酸ガスタンクを閉じます。冷却ボタンをもう一度押してオフにし、次に加熱ボタンを押します。温度を摂氏 42 度、圧力を 1,200 ポンド/平方インチに設定します。

圧力と温度が安定したら、ブリードボタンを押して圧力をゆっくりと下げます。チャンバーの圧力が 150 ポンド/平方インチに達したら、ベント ボタンを押して、圧力が 0 ポンド/平方インチに低下するまで待ちます。クリティカルポイントドライヤーの電源を切り、カバーガラスを取り外します。

次に、カーボン接着剤タブを使用して、走査型電子顕微鏡用のアルミニウム試料マウントにカバーガラスを取り付けます。次に、スパッタコーターで金またはパラジウムを使用したスパッタコーティングに進む。

スパッタコーターの電源ボタンをONにします。真空度が30ミリトルに達したら、ガススイッチをオフにし、ファインガスバルブを反時計回りに回して、チャンバーを洗い流し、湿気と空気を除去します。真空度が200ミリットールに上昇したら、ガススイッチをオフにし、真空度が30ミリットールに達するまで待ち、次に、図のようにチャンバーを再度洗い流して湿気と空気を取り除きます。チャンバーを3回フラッシングした後、タイマーボタンを押して、ゲージが10ミリアンペアになるまで電圧ノブを調整します。次に、コーティングされたカバーガラスをチャンバーから取り外します。

メンブレンのフリルを視覚化して定量化するには、サンプルのカバーガラスを走査型電子顕微鏡のチャンバーに挿入します。ドアを閉め、Evacボタンを押します。顕微鏡の操作ソフトウェアを開き、加速電圧を15キロボルト、作動距離を10ミリメートルに設定します。座標ボタンを押して、セルが観測画面の中央に表示されるまでコントローラーの周りを移動します。倍率を3500倍に設定し、写真ボタンをクリックしてサンプルを画像化します。