長期インキュベーション後のマウス脳スライスの神経活動の測定

マウス

の脳スライスを記録チャンバーに固定し、長時間のインキュベーション後に酸素化されたaCSFを灌流します。

スライス内の細胞にはカルシウムインジケーターがロードされており、細胞内カルシウム測定が容易になります。

電解質溶液中の電極を含む記録ピペットを取ります。

ターゲットニューロンを特定します。記録ピペットを細胞膜に陽圧で配置し、くぼみを作ります。

負圧を加えて密閉します。

さらに、負圧パルスを印加し、膜を破裂させ、全細胞構成を確立します。

高カリウム濃度のaCSFを灌流し、ニューロンの膜を脱分極させます。

脱分極はナトリウムチャネルを開き、活動電位を引き起こし、それが電位依存性カルシウムチャネルを活性化し、カルシウムの流入を可能にします。

カルシウムイオンが指示薬に結合して蛍光を高め、適切な照明下で視覚化できます。

カリウム適用後のカルシウム流入によって引き起こされる細胞内蛍光の増加は、長期インキュベーション後のニューロンの生存率を示しています。

記録のために、組織を顕微鏡下の水中記録チャンバーに入れ、毎分4〜5ミリリットルの流速で酸素化されたaCSFで灌流します。特注のハープを使ってティッシュを保持します。次に、マイクロピペットプーラーを使用していくつかの記録ピペットを準備し、5〜6メガオームの最終抵抗を達成します。

ピペットに3〜4マイクロリットルの内部溶液を満たし、溶液を氷の上に置きます。次に、IR-DIC下でCCDカメラを使用して細胞を視覚化します。マイクロマニピュレーターを使用してピペットを細胞膜上に配置します。ピペットホルダーの吸引口から陽圧を維持します。ピペットがセルに装着したら、ピペットに穏やかな負圧を加えてギガオームのシールを実現します。

次に、短時間の負圧で細胞膜を破裂させます。その後、セル全体の電流または電圧クランプの記録を開始します。フロー4の単一励起波長の場合、励起光を460〜490ナノメートルのバンドパスフィルターでフィルタリングし、515〜550ナノメートルのバンドパスフィルターで放出された光をフィルタリングします。