同一宿主種由来の一次抗体を用いたマルチプレックス免疫染色法

皮質と髄質からなる固定および透過性副腎セクションを取ります。沸騰した酸性緩衝液で処理し、抗原のマスキング解除のために固定誘導架橋を切断します。

非特異的結合部位をブロックし、皮質特異的マーカーに結合する一次抗体を導入します。

一次抗体を標的とするビオチン化二次抗体と、ビオチンに結合するストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼを追加します。

蛍光色素タグ付きチラミドと過酸化水素を導入します。

固定化されたペルオキシダーゼは、過酸化水素を利用してチラミドを活性化し、チラミドは近くのタンパク質に結合し、皮質を標識します。

次に、切片を沸騰バッファーで処理して、結合した抗体を剥離します。

髄質特異的マーカーを標的とする同じ宿主種が生成する一次抗体とビオチン化二次抗体を導入します。

ストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼと別の蛍光色素結合チラミドを導入して、髄質を標識します。

皮質特異的一次抗体を剥離すると、再導入された二次抗体がそれらに結合するのが阻害され、交差反応性が防止されます。

核染色を塗布し、イメージングを実行して、はっきりと染色された皮質と髄質を視覚化し、抗体の交差反応性がないことを確認します。

染色する前に、ホルマリン固定パラフィン包埋スライドを脱ワックスし、再水和し、指示に従って各溶液に5分間浸漬します。2回目の蒸留水浸漬後、スライドを蓋付きのピペットチップボックスの底にある275ミリリットルの沸騰したクエン酸ナトリウム溶液に入れ、ボックスを70%の電力で700ワットの電子レンジに8分間入れます。

処理の最後に、蓋を開けて溶液を室温まで冷ましてから、コプリンジャーで新鮮なPBSTを5分間3回洗浄してスライドを洗浄します。非特異的結合部位をブロックするには、最後の洗浄後に、各スライドから余分なPBSTを振とうし、十分な量の適切なブロッキング溶液でスライドを覆います。

湿チャンバー内で室温で30分間後、各スライドから余分なブロッキング溶液を振とうし、250マイクロリットルの目的の第1一次抗体を各サンプルに加えます。サンプルの乾燥を防ぐために、スライドをパラフィンフィルムで覆うことができます。

湿チャンバー内で摂氏4度で一晩インキュベートした後、スライドを新鮮なPBSTで3回洗浄1回5分間洗浄します。余分なPBSTを振り落とし、各スライドを250マイクロリットルの適切な二次抗体溶液ですばやく覆い、室温で加湿チャンバーで1時間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、示されているようにスライドを新鮮なPBSTで3回洗浄し、各スライドに250マイクロリットルの新しく調製したストレプトアビジン西洋わさびペルオキシダーゼを加えます。室温で30分後、スライドを新鮮なPBSTで3回洗浄し、次に余分なPBSTを振り落とし、各スライドを250マイクロリットルの新しく調製した蛍光色素チラミド溶液で覆います。

1分後、スライドを新しいPBSTに沈め、続いて新しいPBSTで2分間3回洗浄します。最後の洗浄後、PBS溶液に1対1のグリセロールを数滴切片に塗布し、蛍光顕微鏡で蛍光シグナルの存在を確認します。

最初の抗体複合体を剥離するには、示されているように、抗体標識スライドを275ミリリットルの沸騰したクエン酸ナトリウム溶液に少なくとも8分間置きます。処理の最後に、蓋を開けて溶液を室温まで冷ましてから、スライドをPBSTで3回洗浄1回5分間洗浄します。

目的の2番目の標的タンパク質を染色するには、非特異的結合のブロッキングが実証された後、各サンプルを250マイクロリットルの目的の2番目の一次抗体で摂氏4度で一晩標識します。翌朝、スライドを洗浄ごとに新鮮なPBSTで5分間3回洗浄し、各スライドを250マイクロリットルの適切な二次抗体溶液で覆い、室温で1時間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、示されているようにスライドを新鮮なPBSTで3回洗浄し、各スライドに250マイクロリットルの新しく調製したストレプトアビジン西洋わさびペルオキシダーゼを加えます。3回のPBST洗浄後に目的の2番目の標的タンパク質のシグナルを開発するには、異なる蛍光スペクトルの蛍光色素結合チラミドでスライドを処理します。

チラミドシグナルの発生を止めるには、スライドをPBSTに沈め、サンプルを適切な核色素で染色します。