好中球とバイオフィルムの相互作用を研究するためのIn vitroアッセイ

バイオフィルムは、微生物由来の細胞外高分子物質 EPS のマトリックス内に埋め込まれた表面付着細菌の群集です。

免疫細胞とバイオフィルムの相互作用をin vitroで研究するには、日和見病原体である黄色ブドウ球菌のバイオフィルムを含むチャネルでスライドを撮影します。操作された細菌は、顕微鏡で検出するための蛍光タンパク質を発現します。このチャネルは、細菌に栄養素を供給するために培地で満たされたリザーバー

に接続します。

蛍光細胞追跡色素で標識された好中球の懸濁液を加えます。培地には、死んだ細胞のDNAを染色するエチジウムホモ二量体も含まれています。生理学的条件下でインキュベートします。

好中球のパターン認識受容体は、細菌の病原体関連分子パターンに結合します。この結合により、好中球が細菌を食作用し、細胞外活性酸素種(ROS)を生成して細菌を死滅させます。

免疫応答を回避するために、細菌は解毒酵素を放出し、細胞死を引き起こすROSとロイコシジン毒素を減少させます。モノマーロイコシジンは好中球上の特定の受容体に結合し、多量体化を経て細孔を形成し、膜の完全性を破壊して細胞を殺します。

エチジウムホモ二量体は損傷した細胞膜を通って入り、死んだ細胞を染色します。

広視野蛍光顕微鏡下では、細菌細胞と好中球のサブセットが死んでいるように見え、好中球とバイオフィルムの相互作用を示しています。

GFPを発現するUSA300などの黄色ブドウ球菌の蛍光株を使用して、顕微鏡イメージングを容易にします。好中球を100マイクロモルBCDとともに摂氏37度のロッカーで5%大気中の二酸化炭素で30分間インキュベートします。サンプルを暗所でインキュベートし、光への露出を制限してください。

過剰なBCDを洗浄するには、好中球を270RCFで5分間遠心分離し、上清を吸引します。好中球を新鮮なHBSSに再懸濁します。次に、BCD染色した好中球に最終濃度4マイクロモルのエチジウムホモ二量体-1を添加して、好中球と細菌の死を監視します。

バイオフィルムをHBSSで洗浄し、マイクロスライドで増殖した黄色ブドウ球菌バイオフィルムに150マイクロリットルの好中球を追加します。マイクロスライドを加湿チャンバー内で30分間インキュベートします。細菌細胞の数は、18 時間のバイオフィルムプレーティングから得られた細胞数に基づいています。

蛍光

色素またはタンパク質の励起波長と発光波長に対応する蛍光チャネルを使用して、好中球バイオフィルムの相互作用を画像化します。