Name: 走査型電子顕微鏡を用いたボリューム情報の標的取得のためのアレイ断層化ワークフロー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学ぶ、アレイ断層化ワークフローによる走査型電子顕微鏡を用いた標的ボリューム情報取得法。超薄切片の自動イメージングで希少構造を効率的に同定し、データ記録時間を短縮して電子顕微鏡データ解析を支援します。

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私たちは、ローザンヌ大学のEM施設のメンバーがAT手順の異なるステップのこの開発の間に彼らのサポートに感謝したいと思います。ガレス・グリフィス、マルタ・ロドリゲス、ウルスカ・レプニク、クリステル・ジェヌード、ヘルムート・グナエギ、アイナット・ゼリンガー、パオラ・モレノ=ローマン、ルーシー・オブライエン、リンジー・ルウェリンに感謝します。私たちは、マティアス・ルトルフ、ミハイル・ニコラエフ、デバンジャリ・ドゥッタ、ティル・マツァット、ファニー・ラングレットなど、さまざまなシナリオを実証するために使用されるサンプルを貢献したグループを認めたいと考えています。

注: サンプルの準備方法については、他の場所で説明しています14、30、31、このドキュメントでは説明しません。要するに、示された例はグルタルアルデヒドで化学的に固定され、1%OsO4で後固定され、次いで、埋め込み樹脂に埋め込む前に1%酢酸ウラン酸水溶液で処理した。あるいは、試料は、高圧凍結を用いて調製することができ、アセトン中の0.1%のウラニル酢酸で置換し、アクリル樹脂に埋め込む凍結を行うことができる。サンプルブロックは、サンプルの明確なビューを可能にする平坦な埋め込み方法を使用して作成し、断面化の向きを容易にします(図1B)。
1. アレイ生成手順
<ol><li>埋め込みサンプルの向きとトリミング<ol>
<li>双眼鏡/顕微鏡を使用して、ブロックの表面をカミソリの刃で軽く傷つけて、埋め込みブロック表面のROIを識別してマークします。これは、超ミクロトーム内のサンプルを向けるのに役立ち、断面面を減少させます。</li>
		<li>サンプルをウルトラミクロトームホルダーにクランプします(図2A)。</li>
		<li>サンプルの周りに樹脂をトリミングし、まずカミソリの刃(粗いトリミング)を使用して、ダイヤモンドトリミングツール(細かいトリミング)を続行します。 図 2A)。ブロックの上面と底面がナイフの刃先に平行になるように、20°または90°エッジ傾斜のナイフを使用してください。 注: この手順は、直列の断面化とストレート リボンの取得に不可欠です。</li>
		<li>3:1の割合でキシレンと接着剤を混ぜます。爪楊枝にまつげが取り付けられた状態で、トリミングされたブロックの上端と下端にこの混合物を適用します。十分に乾燥させてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>アレイ取り付け支持A(すなわち、シリコンウェーハ)を用意する。<ol>
<li>ウエハ切断ツール(EMS)を使用してウエハピースをカットし、プロジェクトの目標に合わせてサイズを調整します。2cm×4cmは光顕微鏡観察と電子顕微鏡観察の両方に便利です。</li>
		<li>残骸を取り除くために蒸留水でウエハーを清掃します。</li>
		<li>グロー放電/プラズマは、標準機器を使用して表面をきれいにします。正確なパラメータは、使用するマシンによって異なります。グリッドの放電のパラメータから始め、経験的に時間を調整します。このステップは、セクションが乾燥している間、サポート上のセクションの良好な広がりのために重要であり、省略すべきではありません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>アレイ取り付けサポートB(ガラスカバースリップ)を用意します。<ol>
<li>多重免疫標識実験を計画する場合は、カバースリップ上のサンプルを転送して蛍光シグナルをより良く検出します。カバースリップの粘着性を改善するために、詳細なゼラチンコーティング手順を使用して、前述の9.</li>
		<li>酸化インジウムスズ(ITO)または蒸着によって金でスライドをコーティングすることにより、導電率を高めます。準備したカバーリップをクリーンな環境に保ちます。グローは、1.2.3 で説明したようにサンプルを排出します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. サンプルの断面化
<ol><li>ATナイフの準備 メモ:アレイを生成するには、長いリボンの取得を容易にするために設計された修正ナイフ(ATS)を使用します。大きいサポートのセクションの生成のために考案されたヒストジャンボナイフまたは類似のナイフは、同様にATの切り離しに役立つことができます。<ol>
<li>泡状の粘着テープを使用してナイフの底に針を取り付け、それを突き刺します(図2B)。ATSナイフをウルトラミクロトームホルダーに0°に置きます。標準的な手順を使用して、ブロックサーフェスに平行なナイフのエッジを調整します。</li>
		<li>切断の準備ができている位置にナイフの端にトリミングされたブロックを持参します。</li>
		<li>ナイフの洗面器の中にウエハ/カバースリップを置き、ナイフの端と同じレベルに水で満たします。ナイフのダイヤモンドの端を適切に加湿させ、必要に応じて付属の注射器を使用して水を引き出します(図2C)。</li>
	</ol></li>
	<li>アレイの断面化と転送<ol>
<li>ミクロトームを目的の切削パラメータに設定します。ATSナイフを使用すると、50-100 nmの範囲と0.6-1 mm/sの切断速度が推奨されます。断面化を開始します (図 2Di)。</li>
		<li>対象となる Z ボリュームをカバーする長さのリボンを取得し、コレクションを停止します。ブロックサイズ、組織の均質性、樹脂の種類に応じて、リボンは比較的まっすぐになります(図2D-ii)。多くのサンプルは、努力とナイフの種類が使用されているにもかかわらず、ストレートリボンを生成しません。</li>
		<li>最終目標に応じて、1つまたは複数の短いリボンを並べて配置します。2 cm x 4 cmのサポートは便利に100から1,000セクションを握ることができる。サポートステップのリボンの配置は、器用さと安定した手を必要とするステップです。しかし、このスキルの学習曲線は急速に獲得されます。</li>
		<li>爪楊枝に接着したまつげの清潔で粘着性のない先端を使用して、ナイフエッジからリボンを取り外します(図2Diii)。</li>
		<li>まつげを使用して、支持媒体の中央の上にリボンを静かに動かします。この時点で、必要に応じてセクションのストレッチにクロロホルムまたは加熱ペンを使用します。ただし、この操作はリボンの破損や変形を引き起こす可能性があることに注意してください。</li>
		<li>注射器を引っ張って水を水に流し始めます。より繊細なリボンや遅い水の引き込みのために、ホースから注射器を取り外すことによって水を滴下させます。水位がウエハーレベルまで下がったら、リボンを中央に静かに押し込んで、必要に応じてリボンをコントロールし、位置を変更します。ウエハ表面にリボンを落とした後、残りの水が流域から完全に引き込まれるまで排水を続けます。 注:底水引きATSナイフを使用しない場合は、気流を誘発しないようにATSナイフの側面から水を慎重に減らしてください。</li>
		<li>完全に乾燥させるためにお風呂の中のサポートのセクションを残します。支持の疎水性と環境湿度レベルに応じて、水は異なる速度で蒸発します(図2Div)。サンプルをゆっくりと乾燥させて減少させるか、サンプルのすべての折り目を完全に避けることは重要です。</li>
		<li>乾燥したサンプルを密閉した箱に移して汚れから保護し、60°Cのオーブンに少なくとも30分間置きます。必要に応じて、全体的なコントラストを高めるために重金属を使用してカウンターステインセクション。</li>
		<li>手順の最後に、メーカーの指示に従って慎重にナイフを清掃する メモ:ウエハ上の複数またはシリアルセクションの転送(図2E)とスロットグリッドでの転送(図2F)は、EM準備の経験を完全に変えます。単一のサポートに関するセクションの中断のないセクションとコレクションは、連続セクションで頻繁にセクションおよびセクションコレクションに関連するミスの量を減らします。1つのウエハに集められた1000 μm x 500 μmの100セクションに相当する部分は、33スロットグリッドに相当します(図2G)。</li>
	</ol></li>
</ol>3. サンプル観察
注: このセクションでは、市販のソフトウェアを使用して実装されたワークフローの手順について説明します(「 資料一覧」を参照)。正しい検出器を搭載したSEM上の画像取得ソフトウェアは使用できますが、特定のユーザーアクションは異なり、多くの場合、より手動になります。
<ol><li>ウェーハ上のセクション位置を明らかにするSEM画像の概観図を取得します。内蔵光学カメラ画像は、セクションまたはすべてのセクションのリボンをカバーするSEM画像モザイクを定義するのに役立ちます。サンプルのカメラ画像上でマウスを右クリックしてモザイクを作成し、 自動取得を開始します。 注:非常に粗いイメージング設定、すなわち、1〜2 μmピクセルサイズと1μsの住み時間で十分です。このプロセスは 補足資料 (2-7 ページ) で示されています。</li>
	<li>セクションファインダー自動検出機能を使用してセクションを見つけるか、手動でそれらを見つけます。セクションの位置とアウトラインは、画像マッチングに基づいて、このソフトウェアで自動的に取得されます。このプロセスの説明については、補足資料(8 ~ 15 ページ) を参照してください。</li>
	<li>概要画像にROIが明確に表示されない場合は、セクションの高解像度画像を取得します。 セクションプレビュー 機能を使用して、画像を自動的に作成および取得します。このプロセスは 補足資料、16-18 ページで示されています。イメージング設定は、ユーザーが検索する ROI の性質とサイズに応じて選択する必要があります。<ol>
<li>最適な設定を見つけるには、顕微鏡制御ソフトウェアで ライブイメージング を有効にし、1つのROIに移動します。画像にROIが明確に表示されるまでイメージング設定を変更しますが、画像の取得が過度に長くなりません。</li>
	</ol></li>
	<li>イメージング領域の定義 注: いくつかの異なる戦略が提案されています。<ol>
<li>数個のセクションのみを画像化する必要がある場合は、これまでに作成したセクションの画像を使用して関連セクションに移動し、取得した画像をすべて元の相対位置に表示する Zoomable Viewer を使用してすべてのセクションを表示します。高解像度で画像を作成する必要があるセクションが見つかったら、クリック アンド ドラッグでイメージング領域を作成します。高解像度のイメージング設定を選択し、テンプレートに設定を保存します。このテンプレートを、以降のセクションで再利用してください。</li>
		<li>特に小規模な事象や検出困難な事象を見つけるには、横スクリーニングアプローチを使用します。10 分の 1 セクションごと、またはリボンごとに 1 つのセクションに高解像度のイメージング設定を使用してイメージング領域を手動で作成し、イメージを取得します。ソフトウェアの ROI を含むイメージとマーク セクションを確認するか、メモを取ります。<ol>
<li>ROI を含むセクションから開始し、セクション セットを前後に移動し、構造がセクションに表示されている限り、同じ相対位置に高解像度イメージング領域を作成します。これは、手動で行うか、次の手順で説明する手順を使用して行うことができます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>連続した10個以上のセクションで画像を取得します。イメージをズームした後、[ 位置絞り込 み開始]をクリックして、マニュアルの説明に従って、登録された断面の位置の精度を上げます。そうすることで、画像系列の位置変動性が低下します。この手順は補足 資料 ページ 19-21 で説明されています。</li>
		<li>任意のセクションをクリックアンドドラッグして 、Alt キーを押しながらイメージング領域を定義し、マウスボタンを離したときに開くコンテキストメニューから [タイルセットアレイを作成 ]を選択します。ソフトウェアは、以前に検出またはマークされたすべてのセクションで、同じ相対位置にイメージング領域を作成します。 断面スパン スライダーを使用して、特定の範囲のセクションにイメージングを制限することができます。 注: この手順は、任意の数のイメージング領域で繰り返すことができるため、各セクションに大きな画像を 1 つ記録する代わりに、多数の小さな高解像度画像を記録できます。</li>
		<li>作成後は、必要に応じて、各画像シリーズにピクセル数、ピクセルサイズ、タイルレイアウト、ピクセルドウェル時間などを設定します。イメージングシリーズが作成され、設定されると、それらはすべてジョブキューにリストされます。</li>
	</ol></li>
	<li>自動機能の設定と画像取得の開始<ol>
<li>前の手順で説明したのと同じ方法を使用して、自動機能用の別のイメージ シリーズを作成します。イメージシリーズを、コントラストの高い構造を含むセクションの位置に移動します。</li>
		<li>イメージシリーズを 1024 x 884 ピクセルに設定し、前の手順で設定したイメージ シリーズで使用した最高解像度に対応するピクセル サイズを選択します。自動機能のリストで、 オートフォーカス と 自動スティグマをチェックしてください。</li>
		<li>取得シーケンス コントロールで [セクション別 ] を選択し、自動関数イメージがリストの最初の項目であることを確認します。ジョブキューの横にある[ 実行 ]ボタンをクリックして、画像の取得を開始します。これらの手順は、 補足資料(22-23 ページ)で説明されています。 注: 各セクションに手動で事前に焦点を当てる必要はありません。記録セッション中、顕微鏡が新しいセクションに進むたびに、自動機能は他のすべての画像がこのセクションに記録される前に実行されます。</li>
	</ol></li>
</ol>4. データのアライメントと分析
<ol><li>データエクスポート<ol>
<li>データが.tif形式で保存されていることを確認して、専用のエクスポート機能を必要としないようにしてください。レイヤーツリー内のレイヤーと要素に直接対応するフォルダー構造にデータを並べ替えます。</li>
		<li>画像モザイクが記録されたら 、StitchAll 関数を使用してすべてのタイルを自動的にステッチします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フィジーでのスタックの配置とトリミング 手記。多くのソフトウェア パッケージ (無料および商用) を使用して、アレイトモグラフィ データを操作できます。オープンソースプログラムFiji32では、広く利用可能で、必要な機能がすべて含まれているため、以下の手順が示されています。<ol>
<li>イメージのスタック (またはステッチされた画像) を、仮想スタックとしてフィジーにインポートします。</li>
		<li>コントラスト/明るさを正規化する必要がある場合は、[拡張コントラスト]を選択します。プロセスメニューから。 [飽和ピクセル]を 0.1 以下に設定し、[すべてのスライスを処理] をオンにします。</li>
		<li>[プラグイン]メニューから、[登録]| SIFT を使用した線形スタックの位置合わせ。</li>
		<li>[変換が期待される]ドロップダウン メニューから [リジッド] または[アフィン] を選択します。それ以外の場合は、既定の設定をそのまま使用します。[OK]をクリックして配置を開始します。 注: データを仮想スタックとして読み込むと、フィジーはあらゆるサイズのスタックを処理できます。アライメントの出力は RAM で作成されます。ただし、これにより、処理できるスタックの最大サイズが制限される場合があります。その場合は、同じ登録アルゴリズムのフォルダー間実装である 仮想スタックスライスの登録を使用します。登録が完了したら、出力データを仮想スタックとしてロードします。</li>
		<li>[ トリミング] をクリックしてイメージ スタックをトリミングし、ROI のみを含めます。</li>
		<li>スタックを単一の.tifイメージまたは一連の.tif画像として保存します。 注: アレイ断層撮影の重要な手順を 図 3に示します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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著者ティルマン・フランケは、本稿で使用されている電子顕微鏡と操縦プログラムを製造するサーモフィッシャーの従業員です。

電子顕微鏡は、細胞や生物の超構造に関する洞察を与え、その3次元的文脈で関心のある構造を画像化することがしばしば望ましい。超構造解析のための多数のEM戦術にもかかわらず、まだ「ゴールドスタンダード」ソリューションはありません。主な理由は、多くの場合、カスタマイズされたアプローチを必要とするサンプル、多くの生物学的な質問の多種多様です。提案されたATワークフローは、サンプル処理、データ収集、評価、およびストレージに必要な時間を最小限に抑えるように設計されています。さらに、修正されたナイフは配列の獲得を容易にする有用な用具を提供する。ウエハ上のセクションのコンパクトなレイアウトは、観察とサンプルの後続の保存の両方に便利です。この配置により、リボンからリボンに水平に移動し、各セクションを1セクションのみスキャンすることでサンプルの「側面スクリーニング」が可能になり、ROIのローカライズに必要な時間を大幅に短縮できます。提案されたデータ取得シナリオは、小規模でランダムに分散されたエリアのターゲット設定を容易にします。AT/SEM は、一度検出されると、手動で実行するか、自動機能の助けを借りて実行するかにかかわらず、目的の量に高解像度のイメージングを正確に制限します。限られた容積のためのATはサンプルを通して移動し、イメージ作成領域を1つずつ定義して、手動で完了することができる。ソフトウェアの自動化モジュールは、大きなセクション上の小さな領域のイメージングのための柔軟な画像取得戦略を提供します。このソフトウェアの自動化により、数百のセクションに大きな高解像度画像を記録し、SBFIと同様のボリュームを達成できます。すべてのセクションの概要画像を記録することで、ROIのローカリゼーションが簡素化され、顕微鏡での時間が短縮されます。概要や高解像度プレビューの記録中にセクションに問題が発生しないため、AT/SEM ではサンプルを再利用して他の ROI のデータを収集したり、より高い解像度で収集したりできます。
画像取得時間は、3D EMの最も重要な(そして最も高価な)側面の1つであり、したがって実験計画で考慮されるべきです。大きな領域のイメージングは小さな領域をイメージングするよりも時間がかかることは驚くべきことではありませんが、影響を過小評価するのは簡単です:選択したイメージングパラメータによっては、各セクションの取得時間は数秒から時間までさまざまです。重要なイメージング パラメータには、視野のサイズ、解像度、および時間の短縮が含まれます。1ピクセル当たり10nmの目標解像度と1μsのドウェル時間を想定して、20μm x 20 μm、100 μm x100 μm、または500 μm x500 μmのフィールドを撮像するには、4秒、100秒、または2,500秒かかります。これらの断面イメージング時間にセクション数を掛けて、完全なイメージングジョブに必要な時間を見積もることができます。セクション数が少ない場合や、顕微鏡ツール時間が問題ない場合は、セクションごとの長いイメージング時間を許容できます。
ただし、ほとんどの場合、記録時間を夜間ジョブまたは週末ジョブに制限する必要があります。考慮すべき3D EMの同様に重要な側面は、結果の画像データの量と構造です。上記のイメージングフィールドを100セクションに記録すると、それぞれ400 mb、10 gb、または250gbの画像データが生成されます。500 μm x 500 μm のイメージは、それぞれ 2 gb を超える追加の問題を引き起こします。データ評価に使用されるソフトウェア プログラムの多くは、このサイズのイメージを開くことができません。
イメージング時間を短縮するには、後続のデータ評価(例えば、再構成、トレース)の信号対雑音比要件を満たすためにピクセルドウェル時間を選択し、記録を定義されたROIに制限することが重要です。ソフトウェアのAT拡張は、シリアルセクションの小さな領域での画像取得を容易にします。ソフトウェアは、手動および自動ワークフローと多くの半自動バリアントをサポートしています:イメージングエリアは手動で配置し、各セクションに焦点を当てることができ、またはユーザーは、自動セクションファインダーと位置合わせ機能を使用することができます。サンプルタイプまたはイメージングの目標で選択されサポートされる自動化のレベルに応じて、数百のセクションで画像取得を設定するのに必要な時間は、作業日全体(手動で行う)または数分しかかかりません。基本的に、アレイ断層撮影は、小さいROISを取得する他の3D EMメソッドよりも困難です。連続したセクションでの不正確な領域配置は、より大きな領域を取得することによって補償されなければなりません。例えば、ROIのサイズが20μm x 20μmで、画像撮影場の断面間位置変動が10μmの場合、各セクションでROIが完全にキャプチャされるように、40μm x 40μmの画像を取得する必要があります。実際の画像位置の変動範囲は、位置調整やユーザーの忍耐に関するソフトウェア機能の可用性または品質に応じて、100 μmから<10 μmまでです。このソフトウェアを使用すると、ほとんどのサンプルで手作業での介入を行うことなく、10 μm を達成できます。
他の手法と同様に、AT にはデータ取得の成功に影響を与えるいくつかの弱点があり、その多くは他の断面ベースの方法と同様です。空の樹脂対組織の均質な分布の欠如は、湾曲または壊れたアレイをもたらすことができます。極端なケースでは、セクションがサポートから切り離される可能性があります(図6A)。切削処理中に可変圧縮またはストレッチを行う場合、後続のセクションで可変領域でサンプルを中断する可能性がある折り目が作成される可能性があります(図 6B)。ナイフマークは、損傷したナイフを使用して、収集したセクションの表面に表示することができます(図6C)。断面条件の違いは、時折セクションの圧縮と厚みの違いを引き起こす可能性があります。ほこりや汚れの粒子は、セクションに着陸し、部分的に関心のあるゾーンをあいまいにすることができます(図6D)。不完全な自動コントラスト、オートフォーカス、および自動スティグマ機能により、画像取得が失敗する可能性があります。自動的に作成されたイメージング領域の位置は可変であり、すべてのセクションでROIをキャプチャできない場合があります。
ステッチとアライメントの段階で、いくつかの問題が発生する可能性があります。モザイク タイルの取得の自動ステッチは、サンプル内の空き領域が大きいため、失敗する可能性があります。3Dの形状が大幅に変化するため、画像スタックの登録は困難な場合があります。特別に開発されたプログラム(例えば、IMOD、フィジー、トラックEM2、MIB、またはMAPS-AT)は、半自動アライメント32、38、39、40を容易にすることができます。より挑戦的なセクションは、手動で写真編集ソフトウェアを使用して整列することができます。残念ながら、データセットによっては正しく位置合わせできない場合があります。
大きなサンプルは、TEMシリアルセクションがグリッドに適合する場合に困難です。一方、多くのプロジェクトでは、FIB/SEM または SBF-SEM を使用した長い自動取得を正当化しません。ATは、ウエハ上のシリアルセクションの収集と操作がスロットグリッドよりも簡単である、退屈なシリアルセクションTEMに代わる簡単な方法です。配列の収集を容易にするためにいくつかの戦略が開発され、既存のツールキットを拡張する方法を共有しています。ROIの同定が困難な場合、AT-SEMは、50〜500セクションにわたるオルガネラスケール分解能が必要なサンプルを効率的にスクリーニングすることで、基本的な利点を提供します。ボリュームが大きい場合は、より多くのセクションが必要な場合に、AT の自動収集戦略を効率的に収集できます。ATサンプルを複数回再画像化できるため、以前に取得した概観画像に基づく高解像度領域のターゲット画像撮影が容易になります。ここで提案するAT/SEMによるターゲット分析とオーバーサンプリングの削減は、労働とデータストレージの要件を減少させると考えています。最終的には、セクションのライブラリを収集し、後で再利用し、相談するために維持することができます。量の取得のために、FIBまたはSBF-SEMアプローチはROIがブロック面上で識別しやすい場合、または分析のために大きな3Dボリュームが必要な場合に優れたソリューションを提供します。ただし、FIB/SBF-SEM は、高解像度のスタック イメージを、定義された ROI からターゲットを絞った方法で収集する必要がある場合、効率が低下します。結論として、ATサンプルのスクリーニングと中解像度の概観画像の使用のための提案された方法は、セクション配列の関連部分に画像取得を制限することを可能にする。イメージング領域の正確な狙いは、データの時間を短縮し、データ評価を簡素化します。
要約すると、AT/SEMの概念は斬新ではありませんが、その使用はまだそのメリットが示唆するほど広く普及していません。全体的に、それは他の既存のEMメソッドに相補的な手順を提供する。AT/SEMは、サンプル調製プロトコルおよびイメージングワークフローの最も広範な範囲と互換性があり、付随する技術として任意のFIB/SEMまたはSBF-SEM顕微鏡で行うことができます。本稿では、他の方法でうまく対処しにくいサンプルからの超構造データを記録するためにATに集中した。セクションの便利なコレクションとかなり自動化された買収戦略の説明された手順は、この方法に遭遇したことがない人のための最初の試みに役立ち、すでに経験のある人のためにそれを完璧にするのに役立つことを願っています。

EM関連の技術の重要性にもかかわらず、それらを習得するために必要な努力は、フィールド全体を少数の専門家に制限し続けます。重要な難点の 1 つは、EM 用に保存されているサンプル内の関心領域 (ROI) の識別と検索です。同じサンプルの外観は、光学顕微鏡で分析する場合とEM観察のための処理後にかなり異なります。化学的に調製されたサンプルの変化には、脱水ステップ後の異方性サンプル収縮(各次元で10%程度)と、固定および染色プロトコルでオスミウムを使用した場合の蛍光の損失が含まれる(図1A)。超薄い断面のために、サンプルは異なる戦略を用いてエポキシ樹脂またはアクリル樹脂に埋め込まれている(図1B)。この準備の成功の結果を得るには、サンプル全体を1 mm x 1 mm を超えない部分に分数する必要があります。標準的な透過電子顕微鏡(TEM)の観測条件の要件を満たすために、サンプルのこの小さな部分はさらに50〜150 nmの厚さのスライスに切り離されます。結果として得られたグレースケール画像は、他の顕微鏡技術よりも詳細にサンプル全体の分分分の組織組織およびオルガネラ構造を示す(図1C)。一般的な TEM データセットは、理論的には細胞や組織の 3D 空間で自然に発生するプロセスを理解するために、2D 情報を提供します。図1Dは、超構造容積の獲得の課題を示しています:側面1,000 μmの立方体が50nm厚で切り離されている場合、体積全体をカバーするために20,000のセクションが必要になります。500 μm側立方体の場合、10,000 個のセクションになります。50 μm x 50 μm x 50 μm のボリュームをカバーするには、1,000 個のセクションのみ必要な場合があります。このボリュームを手動で入手することは事実上不可能であり、自動化を使用して実行することは非常に困難です。サンプル深さに加えて、このような仮説立方体の表面全体をカバーする必要がある場合、合理的な解像度での1μm2表面のカバレッジは、重大なロジスティック問題になります(図1E)。コネクトロミクスのアプローチのような特別な大規模プロジェクトでは、多数のセクションが重要ですが、「平凡な」EMプロジェクトの大半では、観測に必要なセクションを生成することは大きな欠点を提示します。
3D超構造情報を取得する方法は、シリアルセグセクション型透過電子顕微鏡(TEM)、TEM断層撮影、アレイ断層撮影(AT)、シリアルブロック顔イメージング走査電子顕微鏡(SBF-SEM)、および集光イオンビーム走査電子顕微鏡(FIB-SEM)です。これらの方法の主な違いは、断面化戦略と、画像取得が断面生成 1 に結合されるかどうかです。シリアル断面 TEM では、シーケンシャル セクションがスロット グリッド上で収集され、TEM イメージがこれらのシーケンスから生成され、2、3、4、5に整列されます。TEM断層撮影では、グリッド上の150〜300nmのセクションからのチルトシリーズ、およびシリアル断面に結合すると、比較的少量6、7、8の非常に高解像度を提供する。ATアプローチは、ガラスカバースリップ、シリコンウェーハ、特殊テープなど、比較的大きなサポート上のセクションコレクションの多様な手動および半自動の方法で物理的な断面を使用します。画像取得の場合、サポートはSEMで分析され、多様な画像取得戦略が9、10、11、12、13、14、15が利用可能です。SBF-SEMの場合、物理的な断面は、SEMチャンバ内に直接セットされたダイヤモンドナイフを備えたミニミクロトームを用いて、樹脂ブロック16、17、18、19の表面から生成されるSEM画像を用いて行う。FIB-SEMの場合、イオン源はサンプルの薄い層を除去し、続いてSEM20,21による露出面の自動イメージングを行う。TEM断層撮影とATは、必要に応じて再画像化できる物理的なセクションを生成し、FSBF-SEMおよびFIB-SEMはイメージング後にセクションを排除します。マルチビームSEMによって画像化された物理断面の最近の組み合わせは、画像取得22の速度の「ボトルネック」問題を解決する方法の組み合わせを提供する。これらの技術は、EMデータの取得と分析方法に革命をもたらし、それぞれのアプローチは、特定の研究問題に関連する実用的な影響を及ぼします。
準備の性質と超構造寸法のスケールを考えると、サンプルブロック内の特定のターゲット構造がどこにあるかを予測することは簡単ではありません (図1D,E)。ROIローカリゼーションのための1つの解決策は、最初から望ましい解像度でブロック全体からの画像を記録することです。目的の構造は、顕微鏡から離れているときに取得したデータ量にすることができる。この戦略に関連する取得時間とデータ処理は問題です。特に、ROIが組織ブロックよりもはるかに小さい場合、すなわち目的の物体が特定のタイプの細胞(器官全体ではない)である場合、記録されたデータの量を減らすことが望ましい。異なるコリマンコ光および電子顕微鏡法(CLEM)は、同じサンプル23、24、25、26、27、28、29内の調製の前または後に蛍光が保存され、局在化する場合に成功する可能性がある。それにもかかわらず、多くの細胞構造は、公知の超構造のみに基づいて、蛍光相関がなくても認識可能である。このような場合、横スクリーニングアレイ断層撮影はROIローカリゼーションに取り組む取り組みと、超構造情報品質とのバランスのトレードオフを提供すると考えています。この戦略を使用して、ウエハ上のセクションのサブセットは、ROIのサイズと性質に基づいて確立することができる一定の間隔でスクリーニングされます。ROIが見つかると、データ取得はアンカーセクションの前と後に始まる連続した一連のセクションで設定され、関連情報をターゲットにした方法で収集します。
我々は、多数のセクションで関心のある領域やイベントの取得を簡素化し、加速し、より良い整列画像ボリュームを得るATのためのプロトコルを提示します。横型スクリーニングとマルチステップ取得は、正確にターゲット領域で非常に高解像度のデータを生成します。我々が説明する手順は、サンプル調製ワークフローを根本的に変更することなく、幅広い試料との互換性を提供する3D EMデータ取得のいくつかの課題に対処します。セクション作成およびSEM買収の対象ローカリゼーション。セットアップ中の時間と労力の削減。結果のボリュームのより良い位置合わせと複数のセクション内の領域のイメージング;そして、ステッチモザイク画像に異なる画像をコンパイルするためのスムーズなステッチと整列手順。私たちは、公開されたプロジェクトと進行中のプロジェクトからいくつかのサンプルで私たちの方法の強さを実証することを選びました。このアプローチは、EMの経験が限られている研究者であっても、対象となるEMデータの生成と取得を大幅に促進できると考えています。

<table><tbody><tr><td> 切断</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATセクショニングナイフ</td><td>ダイアトメー</td><td>DUATS3530</td><td>ジアトメージャンボナイフ</td></tr><tr><td>トリミング用ダイヤモンドナイフ 90°;</td><td>ダイアトメー</td>ム<td>DTB90</td>ダイ<td>アトームトリミング20&deg; ガラス ナイフ</td></tr><tr><td>Pattex 接触接着剤</td><td>Pattex</td><td>PCL3C</td><td></td></tr><tr><td>シリコン ウェーハ</td><td>Ted Pella</td><td>16015</td><td>抵抗: 1-30 Ω タイプ P: (ホウ素) (1 プライマリ フラット) 粗さ: 2 nm SiO2 トップ コーティングなし TTV: = <20 &micro;m ウェーハは片面が研磨されています</td></tr><tr><td>ウルトラミクロトーム</td><td>ライカUC6</td><td></td><td>代替品:ライカUC7</td></tr><tr><td>ウェーハ劈開キット</td><td>EMS</td><td>7642</td><td>EMF、スモールサンプルクリーバー、CatNo.7652</td></tr><tr><td><>画像取得</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FESEM</td><td>Thermo Fischer Helios</td><td>1072419</td><td>代替品:ツァイス、日本電子、日立製作所、TESCAN</td></tr><tr><td>相関ワークフローを備えたSEMのマップ3 &アレイトモグラフィー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1135932</td><td>マップは、SEMイメージングワークフローの自動化を提供し、CLEMおよびナビゲーションのための第三者データのインポートを可能にします。</td></tr><tr><td>Image analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amira x.y</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1131599</td><td>Amiraは、アレイトモグラフィーデータ再構成のためのいくつかの実用的な機能を備えた3Dデータ視覚化および分析ソフトウェアです。</td></tr><tr><td>画像処理</td><td>オープンソース</td><td>フィジー (http://fiji.sc/#download)</td><td>IMOD, MIB (参照はテキストを参照)</td></tr></tbody></table>

走査型電子顕微鏡を用いたボリューム情報の標的取得のためのアレイ断層化ワークフロー

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

電子顕微鏡は、ナノメートルの解像度で細胞および構造の詳細を画像化するための生物学と医学に適用されます。従来、透過型電子顕微鏡(TEM)は、細胞の超構造に関する洞察を提供しましたが、最近の10年間で、現代の走査型電子顕微鏡(SEM)の開発は、細胞内部の探し方を変えました。タンパク質レベルの構造の詳細が必要な場合でも、細胞生物学に関する質問の大半に対しては、SEM解像度で十分です。技術の進歩により、シリアルブロックフェイスイメージング(SBF-SEM)やフォーカスイオンビームSEM(FIB-SEM)などの自動ボリューム取得ソリューションが実現しました。それにもかかわらず、これらの方法は、関心のある分野への識別とナビゲーションが重要である場合、非効率的なままです。イメージングの前にターゲット領域を正確にローカライズする手段がなければ、オペレータは必要以上のデータを取得する必要があります(SBF-SEMで)、さらに悪いことに、多くのグリッドを準備してすべて(TEMで)イメージする必要があります。関心領域の局在化を促進するSEMのアレイ断層撮影による「横スクリーニング」の戦略を提案し、その後、サンプル総量の関連分量を自動画像化する。アレイ断層撮影サンプルはイメージング中に保存され、繰り返しイメージングできるセクションライブラリに配置できます。横型スクリーニングにより、他の方法でアクセスするのが非常に困難な構造の詳細を分析できる例をいくつか示しています。

配列断層撮影サンプルとして使用するための大きな転写サポートに関するシリアルセクションのリボンの作成と、走査型電子顕微鏡での自動イメージング手順について説明します。このプロトコルにより、局所的なまれな事象のスクリーニング、検索、および標的画像処理、および大量のデータ量の取得が可能になります。

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

電子顕微鏡分析は、しばしば複雑です。当社のプロトコルは、大きなサンプル表面と中間体積からのEMデータの処理と取得を容易にすると考えています。当社のプロトコルは、シリアルセクション内のターゲット構造を見つけるのに役立ちます。データの記録は必要な情報に限られます。組織全体のブロックでのデータ取得と比較して、記録時間が短縮され、データ分析が容易になります。このアプローチの全体的な容易さを考えると、科学的な問題だけでなく、診断ツールとしても対応できると考えています。分析用の配列を生成するには、まずサンプルをウルトラミクロトームホルダーにクランプし、カミソリの刃を使用してサンプルの周りの樹脂を大まかにトリミングします。ダイヤモンドトリミングツールを使用してサンプルを微調整し、20度または90度の傾斜のトリミングナイフを使用して、ブロックの上面と下面がナイフの最先端と平行であることを確認します。3:1の割合でキシレンと接着剤を混ぜ、爪楊枝に取り付けられたまつげを使用して、トリミングされたブロックの上端と下端に混合物を適用します。混合物が乾燥している間、ウエハ切断ツールを使用して、分析に適したサイズにウエハを切断する。蒸留水でウエハを洗浄し、残骸を洗い流し、ウエハが乾燥した後にプラズマで表面をきれいにします。アレイ断層撮影ナイフを準備するには、泡状の粘着テープを使用してヒストジャンボナイフの底に針を取り付け、ナイフを超ミクロトームホルダーにゼロ度で入れます。ブロック面に平行なナイフの端を調整し、切断の準備ができている位置にナイフの端にトリミングされたブロックを持って来ます。ナイフの洗面器にきれいなウエハを入れ、ナイフの端と同じレベルに水で洗面器を満たし、必要に応じて水を追加または引き出すために付属の注射器を使用して、ナイフのダイヤモンドエッジを適切に湿らせます。配列断面化の場合は、マイクロトームを50~100ナノメートルの切断範囲と、毎秒6~1ミリメートルの切断速度に設定し、断面を開始して、ターゲットとなるZ体積をカバーするのに十分な長さのリボンを得ます。ブロックサイズ、組織の均質性、樹脂の種類に応じて、リボンはほぼまっすぐになります。まつげの清潔で粘着性のない先端を使用して、リボンをナイフの端から取り外します。まつげを使用して、リボンをサポートメディアの中央にゆっくりと移動します。クロロホルムや加熱ペンは、必要に応じてセクションを伸ばすために使用することができます。伸縮後、注射器を引き込み、水の水を排出し始めます。より繊細なリボン、または遅い水の引き込みのために、水が滴り落ちるようにホースから注射器を取り外します。水位がウエハーレベルに達したら、リボンを流域の中央に静かに押し込み、残りの水がすべて流域から完全に取り除かれるまで排水を続けます。ウエハーを清潔な環境で乾燥させます。乾燥時間は約30分です。サンプルが完全に乾燥したら、アレイを密閉した箱に移して汚れから保護します。そして、少なくとも30分間、60度摂氏オーブンに箱を置きます。ウエハ上のセクション位置を明らかにするSEM画像の概観図を取得するには、内蔵の光学カメラを使用して、セクションのリボンを覆うSEM画像を取得します。モザイクを作成するには、サンプルのカメラ画像をクリックしてドラッグし、自動取得を開始します。ターゲット構造を見つけるために、高解像度で概要を取得します。数個のセクションだけを画像化する必要がある場合は、ズーム可能なビューアを使用して、取得した画像を元の場所に表示します。高解像度で画像化する必要のあるセクションを特定したら、クリックしてドラッグしてイメージング領域を作成し、[高解像度イメージング設定] を選択し、テンプレートに設定を保存する 特に小さいイベントや検出しにくい珍しいイベントを見つけるには、10 番目のセクションまたはリボンごとに 1 つのセクションの高解像度イメージング設定を使用して、イメージング領域を手動で作成し、画像を取得します。次に、対象地域を含む画像とマーク セクションを確認します。10 以上の連続したセクションを取得するには、セクションファインダーを使用してすべてのセクションを自動的に検索します。概要画像が対象の明確な領域を表示しない場合は、セクションの高解像度の画像を取得し、セクションプレビュー機能を使用して画像を自動的に作成および取得します。最適なイメージング設定を決定するには、顕微鏡制御ソフトウェアでライブイメージングをアクティブにし、対象の1つの領域にナビゲートし、画像が明確な対象領域を示すまでイメージング設定を調整しますが、メーカーのガイドラインに従って、過度に長い画像取得はありません。連続したセクションでのイメージング領域の位置を最適化するには、目的の画像にズームし、[位置の絞り込みを開始]をクリックして、登録された断面の位置の精度を高めます。イメージング領域を定義するには、Alt キーを押しながら任意のセクションをクリックしてドラッグし、ポップアップメニューから「タイルセット配列を作成」を選択します。ソフトウェアは、見つかったか以前にマークされたすべてのセクションで、同じ相対位置にイメージング領域を作成します。次に、必要に応じて、各画像系列にピクセル数、ピクセルサイズ、タイルレイアウト、およびピクセルのドウェル時間を設定します。自動機能を設定するには、図のように自動機能用の別のイメージ シリーズを作成し、イメージ シリーズをハイ コントラスト構造を含むセクションの位置に移動します。イメージシリーズを 1024 x 884 ピクセルに設定し、画像シリーズで使用される最高解像度に対応するピクセルサイズを選択します。自動機能のリストで、オートフォーカスと自動スティグマをチェックします。取得シーケンスコントロールの[Bisection]を選択し、自動機能の画像がリストの最初の項目であることを確認し、[すべて取得]をクリックして画像取得を開始します。すべてのイメージング シリーズが作成され、セットアップされると、そのシリーズはジョブ キューに表示されます。低解像度の取得は、単一またはモザイクイメージングを使用して、セクションの選択した部分またはセクション全体に手動または自動で直接実行することができ、その後ステッチングが行われます。選択した領域からの画像は、高解像度のパラメータを使用してミトコンドリア、核、およびマイクロビリを視覚化して取得することができます。たとえば、解決されたモザイク マップの自動取得が選択された後、対象となる領域を切り取ったり、領域内の追加の局所イメージング領域を定義するために使用したりできます。ショウジョウバエ腸内の異なる特殊な細胞タイプはランダムに分布しているが、単一のセクションまたは連続画像のコレクションとして、高解像度パラメータを使用して画像をスクリーニングした後に視覚的に区別することができる。アライメントの後、スタックはさまざまなソフトウェア ソリューションを使用してレンダリングできます。アレイ断層撮影解析では、単一のウェハ上に多数のシーケンシャルセクションを生成し、低解像度パラメータを使用してスクリーニングして、一般的な対象領域を局所化することができます。これらの領域は、高度な取得パラメータを使用して、さらなる解析の対象にすることができます。例えば、細胞は棄権帯に比べて比較的大きいため、記体の菌体分裂は超構造レベルで局所化することは容易ではない。ただし、この方法を使用すると、20 ~40 セクションの飛躍の自動中解像度の概要画像を使用して、分割セルをローカライズできます。アレイ断層法は、より簡単な電子顕微鏡データ解析を提供します。私たちは、再生を習得し、地図関連のワークフローに慣れるに投資する視聴者を奨励する私たちの経験では、いくつかの研究トピックは、動物全体または臓器全体の超構造分析を必要としません。我々の方法は、細胞とそれらの相互作用パートナーの組織における迅速な局在化に役立ちます。

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JoVE Journal

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走査型電子顕微鏡を用いたボリューム情報の標的取得のためのアレイ断層化ワークフロー

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