ヒト末梢血からのB細胞の単離と精製

B細胞の免疫磁気陰性分離を行うには、血液凝固を防ぐために抗凝固剤を含むチューブにヒト末梢血を採取します。赤血球、赤血球、溶解バッファーを添加して、他の血球に影響を与えることなく赤血球を溶解します。

心分離して、上清に残っている密度の低い溶解赤血球から無傷で密度の高い血球を沈殿させます。上清を捨てます。ペレットを新鮮な培地に再懸濁します。

細胞を培養プレートに移します。インキュベートして、マクロファージと単球がプレートに付着し、B細胞を含む非接着細胞が懸濁液のままになります。

濁液中の細胞を新しいチューブに集めます。遠心分離して細胞をペレット化し、緩衝液に再懸濁します。

B細胞以外の血球に特異的なビオチン化抗体を含むカクテル溶液を加えます。抗体は非B細胞の表面の抗原に結合し、B細胞は標識されません。

遠心機。結合していない抗体を含む上清を廃棄します。

ストレプトアビジン結合磁気ビーズの溶液を加えます。インキュベーション中、マイクロビーズ上のストレプトアビジンは、非B細胞に結合したビオチン化抗体にしっかりと結合し、複合体を形成します。

チューブを磁場に置き、磁気ビーズに結合した非B細胞をチューブ壁に接着させ、B細胞を懸濁状態のままにします。純粋なB細胞を含む上清をチューブに移します。

B細胞を遠心分離し、培地に再懸濁し、さらなる下流分析を行います。

肘静脈正中からカリウムを添加したEDTAを含む15ミリリットルのチューブに10ミリリットルの血液サンプルを採取した直後に、血栓形成を防ぐためにチューブを数回反転させます。次に、35ミリリットルのオートクレーブ赤血球溶解バッファーを細胞に加え、室温で5分間インキュベートします。

チューブを通して光が観察できたら、血液を遠心分離し、白いペレットの存在を確認します。残留溶解バッファーを10ミリリットルのオートクレーブでPBSに除去し、ペレットを10ミリリットルのRPMI 1640培地に再懸濁します。

細胞を10センチメートルの培養皿にプレートし、摂氏37度、二酸化炭素5%で30分間インキュベートします。次に、培養皿を数回静かに回転させ、浮遊細胞をプラスチック製の15ミリリットルの円錐形チューブに移します。

遠心分離による2回の洗浄後、ペレットを200マイクロリットルの冷たいPBSバッファーに5〜10 x 10 6細胞/ミリリットル濃度で再懸濁し、1 x 10⁶細胞あたり血球に特異的な5マイクロリットルのビオチン化抗ヒト抗体カクテルを加えます。

氷上で30分間インキュベートした後、10倍の過剰容量の滅菌PBSで細胞を洗浄し、ペレットを1 x 10⁶細胞あたり5マイクロリットルのストレプトアビジン結合マイクロビーズに再懸濁し、氷上で30分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、2ミリリットルのPBSバッファーを細胞に加え、チューブを磁気スタンドの上に室温で8分間置きます。

マイクロビーズがチューブの壁に付着したら、上清を新しい円錐形のチューブに慎重に移し、さらに2ミリリットルのPBSバッファーを細胞に加えます。2回目の上清採取後、遠心分離によってプールされた細胞を収集し、細胞を1ミリリットルあたり1 x 10⁷細胞濃度の新鮮なPBSバッファー中の5ミリリットルポリスチレンチューブに移します。