大人の海馬神経新生を研究するために、同じホスト種由来の抗体による免疫組織化学および複数のラベル

この手順の全体的な目標は、間接免疫蛍光法の限界を回避して神経前駆細胞を研究することです。異なる宿主動物種由来の適切な一次抗体が利用できない場合。最初に、分裂する細胞を標識するためにチミジン類似体を注入し、その後、組織を回収、処理、およびクライオ切片にスライスします。

その後、逐次多重免疫蛍光法を行い、開始します。非標識一次抗体を塗布し、蛍光標識二次抗体に結合させます。次に、第1の二次抗体の開放ペリコープを第一次抗体種の血清でブロックし、第2の二次抗体が認識する可能性のあるすべての免疫グロブリンを非標識のfabフラグメントで覆います。

これにより、組織を2番目の一次抗体で処理し、別の二次抗体で標識することができます。最終的に、切片の画像は、特定の刺激に応答する神経前駆細胞の発生と調節、および特定の脳機能への関与を研究するために使用されます。この手法は、同時多発免疫蛍光法などの既存の方法と比較した場合の主な利点として、通常、同じ宿主種で産生された一次抗体を使用する必要性から生じる問題を回避することができます。

この方法は、生理学的または薬理学的刺激、脳の病状、老化に応答した海馬前駆細胞サブセットの増殖など、成人の神経新生の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。一般に、この方法に不慣れな人は、同じ宿主動物種由来の一次抗体による複数の標識が、適切なブロッキングなしで望ましくない抗体交差活性を引き起こす可能性があるため、苦労するでしょう。まず、注射する動物の体重を量り、注射用の新鮮な10ミリグラム/ミリリットルのチミジンアナログストック溶液を調製します。

溶液の準備ができたら、30ゲージの針が付いた細い投与量の注射器で重量調整用量を準備します。.次に、マウスを首筋で拘束し、所望の時点でチミジンアナログ腹腔内注射を行い、マウスとトランスカーディオを深く麻酔します。10ミリリットルの氷冷PBSで灌流し、続いて40ミリリットルの新鮮な氷冷ホルムアルデヒド溶液で灌流します。

次に、脳を解剖してポストし、固定後に同じ固定液に固定します。採取した脳を10%ショ糖中で摂氏4度で24時間インキュベートします。翌日、脳を30%スクロースに移し、さらに48時間インキュベートします。

脳を凍結保護の準備ができたら、摂氏マイナス25度のイソップペンタンで凍結します。その後、クライオスタットを使用して40ミクロンの冠状切片を切断し、長期保存します。切片を不凍液に移し、摂氏マイナス20度に保ちます。

細いブラシを使用して、不凍液からTBSに切片を移すことから始めます。切片をよくすすいで、摂氏4度で一晩洗うことから始めて、続いて室温で10分間を5回洗います。これらすべてのインキュベーションは、連続的に穏やかな攪拌で行う必要があります。

目的の抗原の1つがチミジン類似体である場合、この時点で塩酸変性ステップを実施し、続いてボアバッファーで中和ステップを実施する必要があります。TBS plusの非特異的抗体結合部位の透過性およびブロッキングを進めます。このインキュベートを室温で1時間放置した後、TBSで希釈した最初の一次抗体でインキュベートし、さらに翌日4°Cで一晩インキュベートします。

切片をTBSで3回、TBSTで1回洗浄します。各バスを10分間行かせます。次に、第1の蛍光色素標識二次抗体で室温で3時間インキュベートします。

これからは、セクションを光にさらさないように保護してください。別の洗浄シリーズの後、切片を2つの一次抗体を作製した10%宿主種の血清溶液に移します。この溶液中の切片を3時間インキュベートして、最初の二次抗体の開放ペリコーペスを飽和させます。

その後、TBSで3回、TBSTで1回すすぎ、血清を取り除きます。次に、一次抗体の宿主種に対して向けられた非標識単価fabフラグメントのミリリットルあたり50マイクログラムを含むTBS plusの溶液を調製します。これは、そうでなければ2番目の二次抗体によって認識される可能性のあるエピトープをカバーしています。

切片をこの溶液に移し、摂氏4度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、切片をTBSで少なくとも3回、TBSTで1回すすぎます。転送中に、ペーパータオルのセクションを含むメッシュインサートを綿棒で拭き取り、残りのファブの残りを取り除きます。

次に、2番目の一次抗体の切片を摂氏4度で一晩インキュベートします。再度の洗浄後、2つ目の二次抗体を室温で3時間適用します。最後にTBSで切片を3回洗浄し、切片のゼラチンの取り付けに進みます。

スライドを風乾し、ANTIFA封入用メディウムイメージを使用してカバースリップします。蛍光標識切片は共焦点レーザー走査型顕微鏡で標識しました。歯状回の全範囲に沿ってランダムな位置で画像スタックを400倍に拡大します。

半球ごとにランダムに選択された少なくとも 50 個の目的の細胞を分析して、さまざまなマーカーの同時標識を行います。特定の新生児細胞集団の絶対数を計算するには、DAB染色分析から推定された新生細胞の総数と共標識細胞の割合を掛けます。記載された方法は、ニューロン新生欠損サイクリングの出生後および成人の海馬における新生児細胞を定量化および特徴付けるために使用されました。

D 2ノックアウトマウスモデル、KI 67やBRDUなどの異なる増殖マーカーに対するDAB染色により、野生型マウスとノックアウトマウスの間で新生児細胞数に一貫して違いがあることが明らかになりました。BRDU標識新生児細胞は、GFPおよびダブルコートチンのB-R-D-U-G-F-A-P巣に対する一次抗体を同時に適用する従来の複数の免疫蛍光プロトコルで表現型を表現型決定することができました。これにより、1つの標本内で新生児1型、2型A型、2型B、および3型前駆細胞を成功裏に同定することができました。

あるいは、BRDU注射と動物の犠牲の間の時間間隔が長い場合、新生児ニューロンの最終数を同時BRDU新規n免疫染色によって分析できます。シーケンシャル免疫標識プロトコールは、切片を最初にウサギ抗KI 67抗体、ヤギ抗GFP、およびモルモット抗二重コルドン抗体と同時にインキュベートした場合、および次にウサギ抗GFAP抗体とインキュベートした場合に完全に機能しましたが、その逆はありませんでした。このビデオを見れば、同じ宿主で産生された一次抗体を使用して、単一組織切片の最大4つの異なる抗原を可視化する方法を十分に理解できるはずです。

この手順を試行する際には、抗体、交差反応性、または偽陽性の可能性を排除するために、適切なコントロールを含めることを忘れないでください。一次抗体のインキュベーションのシーケンスは、プロトコールの結果に強く影響する可能性があることに注意してください。