Name: 架橋反応性無料、スポッター無料多重サンドイッチ免疫測定用チップをスナップします。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学ぶスナップチップ技術を用いた架橋反応性のない多重サンドイッチ免疫測定法。複雑なマイクロアレイスポッター不要で複数タンパク質を同時定量し、がん研究におけるタンパク質バイオマーカー発見を支援します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

インク ジェット偵察の使用ありがとう博士ロブ スラデック。我々 は最終的なカナダの機関からのサポート健康研究 (機構)、自然科学と工学研究審議会のカナダ (レベル)、カナダの癌協会の研究・ カナダ基礎技術革新 (CFI) を認めます。D. j. のおかげでは、カナダの研究の椅子からサポートします。

1 作製との貯蔵スナップ チップ <ol><li>シングル転送メソッド ( 図 1 a) <ol><li>400 μ g/mL の抗体を含むスポット cAb 溶液とリン酸緩衝生理食塩水で 20% グリセロール。(PBS)、ニトロセルロース (または機能性ガラス) に 60% の相対湿度でインク ジェット マイクロ アレイ スポッター 13 試金スライド (1.2 各スポットに nL) 800 μ m センター - 間隔。スライドは 1 つのコーナーによるとスポッター デッキの固定を確認してください (ここでは、左下隅を使用).</li>
		<li>相対湿度 60% で 1 時間室温で斑点を付けられたアッセイ スライドをインキュベートします</li>。
		<li>クランプ 16 井戸に分割するアッセイ スライド 16 区画を持つスライド モジュール ガスケットです。0.1% を含む PBS の 80 μ L を追加することによって、スライドを 3 回リンスそれぞれも、シェーカー、5 分毎回で 450 回転で振動にトゥイーン 20 (pbst;).</li>
		<li>もそれぞれ、450 rpm で 1 h に振る解決を妨げるを追加 80 μ L.</li>
		<li>ガスケットを外し、乾燥窒素の流れとアッセイ スライドです</li>。
		<li>はスポッター デッキで転送スライドを修正し、スポッター デッキの左下隅にスライドの左下隅をプッシュします。インク ジェット スポットは、タクシーと同じレイアウトで配置マーク (ポリスチレン ビーズのソリューション) の配列です</li>。
		<li>は、乾燥アライメント マークをしましょう。転送スライドを反転し、左下隅に対して修正スポッター デッキの上に戻す</li>。
		<li>DAb 溶液 20 μ g/mL の抗体があり、20% グリセロールおよび 1 %bsa をスポッティングを準備します</li>。
		<li>、スポッターを使用して &#39; s カメラ、位置合わせマークの写真を取る。基準としてスポッティングのプログラムにこの写真を実装し、最も一番上の左のマークを識別するためにインク ジェット偵察の画像認識システムを取得します。軽打の配列の最初のスポットとしてその座標を使用します。スポット 8 nL あたり 800 μ m の間隔でセンターに液滴</li>。
	</ol></li> <li>ダブル転送方式 ( 図 1 b) <ol><li>左下隅に対してインク ジェット偵察デッキに転送スライド 1 を配置。60% の相対湿度でインク ジェット マイクロ アレイ スポッターとスライドに 400 μ g/mL の抗体があり、20% グリセロール、PBS で 1 %bsa を含むタクシー溶液をスポット (0.4 各スポットに nL と 〜 200 μ m)。センターへの間隔は 400 μ m.</li>
		<li>はスナップ スナップ装置 ( 図 2) を使用して試金スライド上に cAb 滴を転送する転送被覆硝酸セルロース (または機能性ガラス) を使用してスライドの試金スライドです。
		90 度開いた位置ですべてのプランジャーをロックを取り出してスナップ装置側 <ol><li>ターンすべての六つのボタン。そのコンセントでスライド ホルダーにクリップの角を固定ポゴピンを直面している転送スライドを挿入します。黄金ポゴピンでプランジャーをリリース スライドの位置合わせピンに対して押されるかどうかを確認する 3 つのボタンの最初のセットを有効にします</li>。
			<li>は、4 ポゴピンの座っているスナップイン装置逆さまに硝酸セルロース コーティング スライドを挿入します。銀のピンでプランジャーをリリースし、スライドが位置合わせピンに対して押されるかどうかを確認する 3 つのボタンの 2 番目のセットを有効にします</li>。
			<li>スライド ホルダーを配置柱や穴を使用して正確な位置決めのためにトップのシェルを置くことによってスナップ装置を閉じます</li>。
			<li>そのケージに閉じられたスナップイン装置を挿入し、マイクロ アレイの適切な圧力を適用している間対面させる完全に閉鎖タブを押します。1 分の閉じた状態に保つ</li>
		</ol></li> <li>スライドを分離します。アッセイ スライド 60% の相対湿度で 1 時間室温で孵化させなさい。洗ってブロック、およびアッセイ スライドを乾燥で手順に従って 1.1.3 - 1.1.5</li>。
		<li>はインク ジェット偵察デッキと左下隅にプッシュ転送の別のスライドを配置します。50 または 100 μ g/mL の抗体 (表 1 参照)、20% グリセロール、PBS で 1 %bsa を含むスポット dAb 溶液。確実に 0.8 各スポット nL とセンターのセンター スポット間隔は 400 μ m.</li>
		<li>は、アッセイおよび転送スライドを格納します。乾燥剤を含む密閉袋にアッセイと転送の両方のスライドを密封し、-20 ° C のフリーザーに置く</li>。
	</ol></li></ol> 2。スナップ チップを用いた免疫を多重 <ol><li>冷凍庫からアッセイ スライドを取得します。スライドに部屋の温度になるまで 30 分間密封袋のままにします</li>。
	<li>準備 7 点シリアル 0.05% を含む PBS でタンパク質を打ちつけることによって試料溶液を希釈したトゥイーン 20 。
	注: ここでは、割増の希釈係数が使用されます。蛋白質ごとの開始濃度が表 1 に記載されています</li>。
	<li>適切なサンプル ソリューションを準備します。たとえば、4 回 PBST バッファーでひと血清を希釈します</li>。
	<li>試金スライド 16 コンパートメント ケットをクランプします</li>。
	<li>は、ピペッティングして 7 タンパク質の希釈溶液とタンパク質無料 pbst; 緩衝液 8 井戸の 1 つの列を入力します。同じスライド上の他の 8 の井戸の試料溶液をピペットします 。
	注: 80 μ L ソリューションはそれぞれに合うことができるも。さらにスライドを使用して、必要に応じて追加のサンプルを測定できます</li>。
	<li>は、室温で 1 時間、または一晩 3 回で 450 rpm、5 分たびにシェーカーの pbst; 4 ° C 洗うスライドで 450 rpm でシェーカーでサンプルをインキュベートします。ガスケットを外し、乾燥窒素ガスの流れの下でスライドです</li>。
	<li>は、冷凍庫から指紋と転送スライドを取得します。室温で 30 分間密封された袋をしてください。その後、水分補給のために 20 分間 60% 湿度安定化ビーズを含む密閉容器 (例えば 空ヒント ボックス) のスライドをインキュベートします</li>。
	<li>は、アッセイのスライドがスナップ装置 ( 図 2) を使用して軽く水滴を転送する転送スライドをスナップします。セクション 1.2.2 スナップ装置の操作を参照してください</li>。
	<li>は、スライドを区切ります。1 h. クランプ 16 コンパートメント ケットとアッセイ スライド用 60% 湿度安定化ビーズを含む密閉室内で試金スライドをインキュベートし、4 回スライドをすすいでください 450 rpm、5 分たびにシェーカーの pbst; を使用しています</li>。
	<li>溶液を各ウェルに PBS で 2.5 μ g/mL ストレプトアビジン fluorophore のピペット 80 μ L。450 rpm でシェーカーで 20 分間インキュベートします</li>。
	<li>は、450 rpm でシェーカーの PBST で 3 回スライドと蒸留水をすすいでください。ガスケットを外し、乾燥窒素ガスを用いたスライドです</li>。
</ol> 3。スキャンとデータ分析をスライド <ol><li>635 nm レーザーを用いた蛍光マイクロ アレイ スキャナーでアッセイ スライドをスキャンします</li>。
	<li>解析ソフトウェア (例えば配列 pro アナライザー) 16 を使用して各スポットのネットの強度を抽出します</li>。
	<li>統計解析ソフトウェアを使用して各蛋白質の検出 (LOD) の制限を計算して試料中のタンパク質の濃度を決定します 。
	注: LOD は銅の標準の Y 切片の値として定義されています。3 つの独立した測定の標準偏差を 3 回ずつ rve</li>。
</ol>

<ol><li>Mor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+protein+markers+for+early+detection+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Serum protein markers for early detection of ovarian cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).</li>
<li>Nicolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+post-operative+follow-up+of+breast+cancer+patients+with+tumour+markers%3A+CEA%2C+TPA+or+CA15.3+vs+MCA+and+MCA-CA15.3+vs+CEA-TPA-CA15.3+panel+in+the+early+detection+of+distant+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases.</a> BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).</li>
<li>Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+to+improve+protein+detection+by+indirect+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).</li>
<li>Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+multiplexed+MRM-based+protein+biomarker+quantitation+toward+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility.</a> Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).</li>
<li>Ekins, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-analyte+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Multi-analyte immunoassay.</a> J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).</li>
<li>Mahlknecht, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+microarray+analysis+of+serum+cytokines+in+neurodegenerative+Parkinsonian+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes.</a> Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+microarray+profiling+of+human+prostate+cancer+sera%3A+Antibody+screening+and+identification+of+potential+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers.</a> Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).</li>
<li>Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+droplet+microarrays+with+trapped+antibody-functionalized+beads+for+multiplexed+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis.</a> Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).</li>
<li>Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactivity+in+antibody+microarrays+and+multiplexed+sandwich+assays%3A+shedding+light+on+the+dark+side+of+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).</li>
<li>Blank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-chip+protein+arrays%3A+force-based+multiplex+sandwich+immunoassays+with+increased+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity.</a> Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).</li>
<li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%3A+A+Programmable+Force+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA: A Programmable Force Sensor.</a> Science. 301 (5631), 367-370 (2003).</li>
<li>Pla-Roca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Colocalization+Microarray%3A+A+Scalable+Technology+for+Multiplex+Protein+Analysis+in+Complex+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples.</a> Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).</li>
<li>Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-to-Microarray+Transfer+of+Reagents+by+Snapping+of+Two+Chips+for+Cross-Reactivity-Free+Multiplex+Immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays.</a> Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).</li>
<li>Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+snap+chip+for+high-density+sub-nanoliter+chip-to-chip+reagent+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer.</a> Sci. Rep. 5, 11688(2015).</li>
<li>Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+analysis+of+38+proteins+during+the+progression+of+human+breast+tumor+in+mice+using+an+antibody+colocalization+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray.</a> Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).</li>
<li>Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+mixtures+of+14+hygroscopic+additives+to+improve+antibody+microarray+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).</li>
<li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Multiplexed+Analyte+Quantification+Using+Peptide+Immunoaffinity+Enrichment+Coupled+to+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Partitioned+Droplet+Array+on+Laser-Patterned+Superhydrophilic+Glass+Surface+for+Wall-less+Cell+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays.</a> Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).</li>
<li>Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolizing+enzyme+toxicology+assay+chip+%28MetaChip%29+for+high-throughput+microscale+toxicity+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).</li>
<li>Fernandes, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+microarray+for+high-throughput+studies+of+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).</li>
<li>Kwon, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-Eluting+Microarrays+for+Cell-Based+Screening+of+Chemical-Induced+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).</li>
<li>Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Microarray+Based+on+Superhydrophobic-Superhydrophilic+Patterns+for+Single+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis.</a> Microarrays. 5 (4), 28(2016).</li>
<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Monitoring+of+Gene+Expression+Patterns+with+a+Complementary+DNA+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray.</a> Science. 270 (5235), 467-470 (1995).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sandwiched+microarray+platform+for+benchtop+cell-based+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening.</a> Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).</li>
</ol>

マギル大学は、Huiyan 李とデビッド ユンカーとこの仕事のいくつかの側面に発明者として特許出願を提出は。

この作品は、私たちは基本的な実験のセットアップを持つ研究者の多重相互反応性無料イムノアッセイは広く利用可能、スナップ チップ技術を発表しました。既存の抗体のマイクロ アレイとは異なり、マイクロ アレイ スポッターは不要エンドユーザーです。、両方のシングルとダブルの転送方法をデモンストレーションし、二重譲渡提供に優れたアライメント精度 〜 98% スポット、63 μ m14の最大のずれを 40 μ m。新しいスナップイン装置は便利なこの技術を研究者にアクセスできるように、一貫した圧力で 2 つのスライドに合わせて開発されました。信頼性の高い試薬転送を実現硝酸セルロース コーティング スライドのみならず、通常のガラス スライドにも広範なトレーニングを必要とせずこの技術の応用を大幅拡大します。スナップ チップの有用性を示すためには、50-プレックス イムノアッセイを行った事前斑点、ストアドのスライドを使用してと蛋白質の 70% の範囲の pg/mL14で Lod を達成しました。混合物として指紋を適用する既存の多重イムノアッセイと比べ、ACM とス...

高い感度と特異度癌1,2のような複雑な疾患の診断における単一マーカーよりも複数のタンパク質を含むバイオ マーカーのパネルがあります。酵素結合抗体法 (ELISA) はゴールド スタンダード技術を臨床研究所プラズマにおける低 pg/ml 検出限界がアッセイ3,4,5あたり 1 つのターゲットに制限を達成するために使用されています。抗体のマイクロ アレイは、単一顕微鏡スライド6,7、8に並行して実施小型の試金の何千もの収容のために開発されています。ただし、このメソッドの多重化機能は、指紋の混合物のアプリケーションから生じる試薬駆動の交差反応によって制限されます、それはターゲット9,10数の増加により問題となります。,11. Plaら。多重サンドイッチ試金の結果として脆弱性スケール N は目標12の番号 4N(N-1) として表明しています。
抗体のマイクロ アレイ、抗体の共存のマイクロ アレイでの交差反応性を軽減するために (ACM) 多重サンドイッチ試金12の私たちの研究室で開発しました。キャプチャー抗体 (タクシー) はマイクロ アレイのスポッターと基板上斑点を付けられます。ブロック サンプルが表面に適用され、cAb 抗原複合体と同じスポットに個々 の指紋を発見し。抗体と抗原との間のすべての交差反応性シナリオことができます ACM、軽減して pg/ml 検出限界が達成されています。ただし、試金のプロトコルは高価で時間のかかる配置目的のため精度の高い敷地内マイクロ アレイ スポッターを使用して、この技術の広い適用を制限する実験中に、指紋をスポッティングの準備と必要になりますその他の研究所。スナップ チップの名前、ハンドヘルド ACM は架橋反応性自由のために開発されている、サンドイッチ免疫測定13,14,15を多重化スポッター無料します。タクシーや指紋は事前の試金スライドとマイクロ アレイ フォーマットのそれぞれ転送スライドに斑点を付けるし、格納されています。アッセイ中にスライドを取得、指紋のマイクロ アレイは単に 2 つのチップを一緒に撮ってアッセイのスライドにまとめてに転送されます。スナップの装置は、信頼性の高い試薬転送に使用されます。比較的大きな抗体結合能を持つニトロセルロース コーティング スライドは、液体の液滴を吸収するアッセイ スライドとして使用されている、ため、試薬譲渡が容易、しかし、スライドがより規則的なガラスのスライドとマイクロ アレイよりも高価です非透明スライドと互換性のあるスキャナー信号集録が必要です。
この作品は、スナップ チップを搭載した多重サンドイッチ免疫測定法を実行するプロトコルを示す.新しいスナップイン装置マイクロ アレイ-マイクロ アレイからより便利で信頼性の高い試薬譲渡しました。重要なは、ここでスナップ チップと通常のガラス スライド上に試薬転送法を確立しました。1024 点は正常に移され、ほとんどの実験室でこの技術の使用を大幅に広げてスライド ガラス上に配置されます。

<table><tbody><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水錠剤</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>5246501EA</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン結合Cy5</td><td>ロックランド</td><td>s000-06</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p1379</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキングソリューション:BSAフリー StabilGuard Choice マイクロアレイ スタビライザー</td><td>SurModics, Inc</td><td>SG02</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロースコーティングスライド</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>305116</td><td></td></tr><tr><td>アミノシランコーティングスライド</td><td>Schott North America</td><td>1064875</td><td></td></tr><tr><td>Snap Device</td><td>Parallex BioAssays Inc.</td><td>PBA-SD01</td><td></td></tr><tr><td>インクジェットマイクロアレイスポッター</td><td>GeSiM</td><td>ナノプロッター 2.0</td><td></td></tr><tr><td>スライドモジュールガスケット</td><td>グレース・バイオラボラトリーズ</td><td>204862</td><td></td></tr><tr><td>湿度安定化ビーズ</td><td>パラレックス・バイオアッセイ</td><td>PBA-HU60</td><td></td></tr><tr><td>Array-Pro Analyzer software</td><td>Media Cybernetics</td><td>Version 4.5</td><td></td></tr><tr><td>蛍光マイクロアレイスキャナー</td><td>Agilent</td><td>SureScan Microarray Scanner</td><td></td></tr><tr><td>Biostatistics software</td><td>GraphPad Software</td><td>GraphPad Prism 6</td><td></td></tr><tr><td>Endoglin capture antibody</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ MAB10972</td><td></td></tr><tr><td>エンドグリンタンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>1097-EN</td><td></td></tr><tr><td>エンドグリン検出抗体</td><td>R&Dシステム</td><td>BAF1097</td><td></td></tr><tr><td>IL-6a(表1参照)</td><td>R&Dシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6b(表1参照)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

架橋反応性無料、スポッター無料多重サンドイッチ免疫測定用チップをスナップします。

Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays

多重蛋白質の分析は優れた診断感度と単一蛋白質と比較して精度を示しています。抗体のマイクロ アレイ マイクロ スケール イムノアッセイ単一チップ上で同時に実行の数千人を可能にします。サンドイッチ試金形式 2 抗体各ターゲットを検出することによりアッセイの特異性を向上させるが、したがって、多重化機能、制限試薬の交差反応性に苦しんでいます。抗体マイクロ アレイの共存 (ACM) 多重化タンパク質の架橋反応性無料検出用に開発されたアッセイ中マイクロ アレイ作製のため、高価なスポッター敷地内が必要です。この作品で一緒に、こうして偵察する必要はありませんサンプルの培養と検出抗体 (指紋) に後続のアプリケーションの間に単にスナップ 2 つのチップによってマイクロ アレイ-マイクロ アレイから試薬を転送スナップ チップ技術を紹介します。試金の実行からのスライドの準備を解離斑点を付けられた前のスライドのストレージ。2 つのマイクロ アレイ間の正確な配置を達成するために両方のシングルとダブルの転送方法と両方の方法のスライド作製を説明しました。結果を示す &#60; 40 μ m の位置合わせは、二重譲渡、625 スポット/cm2の配列密度に到達を達成されています。多重化されたタンパク質解析のスナップ チップの使いやすさを実証する 50 plexed 免疫測定法を実施しています。35 蛋白質の検出限界は、範囲の pg/mL にあります。

両方のシングルとダブルの転送方法の試金プロシージャは図 1に示します。単一の転送でアッセイ スライドに直接タクシーを発見され、指紋は、タクシー (図 1 a) のミラー パターンで使用時に試金のスライドに転送されます。1 つだけ転送手順が必要ですがズレ、スライドとインク ジェット ガントリー (図 2) との間の角度のミスアラインメントによって主に引き起こされる 2 つのマイクロ アレイ、苦しんでいるこのメソッド。この課題に取り組む方法の 1 つ、スポッティング スコープと適切にスナップイン装置でスライドを修正後タクシーとアッセイ スライドの順に指紋を転送することです (図 1 b)。このメソッドを使用して、両方のマイクロ アレイは、正確に同じ位置に転送されます。画像認識システムまたはアライメント マーカーは二重譲渡方法の必要ありません...

単に 2 つのスライドをスナップすることによって十字反応性無料多重サンドイッチ免疫測定を実行するためのスナップ チップ技術を紹介します。スナップの装置は、マイクロ アレイ-マイクロ アレイから試薬を確実に転送するために使用されます。スナップ チップは、クロス汚染せず異なる試薬の共存に注目を必要とする任意の生化学的な反作用に使用できます。

Multiplexed protein analysis has shown superior diagnostic sensitivity and accuracy compared to single proteins. Antibody microarrays allow for thousands ...

この手順の全体的な目的は、試薬間の交差反応を排除し、スポッターを使用せずにチップ上でサンドイッチ免疫測定法を用いて複数のタンパク質を同時に定量することです。この手法は、がんにおける候補タンパク質バイオマーカーの探索と検証など、定量的プロテオミクス分野における重要な課題の解決に寄与します。本技術の主な利点は、マルチプレックスサンドイッチアッセイにおける抗体と抗原の間の交差反応を抑制できること、および複雑なマイクロアレイスポッターを必要としないことです。手順の実演は、Parallex BioAssaysのサイエンティフィック・ディレクターであるHeidi Larkinが行います。シングル・トランスファー法のスライド作成を開始するには、新しい転写用スライドをインクジェット・マイクロアレイ・スポッターのデッキに固定します。ポリスチレンマイクロビーズ溶液または30% glycerolを用いて、スライドの端にアライメントマークのアレイをスポットします。装置ソフトウェアとスポッターカメラを使用して、品質管理のためにアライメントマークの写真を撮影します。次に、インクジェットマイクロアレイスポッターデッキ上のトランスファースライドの左側に、ニトロセルロースまたは機能化ガラスのアッセイスライドを固定します。アライメントマークを用いて、中心間距離 400 µm でキャプチャー抗体溶液の24アレイをスポットします。アッセイスライドを室温、相対湿度60%の環境下で1時間インキュベートします。次に、アレイに合わせて24ウェルシリコーンガスケットをスライドに固定します。各ウェルにPBSで調製した0.1% polysorbate 20溶液を80 µLずつピペッティングします。スライドを450 rpmで5分間振盪し、溶液を廃棄します。この洗浄操作を3回繰り返します。次に、洗浄済みの各ウェルにBSAフリーブロッキング溶液を80 µLずつ分注します。スライドを450 rpmで1時間振盪します。その後、溶液を廃棄し、シリコンガスケットを取り除き、窒素ガスまたは遠心分離機を用いてアッセイスライドを乾燥させます。アッセイスライドをシリカゲルまたは他の乾燥剤とともに気密袋で密封し、−20°Cで保存してください。同一のアライメントマークを使用し、スポット間距離 400 µm の間隔で、1スポットあたり 3.2 nL の検出抗体溶液を24アレイ分スポットします。転写スライドは、乾燥剤と共に密閉袋に入れ、-20 °C で保存します。ダブルトランスファー法によるスライド調製を開始するには、インクジェット・マイクロアレイ・スポッターのデッキに転写スライドを固定します。捕捉抗体溶液を、中心間距離 400 micrometers で24個のアレイとしてスポットします。次に、スナップ装置のプランジャースイッチを90度回転させ、プランジャーを開いた状態で固定します。切り欠きのある角を固定ポゴピンに合わせ、捕捉転送スライドを装置に装着します。対応するプランジャースイッチを90度戻して、ポゴピンを解放します。トランスファースライドがポゴピンでしっかりと固定され、固定アライメントピンと面一（つらいち）になっていることを確認してください。その後、新しいニトロセルロースまたは機能化ガラススライドのコーティング面を下にして、ポゴピンの上に配置します。残りの3つのスイッチを切り替えて、ストレートピンを解除します。両方のスライドが固定アライメントピンに対してしっかりと保持されていることを確認してください。その後、ピラーをアライメント穴に収めて、トップシェルをスライドホルダーに取り付けます。閉じた装置をスナップケージに挿入し、クロージャータブを完全に押し下げます。装置を閉じたまま1分間放置してください。その後、クロージャータブを引き上げて、ケージから装置を解除します。トップシェルを取り外し、アッセイスライドと転写スライドを分離します。アッセイスライドを1時間インキュベートします。次に、24ウェルシリコーンガスケットをスライドにクリップで固定し、スライドを3回洗浄します。その後、BSAフリーブロッキング溶液を用いてスライドを1時間振とうします。ガスケットを取り除き、窒素ガス流または遠心機でアッセイスライドを乾燥させます。次に、別の転写スライドをインクジェットスポッターのデッキに固定します。転写用スライドを作成するために、検出抗体溶液を1スポットあたり3.2 nanoliters、中心間距離400 micrometersの間隔で24アレイ分、スライド上にスポットします。検出転写用スライドをminus 20 degrees Celsiusで保存します。イムノアッセイを開始するには、準備したアッセイ用スライドをフリーザーから取り出し、密閉袋に入れたまま30分間室温に戻します。0.05% polysorbate 20を含むPBSを用いて、タンパク質の連続希釈溶液を7段階で調製します。同様のバッファーを用いて、適切に希釈したサンプル溶液を調製します。室温のアッセイスライドに24ウェルシリコンガスケットを固定します。7つのタンパク質希釈液を、1列の8つのウェルのうち7つに分注します。その列の最後のウェルには、0.05% polysorbate 20を含むタンパク質フリーのPBSを分注します。残りのウェルにはサンプル溶液を分注します。室温で1時間、または4°Cで一晩、450 rpmでスライドを振盪させます。その後、スライドを3回洗浄します。ガスケットを取り除き、窒素ガス気流下でスライドを乾燥させます。次に、検出抗体転写スライドを密封バッグに入れたまま、室温で30分間静置して温度を戻します。その後、アレイを再水和させるため、相対湿度60%の密閉チャンバー内でスライドを20分間インキュベートします。pogoピンを使用して、検出転写スライドをスナップ装置に上向きに固定します。アッセイスライドの表面を下にしてpogoピンの上に置き、ストレートピンに合わせてスライドの位置を調整します。装置を閉じ、検出抗体をアッセイスライドにスナップ転写します。装置からスライドを取り出し、アッセイスライドを1時間インキュベートします。24ウェルのシリコンガスケットをスライドに固定し、スライドを3回洗浄します。次に、各ウェルにPBSで調製した2.5 µg/mLのstreptavidin fluoro-4溶液を80 µLずつ注入します。スライドを450 rpmで20分間振とうします。PBSで調製した0.1% polysorbate 20溶液でスライドを3回洗浄し、続いて蒸留水で1回洗浄します。その後、ガスケットを取り除き、スライドを乾燥させます。蛍光スキャナーでスライドをスキャンし、スポット強度を測定します。タンパク質濃度の検出限界を決定します。16ウェルテンプレートを用いたダブルトランスファー法により、2種類の蛍光タンパク質をニトロセルロースコートスライド上に順次パターニングしました。2番目の蛍光タンパク質を転写した際、クロスコンタミネーションは観察されませんでした。スポット間の距離を短縮してスポットサイズを小さくしたものは、高度な疎水性表面を持つガラススライドへ転写することが可能です。この二段階転写法により、アレイの角度的な不整合を最小限に抑えることができました。また、この二段階転写法を用いて、サンドイッチアッセイ形式による乳がん関連タンパク質の50プレックスイムノアッセイを実施しました。交差反応は観察されず、各抗体ペアを独立して最適化することができました。アッセイから算出された標準曲線により、50種類のタンパク質のうち35種類でpg/mLレベルの検出限界が得られたことが示されました。この手法に習熟すれば、約3時間で完了させることができます。この技術により、研究者はマイクロアレイベースのアッセイを実施し、試薬をナノドロップレットとして供給することが可能になります。この手順を行う際は、スライドをスポッティングデッキおよびスナップ装置に適切に固定させることに注意してください。このビデオを視聴することで、交差反応のないマルチプレックスサンドイッチ免疫アッセイにおけるスナップ装置の使用方法について十分な理解を得ることができるはずです。

snap-chip-for-cross-reactivity-free-spotter-free-multiplexed-sandwich

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

定量的な、高スループット、リアルタイム、及びSiO上にラベルフリー生体分子の検出（DNA、タンパク質など）...

干渉反射イメージングセンサー（IRIS）を用いた生体分子の検出

ELISAは、簡単にルミネックスXMAPアッセイに変換することができると、多重化の利点を介して、いくつかの抗体は、アッセイのコストを削減しながら、増加した感度とダイナミックレンジの結果、最適な抗体のペアを識別するために同時にスクリーニングすることができる。...

多重抗体スクリーニング法を用いたLuminex XMAPアッセイへの捕捉ELISAの変換

このビデオでは、交差反応性のないマルチプレックスサンドイッチ免疫測定法のためのスナップチップ技術の実装を紹介しています。それぞれ異なる試薬を含む2つのマイクロアレイスライドをスナップする簡単な操作で、クロスコンタミネーションなしで試薬の移動が保証され、サンドイッチイムノアッセイを使用して複数のタンパク質を検出するのに役立ちます。...

交差反応性のない多重化サンドイッチ免疫測定法のためのスナップチップ技術

この記事では、単一細胞解析のためのマイクロ流体チップを提示する。これは、蛍光アッセイまたはイムノアッセイによって細胞内タンパク質、酵素、補因子、およびセカンドメッセンジャーの定量化を可能にする。...

単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

現在の資源不足の状況では、研究者がより安価に、より速く、より正確に研究を行うことを可能にする新しい技術が出現しています。ここでは、複数の環境病原体へのヒトの曝露を同時に測定するためのビーズベースの唾液抗体マルチプレックス免疫測定法の開発について説明します。...

環境病原体に対するヒトの暴露を測定するために唾液抗体マルチプレックスイムノアッセイの開発

人間が消費する淡水貯留層にシアノバクテリア毒素が存在することは、水管理当局にとって大きな懸念事項です。水質汚染のリスクを評価するために、この記事では、抗体マイクロアレイチップを使用して、液体および固体サンプル中のシアノバクテリア株を野外で検出するためのプロトコルについて説明します。...

検出するための実験プロトコールシアノバクテリア抗体マイクロアレイチップと液体と固体試料中の

現在では、複雑なサンプル準備と高価な計測器が必要し、低リソース環境では使用しにくいジカ、チクングニア ウイルスおよびデング...

多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

SARS-CoV-2の中和IgGおよびIgM抗体を同時に測定できる多重血清および抗体中和アッセイの開発には、2レポーターの読み出しを提供するビーズベースの多重化アッセイのフロー分析システムが使用されました。...

多重化ビードベースの流れ分析システムのための高速多重デュアルレポーターIgGおよびIgM SARS-CoV-2中和アッセイ

この論文は、細胞外小胞サブセットの特性評価のためのスループットを向上させた新世代のマルチパラメトリック分析プラットフォームを提案します。この方法は、多重化されたバイオセンシング法と、原子間力顕微鏡による計量学的および形態力学的分析とラマン分光法の組み合わせに基づいており、マイクロアレイバイオチップにトラップされた小胞ターゲットを認定します。...

細胞外小胞サブセット解析のための多重化表面プラズモン共鳴イメージングチップ上のマルチモーダル解析プラットフォーム

多重バーコード画像解析により、最近、腫瘍微小環境の特性評価が改善され、細胞組成、機能状態、および細胞間相互作用の包括的な研究が可能になりました。本明細書では、高次元画像解析技術の使用を可能にする、オリゴヌクレオチド結合抗体およびサイクルイメージングのバーコードを用いた染色およびイメージングプロトコルについて説明する。...

パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

学ぶスナップチップ技術を用いた架橋反応性のない多重サンドイッチ免疫測定法。複雑なマイクロアレイスポッター不要で複数タンパク質を同時定量し、がん研究におけるタンパク質バイオマーカー発見を支援します。

架橋反応性無料、スポッター無料多重サンドイッチ免疫測定用チップをスナップします。

さらに動画を探す