デコンボリューション顕微鏡を用いたマウス初代視床下部ニューロンにおけるGLUT4タンパク質輸送のイメージング

マルチウェルプレート内のポリ-D-リジンでコーティングされたカバーガラス上で培養した野生型およびCCR5ノックアウトマウス初代視床下部ニューロンから始めます。

これらのニューロンは、細胞質内で緑色の蛍光タンパク質タグ付きグルコーストランスポーター-4(GFP-GLUT4)を発現します。

カバーガラスをスライドガラスに転写し、余分な媒体を優しく拭き取って、画像取得中の安定性を確保します。

カバーガラスを下に向けて、デコンボリューション顕微鏡ステージにスライドを置きます。

明視野照明下でニューロンを視覚化し、ケモカインCCL5とインスリンで順次処理します。

蛍光照明に切り替えてGFP-GLUT4発現標的ニューロンを同定し、イメージングパラメータを調整してライブ蛍光画像をキャプチャします。

野生型ニューロンでは、インスリンとCCL5がそれぞれインスリン受容体とCCR5に結合し、GFP-GLUT4膜転座を促進する下流のシグナル伝達経路を活性化します。

CCR5ノックアウトニューロンでは、CCL5が結合せず、GFP-GLUT4転座が減少します。

画像をキャプチャし、デコンボリューション アルゴリズムを適用して焦点が合っていない光を減らし、画像の鮮明さと解像度を向上させます。

ライブイメージング用に細胞を準備するには、鉗子を使用してニューロンを含むカバーガラスを慎重に取り除き、慎重にスライドガラスの上に置きます。次に、デリケートな作業用ワイプで余分な培地を2回折り、動かさずにカバーガラスの上に慎重に置きます。

カバーガラスの不必要な動きを防ぐために、余分な量の培地を取り除くことが不可欠です。

次に、選択した細胞サンプルを10ナノグラム/ミリリットルのCCL5または10単位/ミリリットルのインスリンで1分間処理します。その後、カバーガラスの端に1.5マイクロリットルの希釈インスリンを追加します。次に、60倍倍率の1.52NA対物レンズに浸漬油を加えます。

その後、カバーガラスを下に向けてデコンボリューション顕微鏡ステージにカバーガラスを置き、適切に固定します。明視野または蛍光照明を使用して、標的細胞を識別します。その後、標的細胞がはっきりと観察できるようになるまで焦点を調整します。不要な傷跡を避けるために、対物レンズをカバーガラス領域の外に動かさないでください。

次に、GFPシグナルによってGFP-GLUT4を同定します。次に、画像取得に必要な標的細胞を特定します。その後、ピクセル数、励起波長、透過率、露光時間、スタックの厚さ、時間間隔、合計イメージング時間など、各ターゲットセルに適切な実験パラメータを設定します。露出パラメータを約2,000〜3,000カウントに調整すると、ピクセル強度が最大になります。

蛍光光退色を最小限に抑えるには、露光時間を1秒未満に抑えながら、励起光の透過率をできるだけ減らします。ターゲットセルの上部と下部の両方がわずかに焦点が合っていないまで顕微鏡ステージを動かして、各ターゲットセルのzスタックの上限と下限を設定します。