全反射蛍光顕微鏡を用いた細胞イメージング

反射蛍光(TIRF)顕微鏡のセットアップから始めて、バッファー内にヒト神経芽細胞腫細胞が付着したガラスカバーガラスを含むカバー付きイメージングチャンバーを備えています。

これらの細胞は、シナプス小胞膜に特異的な蛍光色素を発現します。

落射蛍光モードで、イメージングするセルを選択します。

TIRFモードでは、対物レンズを通してサンプルにレーザーを向け、カバーにスポットとして現れます。

高屈折率のガラスカバーガラスと低屈折率のサンプルの間の界面で臨界角を超えるように角度を調整し、細い線として見える全反射(TIR)を引き起こします。

TIRは、最も近い膜の蛍光色素を励起するエバネセント波を生成します。

出された蛍光は対物レンズによって収集され、カメラによってキャプチャされます。

カバーガラス付近の細胞膜の高コントラスト画像に微調整します。

取得設定を最適化して光退色を最小限に抑え、サンプリング周波数を設定します。

TIRFイメージングを開始して、融合したシナプス小胞を視覚化します。

落射蛍光モードでは、カバーガラスに焦点を合わせ、チャンバーセンターに配置されたトランスフェクト細胞を選択します。ソフトウェア制御下で、ライブモードで芝生照明に切り替えます。芝生の構成を設定するには、サンプルカバーの対物レンズから出てくるビームの位置を確認します。ビームが対物レンズの中央に配置されると、芝生サンプルカバーの中央にスポットが見え、セルは落射蛍光モードで画像化されます。

臨界角に到達するには、芝生スライダーの角度調整ネジを使用して、焦点を合わせたスポットをY方向に動かします。ビームが臨界角よりも大きい角度でサンプル平面に収束すると、スポットは消え、サンプルカバーの中央に直線で細い焦点が合った線が明らかになります。芝生の角度を微調整するには、セルサンプルを使用します。

ビデオで蛍光画像をご覧ください。この段階では、落射蛍光のような画像がまだ見えます。芝の状態になるまでネジをゆっくりと動かします。ここでは、セルの 1 つの光学面のみに焦点が合っているため、コントラストの高いフラットな画像が得られます。

サンプルイメージングを実行するには、シングルチャンネルタイムラプス実験を設定します。適切な露光時間は40〜80ミリ秒です。1ヘルツまたは2ヘルツのサンプリング周波数で画像を取得します。