浮力活性化細胞ソーティングを用いた浮選ベースのT細胞単離

浮力活性化細胞選別(BACS)を使用して、免疫系に不可欠な白血球であるT細胞を単離するには、末梢血単核球(PBMCs)の懸濁液を採取します。PBMCには、標的T細胞と、B細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞などの非標的細胞が含まれています。

適切な量のビオチン化抗CD3抗体を含むバッファーを加え、必要な時間インキュベートします。抗体は、T細胞の特徴である細胞表面の多量体タンパク質複合体であるCD3複合体に結合します。

機能化マイクロバブル(ストレプトアビジンでコーティングされた小さな球状粒子)を加えて、抗体結合T細胞をポジティブセレクトします。各マイクロバブルのコアは中空の球体であり、水溶液中に浮遊できる低密度粒子になります。

混合物を攪拌下でインキュベートし、マイクロバブルとサンプルを完全に混合させます。インキュベーション中、マイクロバブル上のストレプトアビジンはT細胞結合抗体上のビオチンに結合し、マイクロバブル上の細胞を固定します。

チューブを遠心分離します。非標的細胞は、底部でペレットとして混合物から分離します。

標的のT細胞に結合したマイクロバブルは表面に浮いたままであり、浮力ベースのT細胞の分離につながります。この分離技術により、標的細胞へのストレスが制限されます。薄いピペットを使用して、マイクロバブル層を乱すことなくペレットとサブネントを除去します。

離されたマイクロバブル結合T細胞を適切な培地に再懸濁して、さらに処理します。

まず、市販のPBMCを2.5ミリリットルの分離バッファーで3 x 10⁸個をビオチン化抗CD3抗体とともにインキュベートします。ピペッティングで成分を穏やかに混合し、室温で10分間インキュベートします。

製造元の指示に従って、ストレプトアビジンマイクロバブルを0.5対1の比率で細胞に加え、市販のエンドオーバーエンドローテーターを使用して20 RPMで室温で10〜15分間混合します。室温で400 x g で5分間遠心分離します。

遠心分離後、ポジティブに選択された細胞はストレプトアビジンマイクロバブルを含む懸濁液の上部にあり、残りの選択されていない細胞はチューブの底にある細胞ペレットに存在します。

9インチのガラスピペットを使用して、気泡細胞層の下のチップをチューブの底に挿入します。細胞ペレットと下清液を電動ピペットで吸引し、新しいチューブに移します。

元のチューブに残った気泡細胞層を1ミリリットルの完全T細胞培地に再懸濁します。サブエントを室温で400×gで5分間遠心分離し、純度と回収率の間接測定に使用します。