全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

本手順の全体的な目的は、細胞壁を持つ微生物の高画質な全内部反射蛍光画像またはTURF画像を取得することです。まずカバーガラスと細胞を調製し、次に、最適な画質を得るために顕微鏡セットアップを精密に調整することでこれを達成します。

次に、画像または動画を取得するために、適切な入射角、角度、およびイメージング条件を選択します。最後のステップは、取得した画像のイメージング後処理です。最終的に、ターフ顕微鏡法を用いて、細胞皮質におけるタンパク質局在のダイナミクスを研究します。

従来の顕微鏡法や共焦点顕微鏡法などの金属を用いた手法に対する本手法の主な利点は、顕微鏡観察における画像コントラストが非常に高く、高速な撮像と低光量での観察が可能であることです。そのため、本手法は側方タンパク質分離のメカニズムや膜タンパク質の可動性など、膜研究分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。TIRF顕微鏡用のカバーガラスは、使用前に埃などの粒子を除去して洗浄してください。

turfは、汚れたカバーガラス上の埃に起因する背景信号に敏感です。そのため、カバーガラスの洗浄手順を開始するには、背景ノイズの少ない洗浄済みのカバーガラスが必要となります。ピンセットを使用して、カバーガラスを蓋付きのセラミックホルダーに入れてください。

次に、ガラス容器に1 Mの水酸化ナトリウムを満たします。この水酸化ナトリウムは、複数回再利用することが可能です。カバーガラスを入れたセラミックホルダーを水酸化ナトリウムに入れ、低速で連続回転させながら2時間インキュベートします。

8時間を超えてインキュベートしないでください。2時間後にカバーガラスが不透明になるためです。カバーガラスを蒸留水で2回、それぞれ5分間、低速で連続回転させながら洗浄します。洗浄後のカバーガラスは、100% ethanolを満たしたセラミックホルダーに保存してください。ターフ顕微鏡観察用のbacillus subtlest細胞を調製するには、適切な増殖培地5 mL中でOD 600が0.01から0.05になるまで希釈し、対数増殖期まで培養します。合成培地で1.25% arosを調製するには、aros粉末を1.5 mLプラスチックチューブに入れ、95 °Cで溶解させた後、ヒーティングブロックを用いて72 °Cで保存します。

スライドの中央にarosを少量滴下し、2枚目のスライドで押し付けて平坦なパッド状にします。少なくとも2分間放置した後、慎重にスライドを分離させます。500 µLのbacillus subtlest細胞をマイクロ遠心分離機を用い、12,000 RPMで1分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを50 µLの培地で再懸濁します。

2～4 µLの細胞をarosパッドの中央に添加します。次に、ピンセットを使用してエタノールを満たした容器から洗浄済みのカバーガラスを取り出し、加圧空気で乾燥させます。カバーガラスをサンプルの上に慎重に配置します。

顕微鏡観察の前に、細胞を少なくとも2分間静置させます。長期イメージングを行う場合は、加熱したワセリン、ラノリン、パラフィンの混合物またはVal-apを用いてカバーガラスの端を封印します。Saccharomyces visi細胞をターフ顕微鏡観察用に準備するには、前培養液を希釈し、適切な培地で少なくとも5時間培養します。

対数増殖期に、エタノールを満たした容器からカバーガラスを取り出し、ピペットスプレッダーを用いて加圧空気で乾燥させます。5 µLのCon A溶液をカバーガラス上に滴下し、加圧空気で乾燥させます。Con Aは酵母細胞壁の炭水化物に結合し、酵母細胞を固定します。

次に、4.5 µLの酵母細胞懸濁液を、コーティング済みカバーガラス（con）の端に滴下します。カバーガラスのサンプル面を下にして、まず一方の端を顕微鏡スライドグラスに接触させ、ゆっくりと倒すようにして被せます。これにより、気泡の形成を防ぐことができます。

顕微鏡観察の前に、細胞を少なくとも2分間静置させます。長期的なイメージングを行う場合は、val-apを用いてカバーガラスの端を密封してください。本ビデオで示すすべての実験は、Olympus 100 x 1.45 NA 対物レンズを備えた完全自動IMEXスタンドに基づくカスタム仕様のセットアップで実施されています。光源には、488 nanometersおよび561 nanometersの75 milliwattダイオード励起固体レーザー（DPSSレーザー）を使用しています。

Turfの角度と蛍光。フォトブリーチング後の回復またはFRAPの位置は、2つのガルバノメータを介して瞬時に調整可能です。3つ目のガルバノメータは、epi、蛍光、FRAP、およびTurfの切り替えに使用されます。

ライブアクイジションソフトウェアから直接制御されるガルバノメータにより、EM CCDカメラとカメラ前方の2倍拡大レンズを用いて収集されたターフ画像内で追跡された物体の局在化キネティクスの簡易的な測定が可能です。アクイジション（画像取得）も同様にライブアクイジションソフトウェアによって制御されます。レーザーを使用する前に、レーザー安全ゴーグルを着用し、ターフモードでレーザーを天井に照射して、レーザーが直線になるように0度位置のキャリブレーションを行ってください。

目的として、最適に調整した後、レーザースポットを最小サイズに絞ります。レーザープロファイルは、ほぼ円形で輪郭のはっきりしたスポットを形成する必要があります。セッションごとにキャリブレーションを行ってください。最適な画質を得るためには、ターフ顕微鏡のアライメントがこの手順の成功に不可欠です。

最適な画像品質を得るためには、画像取得における適切な入射角、角度、およびパラメータを慎重に調整する必要があります。画像取得を開始するには、明視野照明を用いて細胞の位置を確認してください。赤色LEDは、顕著な光損傷を誘発しないため、特に適しています。

レーザー照明に切り替え、選択した蛍光色素を励起させるために適切なレーザーとフィルターの組み合わせを選択します。この際、入射角が臨界角以下であることを確認してください。そうでないと、GFP融合タンパク質由来の信号が検出されません。カバーガラス側の細胞の上面を探します。

レーザービームの入射角を徐々に大きくして信号が消失するまで調整し、その後、細胞表面の蛍光が再び現れる点までゆっくりと角度を小さくします。表面の最適な位置に合わせるため、再度Zフォーカスを調整します。適切な入射角であれば、この酵母タンパク質の例に示すように、細胞の端にぼやけたハロー（光輪）が生じません。

左上から右下に向かって入射角を減少させながら撮影したPMA one GFPの画像。これらの画像は、臨界角における信号の急激な喪失と、構造情報および信号対雑音比の漸次的な低下を示している。ダイナミックレンジを最大化するために、レーザー強度とカメラゲインを調整すること。通常、非常に低い信号を高信号対雑音比で検出するには、E-M-C-C-Dカメラが最適である。

ターフ顕微鏡法は、ごくわずかな高さの違いに非常に敏感です。カバーガラスのわずかな段差により、同時に結像できる細胞数が数個に制限されることがあります。この蛍光ビーズの高密度懸濁液の画像は、視野の一部しかピントが合っていない、不均一な視野の一例です。

したがって、小さい細胞の場合、取得領域を選択した対象を含むサブ領域にまで縮小できることがよくあります。2色での実験では、R-F-P-G-F-Pペアにおける蛍光色素のブリードスルーを最小限に抑える必要があります。RFPは488 nanometerの光によって弱く励起されるため、個別の放出フィルターを使用してください。

ブリードスルーおよび二重色イメージングを回避するための一般的なワークフローをここに示します。個別のフィルターセットで細胞のイメージングを行った後、蛍光ビーズを用いて画像をデコンボリューションおよびアライメントし、それらをマージします。解析において、画質に影響を与える重要なパラメータはレーザーのアライメントと対物レンズの清浄度です。レーザーをアライメントし、ターフイメージングに使用するZ位置にフォーカスを合わせた後、サンプルを取り出し、対物レンズからすべてのオイルを拭き取ってください。

残留オイルはレーザー光の回折を招き、ビームプロファイルにスペックルを生じさせます。ターフ顕微鏡法を用いることで、細菌細胞内におけるアクチンホモログや細胞壁酵素の分布を可視化できます。この代表的な結果では、アクチンホモログMBLまたはトランスペプチダーゼPBPHのGFP融合タンパク質を発現させたBacillus subtilis細胞を、ターフ蛍光および通常のエピ蛍光で撮像しました。

ここに示す画像は、異なるイメージングモードでモニタリングした運動性MBLパッチが占める領域を示すため、時系列データの平均投影図を表したものです。オーバーレイ画像内の青い輪郭線は、明視野画像から可視化した細胞境界を示しています。

毎週発現するトランスペプチダーゼPBPHは、エピ蛍光ではほとんど見えないが、turfでは明確に区別できる皮質パッチに局在しています。浸透率の低下は、矢印で示されたSEPTAにおけるP-B-P-H-G-F-P信号で最も顕著に観察され、エピ蛍光では線として現れますが、turfでは点として現れます。次の画像セットは、Saccharomyces visiにおけるTOR複合体成分bit 61のエピ蛍光とturf照明の比較を示しています。

このタンパク質は弱く発現し、1つのパッチあたりわずか数コピーのタンパク質からなる小さな皮質パッチを形成します。エピ蛍光法では、強い背景ノイズのためわずかなパッチしか観察できませんが、TURFでは非常に高いSN比でパッチをイメージングできます。さらに、ガウスぼかしやメディアンぼかしを適用した画像の減算などのさまざまな画像処理ステップによって画像コントラストを向上させることができ、またローカル背景減算によってノイズを除去し、高強度構造を鮮明にすることが可能です。

これは多くの場合、微細構造の消失や高輝度領域の過剰な増幅という代償を伴います。矢印で示されているように、より優れた手法は2Dデコンボリューションであり、これは無料または市販のソフトウェアパッケージで実行可能です。デコンボリューション後のコントラストの向上は、未処理の画像とデコンボリューション後の画像を交互に示したGFP RAs twoのタイムラプス動画によって示されています。

GFP RA2は移動速度の速いタンパク質であるため、その動的な挙動を解明するには高速な画像取得時間が重要となります。酵母タンパク質であるFET 3G FPとPMA 1 RFPを用いたこのタイムラプス二色蛍光動画で示されているように、共局在解析においては画像処理が特に重要です。

最初の10フレームは生画像であり、残りのフレームはデコンボリューション後の画像です。解析を可能にするためには、コントラストを最大化し、ぼやけた生画像を鮮明にすることが不可欠です。Turfとfrapを組み合わせることで、皮質タンパク質のダイナミクスを強力に研究することができます。G-F-P-M-B-Lを発現するB subtlest細胞でこの手法を用いた結果、MBLを含むパッチの観察された運動性のメカニズムとして、トレッドミリングの可能性は除外されました。

移動パッチのchmグラフと、点線で示されたchmグラフに沿った強度プロファイルが、酵母細胞膜のturf frapと同様に示されています。TPAs PMA oneにより、酵母細胞膜タンパク質の緩やかな再編成が明らかになり、これらは形成後に細胞表面全体を覆うネットワーク状のドメインに分布します。この手法は、B. subtilisにおける細胞壁合成のメカニズムを探索する細菌細胞生物学分野の研究への道を切り拓きました。

このビデオを視聴することで、酵母や細菌などの微生物のターフ画像を撮影する方法と、この手法が皮質タンパク質の動的特性の研究にどのように役立つかについて、十分な理解を深めることができます。