架橋反応性無料、スポッター無料多重サンドイッチ免疫測定用チップをスナップします。

この手順の全体的な目標は、サンドイッチイムノアッセイを使用して、試薬間の交差反応性なしにスポッターフリーの方法でチップ上の複数のタンパク質を同時に定量することです。この方法は、がんの候補タンパク質バイオマーカーの発見と検証など、定量的プロテオミクス分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マルチプレックスサンドイッチアッセイで抗体と抗原との間に交差反応性があること、およびユーザーが複雑なマイクロアレイスポッターを必要としないことです。

この手順を実演するのは、Parallex BioAssaysの科学ディレクターであるHeidi Larkinです。シングルトランスファー方式のスライドの準備を開始するには、新しいトランスファースライドをインクジェットマイクロアレイスポッターデッキに固定します。ポリスチレンマイクロビーズ溶液または30%グリセロールを使用して、スライドの端に一連のアライメントマークを見つけます。

インストゥルメントソフトウェアとスポッターカメラを使用して、品質管理のためにアライメントマークの写真を撮ります。次に、ニトロセルロースまたは官能基化ガラスアッセイスライドを転写スライドの左側にインクジェットマイクロアレイスポッターデッキに固定します。アライメントマークを使用して、捕捉抗体溶液の24アレイを400マイクロメートルの中心間間隔でスポットします。

アッセイスライドを室温で相対湿度60%の雰囲気で1時間インキュベートします。次に、24ウェルシリコンガスケットをスライドにクリップし、アレイに合わせます。PBS中のポリソルベート20の0.1%溶液を80マイクロリットルを各ウェルにピペットで移します。

スライドを450rpmで5分間振って、溶液を捨てます。この方法でスライドを3回洗います。次に、80マイクロリットルのBSAフリーブロッキング溶液を各すすぎウェルにロードします。

スライドを450rpmで1時間振ってください。その後、溶液を廃棄し、シリコンガスケットを取り外し、窒素ガスまたは遠心分離機を使用してアッセイスライドを乾燥させます。アッセイスライドをシリカゲルまたは別の乾燥剤を入れた密閉袋に密封し、摂氏マイナス20度で保管します。

同じアライメントマークを使用して、スポットあたり3.2ナノリットルを使用して、400マイクロメートルの中心間間隔で検出抗体溶液の24アレイをスポットします。トランスファースライドはマイナス20°Cで乾燥剤を入れた密封袋に保管してください。ダブル転写方式のスライドの準備を開始するには、転写スライドをインクジェットマイクロアレイスポッターデッキに固定します。

捕捉抗体溶液の24アレイを、中心間間隔400マイクロメートルでスポットします。次に、スナップ装置のプランジャースイッチを90度回して、プランジャーを開いた位置にロックします。キャプチャトランスファースライドを、クリップされたコーナーを固定ポゴピンに当てて装置に取り付けます。

対応するプランジャースイッチを90度戻して、ポゴピンを外します。トランスファースライドがポゴピンにしっかりと保持され、固定位置合わせピンと同じ高さになっていることを確認します。次に、新しいニトロセルロースまたは官能化ガラススライドを、コーティングされた面を下にしてポゴピンに置きます。

他の 3 つのスイッチを回して、ストレート ピンを外します。両方のスライドが固定位置合わせピンに対して固定されていることを確認します。次に、ピラーを位置合わせ穴に装着して、トップシェルをスライドホルダーに取り付けます。

閉じた装置をスナップケージに挿入し、クロージャータブを完全に押し下げます。装置を1分間閉じたままにします。次に、クロージャータブを引き上げて、装置をケージから解放します。

トップシェルを取り外し、アッセイスライドとトランスファースライドを分離します。アッセイスライドを1時間インキュベートします。次に、24ウェルシリコンガスケットをスライドにクリップで留め、スライドを3回洗います。

次に、BSAフリーのブロッキング溶液でスライドを1時間振とうします。ガスケットを取り外し、窒素ガスまたは遠心分離機の流れの下でアッセイスライドを乾燥させます。次に、インクジェットスポッターデッキに別の転写スライドを固定します。

スライド上に検出抗体溶液のスポット24アレイをスポット24アレイ、スポットあたり3.2ナノリットル、中心間400マイクロメートルの間隔で転写スライドを作成します。検出転写スライドはマイナス20°Cで保管してください。イムノアッセイを開始するには、調製したアッセイスライドを冷凍庫から取り出し、密封されたバッグ内で室温まで30分間温めます。

PBS中のタンパク質の7つの段階希釈溶液を0.05%ポリソルベート20で調製します。同じバッファーで適切に希釈したサンプル溶液を調製します。24ウェルシリコンガスケットを室温アッセイスライドにクランプします。

7つのタンパク質希釈液をカラム内の8つのウェルのうち7つにロードします。タンパク質を含まないPBSを0.05%ポリソルベート20とともに、そのカラムの最後のウェルにロードします。サンプル溶液を残りのウェルにロードします。

スライドを450rpmで室温で1時間、または摂氏4度で一晩振とうします。次に、スライドを3回洗います。ガスケットを取り外し、窒素ガスの流れの下でスライドを乾燥させます。

次に、検出抗体転写スライドを密封された袋の中で室温まで30分間温めます。次に、相対湿度60%の密閉チャンバー内でスライドを20分間インキュベートし、アレイを再水和します。ポゴピンを使用して、検出転写スライドをスナップ装置に上向きに固定します。

アッセイスライドを下向きにしてポゴピンに置き、スライドをストレートピンに合わせます。装置を閉じ、検出抗体をアッセイスライドにスナップトランスファーします。スライドを装置から取り出し、アッセイスライドを1時間インキュベートします。

24ウェルシリコンガスケットをスライドに固定し、スライドを3回洗浄します。次に、PBS中のストレプトアビジンフルオロ-4の2.5マイクログラム/ミリリットル溶液を各ウェルに80マイクロリットルロードします。スライドを450rpmで20分間振ってください。

スライドをPBS中のポリソルベート20の0.1%溶液で3回洗浄し、蒸留水で1回洗浄します。次に、ガスケットを取り外し、スライドを乾かします。蛍光スキャナーでスライドをスキャンし、スポット強度を測定します。

タンパク質濃度の検出限界を決定します。2つの蛍光タンパク質を、16ウェルテンプレートを用いた二重転写法を用いて、ニトロセルロース被覆スライド上に順次パターン化しました。第2の蛍光タンパク質を転写した際のクロスコンタミネーションは観察されませんでした。

スポット間の距離が短くなった小さなスポットは、疎水性の高い表面を持つスライドガラスに移すことができます。二重転写法により、配列の角度のずれが最小限に抑えられました。二重転写法を使用して、サンドイッチアッセイ形式で乳がん関連タンパク質の50プレックスイムノアッセイを実施しました。

交差反応性は観察されなかったため、各抗体ペアを独立して最適化することができました。アッセイから計算された標準曲線は、50種類のタンパク質のうち35種類がピコグラム/ミリリットルの検出限界を持っていたことを示しました。このテクニックをマスターすると、約3時間で完了できます。

この技術により、科学者はマイクロアレイベースのアッセイを行い、試薬をナノ液滴として送達することができます。この手順を試行するときは、スライドをスポッティングデッキとスナップ装置に適切に固定することを忘れないでください。このビデオを見れば、交差反応性フリーのマルチプレックスサンドイッチイムノアッセイのためのsnap装置の使用方法を十分に理解できるはずです。