エキソサイトーシスイベントの可視化のための全反射蛍光顕微鏡

反射蛍光またはTIRF顕微鏡ステージ上の胚性皮質ニューロンを含むガラス底皿から始めます。

これらのニューロンは、中性の細胞外pHでは蛍光を発するが、酸性小胞では非蛍光のままであるpH感受性緑色蛍光タンパク質またはGFPタグ付き小胞マーカーを発現します。

小胞が原形質膜と融合すると、細胞外pHへの曝露は蛍光を誘発し、エキソサイトーシスイベントを示します。

対物レンズを選択し、ニューロンに合わせて屈折率を設定します。

レーザービームをガラスに斜めに向けると、全反射が発生し、エバネッセント波が発生します。この波は、原形質膜近くのGFPマーカーを選択的に励起します。

TIRFの浸透深さを設定して、エバネッセントフィールドの上のGFPマーカーを除外します。

まず、広視野落射蛍光照明を使用して、GFP発現ニューロンを特定します。

次に、膜特異的励起のためにTIRF照明に切り替えます。

タイムラプス画像を取得して小胞融合イベントを記録し、エキソサイトーシスを視覚化します。

TIRF顕微鏡とサンプルをセットアップし、テキストプロトコルに従ってニューロンの焦点面を見つけたら、レーザーソフトウェアを起動し、レーザー制御ソフトウェアに接続します。照明を広視野に設定し、対物レンズを選択します。次に、サンプルの屈折率を設定し、491レーザーのTTLのチェックを外してレーザー強度を調整します。

イメージングパラメータの最適化は、床の無傷のエキソサイトーシス小胞のイメージング中に重要であり、焦点のドリフトや光毒性を回避しながら、分析に十分な高いS/N比の画像を生成します。

スライダーを 100 に調整してから、20 から 40 の間の値に戻します。次に、TTL を再確認します。次に、透過光照明で再びサンプルに焦点を合わせます。

次に、イメージングソフトウェアで491レーザー照明を選択し、シャッターを開きます。レンズを傷つけないように、コンデンサーを光学ベンチに逆さまに置きます。天井のレーザーの焦点を微調整します。

そして、コンデンサーを取り外した状態で、ポイントをクローズドフィールドダイヤフラムの中心に配置します。次に、コンデンサーを交換します。そして、TIRFソフトウェアで、浸透深さを110ナノメートルに設定します。次に、イメージングのために広視野照明からTIRF照明モードに切り替えます。

次に、広視野落射蛍光を使用して、眼鏡を通してVAMP2フロリン発現細胞を見つけます。次に、光退色と光毒性を低減するために、最小限の露光時間とレーザー強度を使用して、イメージングパラメータを調整して、信号対雑音比とダイナミックレンジを最大化します。セルごとに連続オートフォーカスを設定します。次に、5分間、0.5秒ごとに取得するタイムラプス画像セットを取得します。