遺伝子組み換えショウジョウバエの脳におけるタンパク質凝集体のイメージングと定量

遺伝子組み換えショウジョウバエの脳から始めます。これらの脳は、周囲のグリア細胞に広がる可能性のあるニューロン内で赤色の蛍光タグ付き変異タンパク質を発現し、黄色の蛍光タグ付き正常タンパク質を発現させ、それらの凝集を引き起こします。

細胞の完全性を維持する固定液を追加します。

固定剤を取り除き、緩衝液で洗浄します。

退色防止試薬を加えてインキュベートし、蛍光シグナルのフェージングを防ぎます。

脳をスライドに移し、余分な液体を取り除きます。

脳がスライドに付着するのを待ちます。

カバーガラスの小片をスペーサーとして使用し、その上にカバーガラスを置きます。退色防止試薬を加えて密封します。

共焦点顕微鏡下で、赤と黄色の蛍光の異なる励起波長を使用して画像をキャプチャします。

画像解析ソフトウェアを使用して、タンパク質凝集体を定量します。

赤と黄色の蛍光の共局在は、変異タンパク質の拡散を示しています。

すべての脳が解剖されたら、収集チューブを室温の章動器に移し、約5分間揺らします。固定期間の後、P1000ピペットを使用して固定液の大部分を取り除き、脳をチューブ内に残すように細心の注意を払って廃棄します。これには、穏やかな吸引と注意深い観察が必要です。

次に、1ミリリットルの新鮮なPBSTを脳に加えます。チューブを覆い、章動器の上で約1分間揺らして、残りの固定剤を洗い流します。次に、溶液を取り出し、この短い洗浄ステップを繰り返します。

2回の短い洗浄に続いて、5分間の洗浄を1回、次に20分間の洗浄を3回、最後に1時間の洗浄を1回行います。最後の洗浄後、PBSTの大部分を慎重に取り除き、脳を30マイクロリットルのグリセロールベースの退色防止試薬に浸します。その後、暗闇の中で脳を4°Cで1〜24時間動かずにインキュベートします。

その後、鈍いピペットチップを使用して収集チューブから脳を取り出し、顕微鏡スライドに移します。次に、鉗子を使用してイメージングするために、必要に応じて脳の向きをそっと調整します。複数のサンプルを同じスライドに別々の列に取り付けることができます。

次に、折りたたまれた実験用組織の角を使用して、スライドから余分な色あせ防止試薬を取り除きます。組織が脳に接触しないようにしてください。次に、サンプルを暗所に5〜10分間放置して、脳をスライドに付着させます。

次に、壊れたカバーガラスの小片を取り、脳の周りに置き、約19平方ミリメートルの領域を覆います。次に、22平方ミリメートルのカバーガラスを脳とガラスのモザイクの上にそっと下げて、ブリッジマウントを作成します。次に、カバーガラスの下に新しい色あせ防止試薬をゆっくりと分注し、空きスペースを埋めます。脳とガラスが所定の位置に留まるように、これを非常に慎重に行ってください。次に、カバーガラスをマニキュアで密封します。まず、角に塗るだけです。端に沿ってシールを完了する前に、角を軽くたたく5〜10分乾かします。脳はできるだけ早く画像化されるべきです。

40倍または63倍のオイル対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用して、導入遺伝子が発現する脳の領域でzスライスを収集するために、取り付けられた脳を画像化します。次に、個々のzスライスの涙点を定量化するか、スライスを3次元でレンダリングした後にデータを分析します。

十分に分離され、バックグラウンドシグナルがほとんどない変異ハンチントン凝集体を定量するには、共焦点z系列を3D表示モードで開きます。次に、解析ウィザードを使用して、選択したチャネル内の個々のスポットを特定します。

設定で、しきい値とフィルターを調整して、異種サイズのすべての集計を画像内の個々のオブジェクトとして正確に表現します。次に、バイナリ処理プリフィルタでオブジェクトの分割を有効にして、密接に関連するアグリゲートを分離します。ソフトウェアによって識別されたオブジェクトに関する定量的情報は、[測定]で報告されます。

涙点を数えた後、画像解析ソフトウェアでさらに特徴付けます。たとえば、スポットや表面の関連する測定を行い、骨材の直径、体積、または強度の情報を取得します。一部の野生型ハンチントン凝集体は、Zスタックを手動で移動し、周囲の拡散信号と区別できる緑色の涙点を数えることで定量化できます。

単一の集計が複数のスライスに表示される場合は、2 回カウントしないように注意してください。興味深い別の分析は、ハンチントンQ25-YFPとハンチントンQ91-mCherry凝集体の間の共局在の頻度を決定することです。これは、共焦点Zスタックを介してスライスごとに移動することにより、手動カウントを使用して行います。