Name: 大人の海馬神経新生を研究するために、同じホスト種由来の抗体による免疫組織化学および複数のラベル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶ 同じ宿主種由来の抗体を用いた順次免疫蛍光法で、マウス海馬における成体神経新生の全段階を同一切片で検出・定量化する手法。この方法は抗体交差反応を回避し、神経前駆細胞の研究精度を向上させます。

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著者は、優れた技術支援を提供してくれたS.タウシュに感謝します。本研究は、BMBF(Bernstein Focus 01GQ0923)とDFG(FOR1738)の支援を受けました。

注：生きている動物に関わるすべての手順は、実験動物の管理と使用に関するEC指令609分の86 / EECガイドラインに従って行われ、地元の倫理委員会（テューリンゲンのLandesamtエリーゼLebensmittelsicherheitウントVerbraucherschutz）によって承認された。 チミジン類似体の1。腹腔内注射<ol><li>動物に注射前日に秤量する。 10 mg / mlのストック溶液の次の日に計画されたすべての注射に必要なチミジンアナログの量だけでなく、個々の重量調整後の注入量を計算します。 </li><li> 10 mg / mlのチミジンストック溶液を準備します。 （ 注意！チミジン類似体は有毒である。供給業者によって提供される特定化学物質等安全データシート（MSDS）に従う、 すなわち、化学ヒュームフードを使用し、白衣と手袋を着用）。 <ol><li>およそ、冷凍庫からチミジンアナログを取り、RTにそれを持って来る。 21℃。 10 mgの秤量を追加または0.04 NのNaOH（BrdUおよびCldU用）滅菌生理食塩水（滅菌生理食塩水で、IDUのために）、渦。 50℃の水浴ボルテックスで15分毎に2 - - 粉末を溶解するために3分の少なくとも10のために置く。 注：-20℃で、室温で、数週間貯蔵最大24時間のために使用するソリューション。光（アルミホイルでカバー）からソリューションを保護します。常に沈殿物をチェックし、必要に応じて再溶解する。 </li></ol></li><li>首筋によってマウスを拘束し、腹腔内に30 G針で細かい用量シリンジを使用して（室温で）原液の適切な、重量調整済みのボリュームを注入する。 注：場合CldUとIDUは、同じ動物内逐次的に投与されなければならない等モル濃度を注入するために検討して（ 例えば、50mg / kgのBrdUのに対応して42.5 mg / kgをCldUと57.5 mg / kgをIDU、）。したがって、それに応じて10mg / mlのストック溶液の注入量を調整する。 </li></ol> 2.組織の準備<ol><li> Prepa灌流前日に0.1 Mリン酸緩衝液（pH7.4）中の4％ホルムアルデヒドに再。 4℃で保存。 </li><li>経心40ミリリットルの氷冷ホルムアルデヒド（流速5ml /分）、次いで10 mlの氷冷PBSで左心室を介して深く麻酔したマウス（3.5％イソフルラン）を灌流する。 4℃で24時間、同じ固定液で脳とポストフィックスを解剖。 </li><li>連続して10％（4℃で24時間）、30％スクロース（脳シンクまでは、約48時間）に脳を転送します。気泡が組織から出なくなるまで凍結のために、ゆっくりと-25℃のイソペンタン中に凍結保護の脳を沈める。 -80℃で保管してください。 </li><li>凍結ミクロトーム上で40μmの厚さの冠状切片カット（-25でブロック温度を-16℃）。 24ウェル細胞培養プレートのウェルを含む不凍液に順次転送部（ 図1参照）。 -20℃で保管してください。 </li></ol><img aLT =「図1」SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52551 / 52551fig1.jpg&quot; /&gt; 図1. 24ウェルプレートにミクロトームスライスを転送する模式図。A6は、次の行Bに行くなどした後、A1から始まり、A列に後続のスライスを配置します。 D6に達すると、A1に戻って継続する。切片のこの配置は、脳全体のセクション全ての n 番目の定量を可能にする。新生児の細胞の定量化のために（1列の内容に相当）脳切片番目ごとに6を取る、免疫表現型検査のために（1列の2の交互の行の内容に相当）ごとに12 番目のセクションを取る。 3.免疫染色注：セクションは、通常、キャリアプレートとメッシュインサートを装備した6ウェルプレート中で、自由に浮動して処理される。例外として、抗体インキュベーションおよびABC反応メッシュインサート（ワット当たり0.5〜1ミリリットルことなく、12または24ウェルプレートで行われるブロッキングエル）が染色されなければならないスライスの数に応じて、十分である。これらのステップの間に、細いブラシの助けを借りて、転送部は、（それぞれの新しいソリューションでリンス）。すべてのインキュベーションは、連続的に攪拌（最大150回転）で行われます。 <ol><li> 免疫組織化学（ABC法） <ol><li> TBSへの不凍液から転送部と完全に不凍剤を除去するために（一度O / N 4℃で、10分間RTで5回ずつ）徹底的にすすぐ。 </li><li>内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチするTBS-T中の1.5％H 2 O 2で30分間インキュベートする。必要に応じてバブリングし、再水没セクションに注意してください。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。 </li><li> オプション：一方37℃に加熱キャビネットと2NのHClを予熱。 DNAを変性させ、2N HCl中で37℃で30分間、切片をインキュベートする。ブラシの助けを借りて、静かに別々のセクション。 </li><li> オプション：0.1 Mホウ酸緩衝液中で10分間のセクションを中和する8.5、RT。転送中に、簡単に塩酸残り物を削除するにはペーパータオルの上のセクションを含むメッシュインサートを綿棒。 15分ごとにTBSで2回洗浄します。 </li><li>組織を透過し、非特異的抗体結合部位を、室温で1時間ブロックするTBSplusでインキュベートする。 </li><li> 4℃でTBSplusで希釈した一次抗体、O / Nでインキュベートする。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。 </li><li> TBSplus、室温で3時間で希釈したビオチン化二次抗体でインキュベートする。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。一方で... </li><li>製造業者のプロトコル（TBS-T中1％A + 1％B）に従って、ABC複合体を準備する。使用前にRTで30分間放置する。室温で1時間のAB試薬中のセクションをインキュベートする。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。 </li><li>それぞれ、二等分し、ピペット4ミリリットルまたは2ミリリットルウェル当たりに分け、6員または12ウェルプレート当たりTBS-Tで50ミリリットル0.5 mg / mlのDABを準備します。 DAB溶液中にセクションを転送（ 注意！DABは有毒である。納入仕様に従ってくださいC すなわち、白衣と手袋を着用し、サプライヤーが提供するMSDSは、）、化学ヒュームフードを使用しています。 </li><li>ペルオキシダーゼ反応を開始するために、各ウェルに、上記のように、残りの25ミリリットルDAB溶液に、0.5ミリリットルの1％H 2 O 2を添加し、混合し、ピペット等量。 12分間インキュベートする。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。 </li><li>ゼラチン中のスライドにマウントセクション、空気乾燥O / N。永久封入剤とカバーガラス。 </li><li> オプション：カバースリップを配置する前対比（3.5節を参照）。 注：信号対雑音比が高いため、バックグラウンドの低い場合には、AB試薬（ステップ3.1.8）とのインキュベーション後にH 2 O 2処理を繰り返す。 </li></ol></li><li> 複数免疫蛍光 <ol><li> 単一または複数の同時免疫蛍光 <ol><li> TBSへの不凍液から転送部と完全に削除するには（一度O / N 4℃で、10分間RTで5回ずつ）よくすすぐtifreeze。 </li><li> オプション：ステップ3.1.3のように- 3.1.4。 </li><li>組織を透過し、非特異的抗体結合部位をブロックし、室温で1時間するTBSplusでインキュベートする。 </li><li> TBSplus、Oで/ N 4℃で希釈した一次抗体カクテル（ 例えば、ラットα-BrdUを、α-DCXモルモット、ヤギα-GFP）でインキュベートする。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。 </li><li>蛍光色素結合二次抗体のカクテルでインキュベート（ 例えば、ローダミンレッドα-ラット、アレクサ-647α-モルモット、アレクサ-488α-ヤギ、ロバに派生したすべての）TBSplusに希釈した、RTまたはO / Nで3時間4℃で。今から上の光からセクションを保護。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。 </li><li>ゼラチン中のスライドにマウントセクション、空気乾燥O / N。水性マウント培地でカバースリップ。 </li></ol></li><li> 同じ宿主種からの一次抗体を用いたシーケンシャル複数の免疫蛍光 <ol><li> 3.2.1.3 - 3.2.1.1ステップとして。 </li><li> FIのインキュベート第一次抗体（ 例えば、ウサギα-抗原A）、O / Nで4℃で。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。 </li><li>第一の蛍光色素結合二次抗体（ 例えば、ローダミンレッド-CONJ。ロバのα-ウサギ）、3時間RTにインキュベートする。今から上の光からセクションを保護。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。 </li><li>最初の二次抗体にオープンパラトープを飽和させるために3時間RTのための一次抗体と同じホスト（ 例えば、ウサギ血清）から10％正常血清中でインキュベートします。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。 </li><li>でO / N、第二の二次抗体により認識され得るエピトープをカバーするために、一次抗体（ 例えば、αウサギIgG（H + L））のホストに向けられた、50μg/ mlの非抱合型の一価FabフラグメントとTBSplusでインキュベート4°C。 </li><li> TBS中で少なくとも3回洗浄し、一回TBS-Tで10分間ずつた。転送中に、簡単にSWAどんなのFab残り物を削除するにはペーパータオルの上のセクションを含むメッシュインサートB。 </li><li>二次抗体（ 例えば、ウサギα-抗原B）において、O / Nで4℃でインキュベートする。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。 </li><li>第二の蛍光色素結合二次抗体（ 例えば、アレクサ-488-CONJ。ロバのα-ウサギ）、3時間RTにインキュベートする。 、15分ごとにTBSで3回すすぎマウントし、上記のようにカバースリップ。 注：別のホスト種からの抗体と抗原をラベルには、3.2.2.2のステップにそれらを追加し、それぞれの二次抗体は、3.2.2.3に移行する。 </li></ol></li><li> 一次抗体のいずれかと同じ種に由来する二次抗体の一つ 注：このプロトコルは、GFAP、ネスチンGFPとDCXと一緒にBrdUまたはKi67のに対して四重染色に適しています。 <ol><li> 3.2.1.5 - 厳密にプロトコルは3.2.1.1を手順に従ってください。この時点まではTBSplusで唯一のロバ血清を使用しています。 </li><li> T中でインキュベートRTで1時間3％ヤギ血清を含むBSplus。これは、α-ヤギ二次抗体上のオープンパラトープをカバーしています。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。 </li><li> AMCA-CONJでインキュベートする。 TBSplus、3時間RTまたはO / Nを4℃で希釈したヤギαウサギ。 、15分ごとにTBSで3回すすぎマウントし、上記のようにカバースリップ。 </li></ol></li><li> CldU、IDU同時染色 <ol><li>セクション3.2.1で説明したように（ - 3.2.1.2 3.2.1.1ステップ）のセクションをすすぎ、変性させ、中和する。 </li><li> TBSplus、室温で1時間でαマウスIgG（H + L）を20μg/ mlの非結合体のFab断片とインキュベートします。 TBSで4回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。 </li><li> （400;精製されたIgG2 1）およびマウスα-のBrdU（1：350）、ラットα-のBrdUを含有する一次抗体のカクテルでインキュベートTBSplus、O中/ N 4℃で希釈した。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。 </li><li> （1ビオチン化ロバのα-ラットを含む二次抗体カクテルでインキュベート：500）、およびFITC-CONJ。ロバαマウスFab断片（1：100）。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。 </li><li>ローダミンレッド-CONJでインキュベートする。ストレプトアビジン、RTで2時間。 、15分ごとにTBSで3回すすぎマウントし、上記のようにカバースリップ。 </li></ol></li><li> ネスチンGFPマウスにおける蛍光シグナルの増幅 <ol><li>ヤギα-GFPは、一次抗体カクテルに追加。 </li><li> （そのようなアレクサ488 CONJとして。α-ヤギロバ）をGFPに類似したスペクトル特性を持つ蛍光色素結合二次抗体を追加し、二次抗体カクテルに。 </li></ol></li></ol></li><li> エピトープ回復 <ol><li>不凍液を洗い流した後、エピトープ回復を行ってください。 99°C（約25分） - 0.1Mクエン酸緩衝液pH6.0〜95を含有する6員または12ウェルプレートと予熱蒸し器。 </li><li> （プラスチックリットルとしてアルミホイルでプレートを覆い、30分間ホットクエン酸緩衝液と蒸気にセクションを移すIDS）は、耐熱性ではありません。 </li><li>すぐに冷却する氷浴中にプレートを配置。これは、出生後の動物の脳切片を扱うときに特に重要である、組織形態を保護するのに役立つ。 </li><li>すすぎとクエン酸を中和し、染色を続けるために10分間TBSで3回ずつ洗浄します。 </li></ol></li><li> マウス組織上のマウス抗体 <ol><li>第1ブロッキングステップ（ 例えば、ステップ3.1.5または3.2.1.3）に、αマウスIgG（二次抗体と同じホスト-種H + L）を20μg/ mlの一価のFab断片を追加します。 </li><li> TBSで4回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ、それぞれのプロトコルを進める。 </li></ol></li><li> クレシルバイオレット対比 <ol><li> （ガラス瓶）で60℃に予熱クレシルバイオレット溶液。 3分間の高温溶液中でスライドをインキュベートする。 </li><li>水溶液中ですすいでください。 DEST。 70％、96％、100％イソプロパノールで1分間ずつ2回脱水する。 </lI&gt; <li> 6キシレンで分または互換性のある永久封入媒体とのキシレン代替とカバースリップ - 5クリア。 </li></ol></li></ol> 4.データ解析<ol><li>歯状回の全体吻側尾側範囲に沿ってすべての6 番目のセクションにペルオキシダーゼ染色新生児細胞を数える。 400Xの倍率で光学顕微鏡を使用してください。 </li><li>新生児の細胞の総数の推定値を得るために交差間隔で得られた細胞数を掛け。 </li><li>適切なレーザーおよびフィルターシステムを備えた共焦点レーザー顕微鏡で画像蛍光標識セクション。 400Xの倍率で歯状回の全範囲に沿ってランダムな位置で画像スタックを取り、他のマーカーとの同時標識のために半球あたりの関心の少なくとも50ランダムに選択された細胞を分析する。 </li><li>絶対計算するために新生児の細胞の総数で同時標識された細胞（/ 100％）が得られた割合を乗算特定の新生児細胞集団の番号。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

新生児細胞の亜集団の定量および同定は、成人の神経発生研究の中心的な課題である。大人の神経発生の特定の段階の間に発現タンパク質に対する増殖マーカーおよび抗体を組み合わせることにより、これらの亜集団の免疫組織化学的検出を可能にする。抗体または抗体の組み合わせのいくつかは、特定の染色条件を必要とする。 合成チミジン類似体の分裂細胞の標識は、まだ大人の海馬の神経新生を研究するためのゴールドスタンダードです。これは、実験開始前に適切な注入プロトコルを考慮することが重要である。我々は通常、50mg / kgの（体重、腹腔内）のBrdUを投与したが、濃度は、実験的な要件（最大300ミリグラム/ボーラス注射用キロ）8,16によって異なる場合があります。 IDUとCldUは細胞集団の時間的な差別のために連続して注入される必要がある場合には、等モル濃度を（注入することが必須である<em&gt;例えば、42.5 mg / kgをCldUと57.5 mg / kgをIDU）。そのチミジン類似体が分裂細胞に対して毒性であってもよいし、DNA合成16を受けて損傷した...

二つの脳領域を構成的生涯を通じて新しいニューロンを生成し、側脳室の脳室下帯と海馬歯状回（DG）の下帯（SGZ）。新生ニューロンは、神経前駆細胞から派生し、成熟1,2に到達する前に形態学的および生理学的な開発のさまざまな段階を経る。ゆっくり分裂放射状グリア様幹細胞（タイプ1）から、トランジットの連続した​​ステージは、中間前駆細胞を増幅が生じる。より未分化のサブタイプ（タイプ2aおよび2b型）が短く、接線プロセスとの不規則な形状を有する。彼らは徐々に未熟ニューロン（樹状突起と分子層の方に延長）になるために細胞周期を終了し、最終的に成熟した顆粒細胞などの海馬ネットワークに統合する神経芽細胞（タイプ3）を生成します。それらの特定の生理学的特性には、これらの細胞は、強化された可塑3 suggesで回路を提供ティン海馬機能で独自の役割。実際には、最後の十年の研究では、成人の神経新生が空間記憶、パターン分離と情動行動4,5に寄与することを実質的証拠を生成した。 成体神経新生は、異なるアプローチを用いて研究することができる。チミジン類似体は、細胞周期のS期の間にDNAに組み込むと新生児の細胞6-8の誕生デート、定量化と運命分析を可能にする。別のチミジン類似体（ 例えば、CldU、EDUのまたはIDU）を順次適用は、細胞の代謝回転または実験9の経過中の異なる時点で生まれた細胞集団を研究するために使用することができる。代替、細胞増殖のための内因性のマーカーはKi67のです。これは、細胞周期（G1、S、G2、M）休止期を除く（G0）及びG1 10,11の先頭のすべての段階の間に分裂する細胞において発現される。成人における新生児細胞集団の表現型を解析するために、dentat電子状回いくつかの段階特異的な分子マーカーは、GFAP、ネスチン、およびNeuNのDCX 1,6として使用することができる。 GFAPは成熟したアストロサイトのマーカーであるだけでなく、大人の前脳における放射状グリア細胞様細胞に発現している。ネスチンは、放射状グリア様細胞および初期の中間前駆細胞に特異的な中間径フィラメントである。 DCXは、中間前駆細胞、神経芽細胞と未熟ニューロンにおいて発現微小管結合タンパク質である。 +、ネスチン- 、2A型（GFAP - 1型（GFAP +、ネスチン+、DCX）：これらの3つのマーカーと4の異なる前駆細胞のサブタイプを識別できる標識された細胞の形態学的特徴の（共）式に基づいて、 、DCX - ）、2B型（GFAP - 、ネスチン+、DCX +）とタイプ3（GFAP - 、ネスチン- 、DCX +）1。一緒に有糸分裂後ニューロンに発現しているのNeuN、とDCXの同時標識、immaturの分化を可能にする電子（DCX +、のNeuN +）および（DCX - 、のNeuN +）成熟顆粒ニューロン。 上述したマーカーは、しばしば、新生児細胞の数および同一性を分析するために免疫蛍光同時標識およびその後の共焦点顕微鏡検査のために使用される。これは、典型的には望ましくない抗体の交差反応性を防止するために、異なる宿主種由来の抗体を必要とする。しかし、神経発生の研究に適した一次抗体の大部分は、どちらウサギまたはマウス（ 例えば、マウスα-BrdUを、マウスα-のNeuN、ウサギα-Ki67の、ウサギα-GFAP）で飼育されている。これは、単一のスライスで評価することができる抗原の数との組み合わせで重大な制約をもたらす。これは、複数の染色を実行しなければならないように、染色の労力を増加させるだけでなく、結果の信頼性を損なう可能性だけでなく。さらに、いくつかの抗原は、ホルマリン固定誘導性エピトープマスキング（ 例えば、Ki67の影響を受けやすい、ネスチン）。私たちはここに、これらの問題の多くを克服古典的な単一および複数の免疫標識プロトコル（ 例えば、エピトープ回復、複数の連続免疫染色、ネスチン-GFPトランスジェニックマウス12の使用）からの変更について説明します。特に、複数のシーケンシャル免疫プロトコルは、抗体の一部は、同じ宿主に由来する場合であっても、最大4つの異なる抗原に対する染色を可能にする。これは、同時タイプ1、タイプ2aと2b型と3型前駆細胞の検出、ならびに単一セクション内のそれらの増殖活性を可能にする。

<table><tbody><tr><td colspan="4">チミジンアナログ投与</td></tr><tr><td>5-ブロモ-2&prime;-デオキシウリジン、BrdU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285</td><td>毒性(変異原性、催奇形性)</td></tr><tr><td>5-クロロ-2&プライム;-デオキシウリジン、CldU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6891</td><td>毒性(変異原性、催奇形性)</td></tr><tr><td>5-クロロ-2&プライム;-デオキシウリジン、CldU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2105478</td><td>毒性 (変異原性、催奇形性)</td></tr><tr><td>5-ヨード-2&prime;-デオキシウリジン, IdU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2100357</td><td>毒性 (変異原性, 催奇形性)</td></tr><tr><td colspan="4">Tissue preparation</td></tr><tr><td>Isoflurane-Actavis</td><td>Piramal Healthcare</td><td>700211</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド粉末 (PFA)</td><td>Riedel-De H&auml;en</td><td>16005</td><td>有毒で可燃性</td></tr>の<tr><td>灌流ポンプ PD5206</td><td>Heidolph Instruments</td><td>523-52060-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Tygon lab tubing, &Oslash; 0.8 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>06409-13</td><td></td></tr><tr><td>フィーディングニードル、ストレート、21 G、1.75 mm オリーブチップ、40 mm</td><td>Agnthos</td><td>1036</td><td></td></tr><tr><td>凍結ミクロトーム Microm HM 400</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24ウェル細胞培養マルチウェルプレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Tefal vitacuisine steamer</td><td>Tefal</td><td>VS 4001</td><td></td></tr><tr><td>Netwell 24 mm ポリエステルメッシュメンブレンインサート</td><td>Corning</td><td>3479</td><td>6ウェル培養プレートにプリロード</td></tr><tr><td>Netwell 15 mm ポリエステルメッシュメンブレンインサート</td><td>12</td><td>ウェル培養プレートにプリロード</td>されたCorning <td>3477</td></tr><tr><td>Netwellプラスチック6ウェルキャリアキット</td><td>Corning</td><td>3521</td><td>(24mmポリエステルメッシュメンブレンインサート用)</td></tr><tr><td>Netwellプラスチック12ウェルキャリアキット</td><td>Corning</td><td>3520</td>(<td>15mmポリエステルメッシュメンブレンインサート用)</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABCキット</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>DAB (3,3&prime;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5637</td><td>発がん性、光感受性</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Primary Antibodies</em</td></tr><tr><td>>Rabbit IgG1 &alpha;-Ki67</td><td>Novocastra/ Leica Biosystems</td><td>NCL-L-Ki67MM1</td><td>DAB 1:400/IF 1:100; エピトープ検索が必要</td></tr><tr><td>ウサギ &α;-GFAP, AS-3-GF</td><td>Synaptic Systems</td><td>173 002</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ヤギIgG (H+L) &-GFP</td><td>Acris 抗体</td><td>R1091P</td><td>1:300</td></tr><tr><td>マウスIgG1 &-ネスチン</td><td>Abcam</td><td>ab6142</td><td>1:200; エピトープ賦活化が必要</td></tr><tr><td>モルモット IgG (H+L) &α;-ダブルコルチン</td><td>メルク ミリポア</td><td>AB2253</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ラット IgG2a &α;-BrdU(腹水)</td><td>AbDセロテック/ Bio-Rad</td><td>OBT0030CX</td><td>BrdUの検出用;DAB 1:500/IF 1:400</td></tr><tr><td>ラット IgG2a &α;-BrdU (精製)</td><td>AbD セロテック/ バイオ・ラッド</td><td>OBT0030&nbsp;&nbsp;</td><td>CldUの検出用。DAB 1:500/IF 1:250-400</td></tr><tr><td>マウス IgG1 &α;-NeuN</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>マウス IgG1&#954; &#945;-BrdU</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>IdUの検出用;DAB 1:500/IF 1:350<</td></tr><tr>td colspan="4">二次抗体</td></tr>ロ<tr><td>バ &α;-モルモット IgG (H+L)-ビオチン</td><td>Dianova</td><td>711-065-152</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ロバ &α;-ラット IgG (H+L)-ビオチン</td><td>Dianova</td><td>712-065-150</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ロバ &α;-マウス IgG (H+L)-ビオチン</td><td>Dianova</td><td>715-065-151</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ヤギ &-ラット IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11006</td><td>1:250</td></tr><tr><td>ロバ &α;-ヤギ IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>分子プローブ</td><td>A11055</td><td>1:250</td></tr><tr><td>ロバ &α;-マウス IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment</td><td>Dianova</td><td>715-097-003</td><td>1:100</td></tr><tr><td>ロバ &α;-マウス IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>715-605-151</td><td>1:250</td></tr><tr><td>ロバ &α;-モルモット IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>706-605-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>ロバ &α;-ラット IgG (H+L)-ローダミン Red-X</td><td>Dianova</td><td>712-295-150</td><td>1:250</td></tr><tr><td>ロバ &α;-ウサギ IgG (H+L)-ローダミン Red-X</td><td>Dianova</td><td>711-295-152</td><td>1:250</td></tr><tr><td>ロバ &α;-モルモット IgG (H+L)-ローダミン Red-X</td><td>Dianova</td><td>706-296-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-ローダミン Red-X</td><td>Dianova</td><td>016-290-084</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ヤギ &α;-ウサギ IgG (H+L)-AMCA</td><td>Dianova</td><td>111-155-144</td><td>1:250, ウサギとのみ連携 &α;-GFAP</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Molecular Probes</td><td>H3570</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>1:1000<</td></tr><tr>td colspan="4">Blocking</td></tr><tr><td>Fab-fragment donkey &α;-mouse IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>715-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Fab-fragment donkey &α;-rabbit IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>711-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>正常なロバ血清</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>正常なウサギ血清</td><td>Dianova</td><td>011-000-010</td><td></td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>Dianova</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Histology</td></tr><tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>Neo-Clear</td><td>Merck Millipore</td><td>109843</td><td>非毒性キシレン代替品</td></tr><tr><td>Neo-Mount</td><td>Merck Millipore</td><td>109016</td><td>永久封入剤</td></tr><tr><td colspan="4">顕微鏡</td></tr><tr><td>Axioskop 2</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 710</td><td>カールツァイス顕微鏡</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

大人の海馬神経新生を研究するために、同じホスト種由来の抗体による免疫組織化学および複数のラベル

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

成体神経新生は、新しいニューロンが次第にコミット中間前駆体サブタイプを介して活性化神経幹細胞から生成された高度に調節され、多段階プロセスである。これらのサブタイプの各々は、一緒に、特定の形態学的基準とのそれらの同定のために使用することができる特定の分子マーカーの組を表す。典型的に、免疫蛍光技術は、エキソヌクレアーゼまたは内因性の増殖マーカーと組み合わせてサブタイプに特異的な抗体を含む適用される。私たちはここに大人の海馬の神経新生のすべての段階の検出および定量のための方法を免疫標識について説明します。これらは、チミジン類似体、腔的灌流、組織処理、熱誘導性エピトープ回復、ABC免疫組織化学、複数の間接的免疫蛍光、共焦点顕微鏡法および細胞定量化の適用を含む。さらに私たちは、問題のuを回避するシーケンシャル複数の免疫蛍光プロトコルを提示sually同じ宿主種に上げ、一次抗体を使用する必要性から生じる。これは、単一のセクション内増殖マーカーと一緒にすべての海馬前駆細胞サブタイプの正確な同定を可能にする。これらの技術は、並列に異なる前駆体サブタイプの調節、脳の病理への関与、特定の脳機能におけるそれらの役割を研究するための強力なツールである。

我々は、上記の方法は、出生後および成体海馬における新生児の細胞を定量し、特徴付けるために適用される。したがって、我々は、野生型および神経発生欠損サイクリンD2は、神経新生の速度（ すなわち、富化環境、EE）13,14に影響を及ぼすことが知られている条件下で飼育（CCND2 KO）マウスをノックアウト使用。 Ki67に、BrdUを、CldUまたはIDUのいずれに対して免疫組織化学的DAB染色は常に野生型及びCCND2 KOマウス（ 図3）15の間の新生児の細胞数の違いを明らかにした。さらに、CldUとIDUの連続した等モルの注射で、我々はEE（ 図3C、D）の具体的な期間中に生まれた細胞集団を識別することができました。セクション3.2.4を採用することに成功し、それらの同時配信します（ 図4）の後に等しい信号強度とCldUとIDUの優れた重複を検出することができた。 BrdUのラベル新生児細胞はスタンで表現型することがで...

このビデオ記事は、同じ組織切片内の成体海馬ニューロン新生のすべての段階を検出し定量化するための包括的なプロトコルを示しています。私たちは、異なる宿主種からの適切な抗体が利用できない場合に生じる間接的な多重免疫蛍光の限界を克服する方法を詳しく説明しました。

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

この手順の全体的な目的は、異なる宿主種の適切な一次抗体が入手できない場合に、神経前駆細胞を研究するための間接免疫蛍光法の制限を回避することです。まず、分裂細胞を標識するためにチミジンアナログを注入し、その後、組織を採取して処理し、凍結切片を作成します。まず、逐次多重免疫蛍光染色を行います。非標識の一次抗体を適用し、次に蛍光標識した二次抗体を結合させます。続いて、一次抗体と同じ種の血清を用いて、最初の二次抗体の露出したエピトープをブロックし、2番目の二次抗体に認識される可能性のあるすべての免疫グロブリンを非標識のFabフラグメントで被覆します。これにより、組織を2番目の一次抗体で処理することが可能になり、その抗体を別の二次抗体で標識できます。最終的に、切片の画像を用いて、特定の刺激に対する神経前駆細胞の発達と調節、および特定の脳機能におけるそれらの関与を研究します。同時多重免疫蛍光染色などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、通常、同一の宿主種で作成された一次抗体を使用する必要から生じる問題を回避できることです。この手法は、生理学的または薬理学的刺激、脳疾患、あるいは加齢に応答した海馬前駆細胞サブセットの増殖など、成人期の神経新生分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。一般的に、この手法に不慣れな者は、同一ホスト種由来の一次抗体を用いた多重染色において、適切なブロッキングが行われない場合に予期せぬ抗体交差反応が生じやすいため、苦労することがあります。まず、注射を行う動物の体重を測定し、注射用の10 mg/mLの新鮮なチミジンアナログストック溶液を調製します。溶液の調製が完了したら、体重に合わせて調整した投与量を、30ゲージの針を備えた微量投与用シリンジに準備します。次に、マウスを項皮で固定し、目的のタイムポイントでチミジンアナログを腹腔内に注射します。その後、マウスを深く麻酔し、経心腔的に灌流します。まず10 mLの氷冷PBSで灌流し、続いて40 mLの新鮮な氷冷ホルムアルデヒド溶液で灌流します。その後、脳を摘出し、固定法に従って同じ固定液で後固定を行います。回収した脳を10% sucrose溶液中で4 °Cで24時間インキュベートします。翌日、脳を30% sucrose溶液に移し、さらに48時間インキュベートします。凍結保護を済ませた脳を、-25 °Cのイソペンタンで凍結させます。その後、クリオスタットを用いて、長期保存用に40 µmの冠状断面を切り出します。切り出した切片を凍結防止剤溶液に移し、-20 °Cで保存します。まず、細筆を用いて切片を凍結防止液からTBSへ移します。切片を十分に洗浄しますが、まず4 °Cで一晩洗浄し、続いて室温で10分間の洗浄を5回行います。これらのインキュベーションはすべて、緩やかに絶えず撹拌しながら実施してください。目的の抗原の1つがチミジンアナログである場合は、この時点で塩酸による変性ステップを行い、続いてボア緩衝液で中和ステップを実施する必要があります。その後、TBS plusを用いて、透過処理および非特異的な抗体結合部位のブロッキングを行います。このインキュベーションを室温で1時間行い、翌日にTBS plusで希釈した1剤目の一次抗体中で4°Cにて一晩インキュベートしてください。切片をTBSで3回、TBSTで1回洗浄します。各洗浄は10分間行います。その後、1種類目の蛍光標識二次抗体を用いて、室温で3時間インキュベートします。以降、切片を遮光して保存します。さらに洗浄を繰り返した後、2種類の一次抗体の作製に使用した宿主種の10%血清溶液に切片を移します。この溶液中で3時間インキュベートし、一次抗体に対する非特異的な結合部位を飽和させます。その後、TBSで3回、TBSTで1回洗浄し、血清を除去します。次に、一次抗体のホスト種に対する非標識の一価Fabフラグメントを50 µg/mL含むTBS溶液を調製します。これにより、2つ目の二次抗体に認識される可能性のあるエピトープをブロックします。切片をこの溶液に移し、4 °Cで一晩インキュベートします。インキュベート後、切片をTBSで3回以上、次にTBSTで1回すすぎます。移送の際は、切片が入ったメッシュインサートをペーパータオルで軽く拭い、残留したfabを除去してください。次に、切片を2回目の一次抗体で4°Cにて一晩インキュベートします。再び一連の洗浄を行った後、2回目の二次抗体を室温で3時間反応させます。最後に、切片をTBSで3回洗浄し、ゼラチンで封入します。スライドを風乾させ、ANTIFA封入剤を用いてカバーガラスを被せます。共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、蛍光ラベルされた切片を観察します。歯状回全体の全域にわたり、400倍の倍率でランダムな位置から画像スタックを取得します。各半球につき、目的の細胞をランダムに少なくとも50個選び、異なるマーカーの共染色を分析してください。特定の新生細胞集団の絶対数を算出するには、共染色された細胞の割合に、DAB染色分析から推定された新生細胞の総数を乗じてください。上述の手法を用いて、神経新生欠損サイクリングにおける出生後および成体海馬の新生細胞の定量化および特性評価を行いました。D2ノックアウトマウスモデルにおいて、Ki67やBrdUなどの異なる増殖マーカーに対するDAB染色の結果、野生型マウスとノックアウトマウスの間で新生細胞数に一貫した差異があることが明らかになりました。BrdUでラベルされた新生細胞の表現型解析には、BrdU、GFAP、nestin、GFP、およびdoublecortinに対する一次抗体を同時に適用する従来の多重免疫蛍光染色プロトコルを用いました。これにより、単一の標本内で新生タイプ1、タイプ2A、タイプ2B、およびタイプ3前駆細胞を正常に同定することができました。あるいは、BrdUの注入から動物の犠牲化までの時間間隔が長い場合は、BrdUの新規ニューロン免疫染色の同時実施により、最終的な新生ニューロン数を解析することが可能です。連続免疫標識プロトコルでは、切片をまずウサギ抗KI-67抗体、ヤギ抗GFP抗体、およびモルモット抗Doublecortin抗体で同時にインキュベートし、次にウサギ抗GFAP抗体でインキュベートした場合にのみ完全に機能し、その逆の順序では機能しませんでした。このビデオを視聴することで、同一のホストで作成された一次抗体を用いて、単一の組織切片内で最大4つの異なる抗原を可視化する方法を十分に理解できるはずです。本手順を実施する際は、抗体の交差反応や偽陽性の可能性を排除するために、適切なコントロールを含めることが重要です。一次抗体によるインキュベーションの順序が、プロトコルの結果に強く影響を及ぼす可能性があることに留意してください。

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JoVE Journal

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神経科学

このビデオは、成体海馬の神経新生を調べるために使用される免疫蛍光染色法を示しています。最初に、マウスの脳切片は、ニューロン前駆細胞のニューロン新生に関連するマーカータンパク質に向けられた一次抗体による治療を受けます。次に、蛍光色素でタグ付けされた二次抗体で標識します。次に、脳切片を共焦点顕微鏡で観察し、マーカータンパク質の異なる組み合わせの発現パターンに基づいて、前駆細胞のさまざまなサブタイプを区別します。...

成体海馬神経新生を検出するための免疫蛍光染色法

このビデオでは、EdU取り込みを使用して脳組織切片で新たに増殖した神経幹細胞を染色し、続いて免疫蛍光法で特定のタンパク質を可視化する手順を示し、細胞の動態と増殖の理解を深めます。...

マウス脳切片における増殖神経幹細胞の可視化のための免疫蛍光染色

タンパク質の局在や分布は、細胞機能を理解するための重要な情報を提供します。電子顕微鏡の優れた空間分解能（EM）は、所定の抗原に続く免疫組織の細胞内局在を決定するために使用できます。抗原性はEM研究で特に困難であった維持しながら、構造的完全性を維持し、中枢神経系（CNS）の組織について。ここでは、ラット海馬CA1錐体細胞におけるシナプスタンパク質を研究し、特徴づけるために、CNS内の構造と抗原性を維持するために使用されている手順を採用しています。...

海馬スライス培養におけるシナプス蛋白のポストエンベディング免疫金ラベリング

成体の海馬神経新生では、静止状態の神経幹細胞が順次進行し、回路内で機能的に統合されたニューロンに発達するときに、異なる遺伝マーカーのセットが発現します。熱誘起抗原賦活化により、他の方法では検出が困難な前駆細胞の種類を同定し、より効果的に同定します。...

熱誘導抗原賦活化:成体海馬神経新生における前駆細胞型の検出および同定に有効な方法

この入門レベルのプロトコルは、ミクログリアとニューロン要素のマーカーを例に、げっ歯類の脳の免疫組織化学的染色を完了するために必要な試薬、機器、および技術を説明しています。...

ミクログリアとニューロンのための例染色：凍結切片ラット脳組織の免疫組織化学のためのプライマー

我々は、神経発達の起源の認知障害によって特徴づけられるマウスモデルにおける空間学習課題への曝露後の海馬ニューロンの活性化のプロファイルを研究するために免疫組織化学プロトコルを記述します。このプロトコルは、認知障害によって特徴付けられる遺伝的または薬理学的両方のマウスモデルに適用することができます。...

神経発達障害のマウスモデルにおける空間学習した後、海馬ニューロン活動の免疫組織化学的可視化

特定の細胞タイプへの遺伝子発現の局在化は、特異的な抗体がないために困難な場合があります。ここでは、ダブル蛍光 RNA in situ ハイブリダイゼーションと免疫染色を組み合わせることにより、遺伝子発現を 3...

ダブル蛍光を組み合わせます<em&gt;その場で</em&gt;マウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション

このプロトコルの目的は、特定の局所神経回路の化学的操作に応答して成人神経幹細胞/前駆細胞の挙動を分析するアプローチを記述することである。...

成人海馬神経前駆細胞のアッセイ回路特異的調節

この論文では、ラットの成体神経新生を測定するためにBrdU陽性細胞を視覚化するための最も一般的な4つの技術を紹介します。この作業には、試薬調製、チミジンアナログ投与、経心灌流、組織調製、ペルオキシダーゼ免疫組織化学反応、免疫蛍光、シグナル増幅、対比染色、顕微鏡イメージング、および細胞分析の指示が含まれます。...

チミジン類似体BrdUを用いたラットの細胞増殖と神経新生を解析するための免疫組織化学技術

ここで、プロトコルは、宿主と病原体の相互作用を研究するために同じ種で生起される一次抗体を用いて二重標識免疫蛍光を行う方法を説明する。また、このプロトコルには、別の宿主からの第3の抗体を含むことができる。このアプローチは、任意の細胞型および病原体で行うことができる。...

同種の抗体を用いた二重標識免疫蛍光による宿主と病原体の相互作用の研究

ここでは、マウス歯状回から単離された単一の核を配列決定する方法を紹介し、蛍光活性化核(FAN)ソーティングによってほとんどのニューロンを除外します。このアプローチは、高品質の発現プロファイルを生成し、神経幹細胞などの希少な集団を含む、ニッチに代表される他のほとんどの細胞タイプの研究を容易にします。...

海馬神経原性ニッチを研究するための単一核RNAシーケンシングと組み合わせたニューロンの蛍光活性化核ネガティブソーティング

学ぶ 同じ宿主種由来の抗体を用いた順次免疫蛍光法で、マウス海馬における成体神経新生の全段階を同一切片で検出・定量化する手法。この方法は抗体交差反応を回避し、神経前駆細胞の研究精度を向上させます。

大人の海馬神経新生を研究するために、同じホスト種由来の抗体による免疫組織化学および複数のラベル

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