全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

この手順の全体的な目標は、細胞壁を支えている微生物の高品質で全反射、蛍光、または芝の画像を取得することです。これは、最初にカバースリップとセルを準備することによって達成されます。2番目のステップは、最適な画質を得るために顕微鏡のセットアップを正確に位置合わせすることです。

次に、画像や動画を取得するための正しいインシデント、角度、およびイメージング条件を選択します。最後のステップは、取得した画像の画像処理後処理です。最終的に、芝顕微鏡は、細胞皮質におけるタンパク質の局在のダイナミクスを研究するために使用されます。

この技術の主な利点は、顕微鏡検査用の従来型または共焦点のような金属を超えることよりも、 画像コントラスト in 顕微鏡 それは非常に高く、速い時間と暗い光を可能にします。そのため、この方法は、側方タンパク質の分離のメカニズムや膜タンパク質の移動性など、膜研究の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。芝生顕微鏡用のカバースリップは、使用前にほこりの粒子から清掃する必要があります。

芝は汚れたカバースリップのほこりから生じるバックグラウンド信号に敏感であるため。カバースリップのクリーニング手順を開始するには、バックグラウンドの少ないクリーニングされたカバースリップが必要です。鉗子を使用して、蓋付きのセラミックホルダーにカバースリップを置きます。

次に、ガラス容器に1モルの水酸化ナトリウムを入れます。この水酸化ナトリウムは複数回再利用できます。カバースリップを入らせたセラミックホルダーを水酸化ナトリウムにセットし、ゆっくりと連続回転させて2時間インキュベー

2時間後に不透明なカバースリップが作成されるため、8時間以上インキュベートしないでください、ゆっくりとした連続回転で毎回5分間、カバースリップを蒸留水で2回洗浄し、洗浄したカバースリップを100%エタノールで覆われたセラミックホルダーに保管してください。芝顕微鏡用のBacillus Subtlest細胞を調製するには、適切な増殖培地5ミリリットルでOD 600を0.01〜0.05に希釈し、指数関数的な段階まで増殖させます。合成培地で1.25%アロスを調製し、アロス粉末を1.5ミリリットルのプラスチックチューブに95°Cで溶解し、72°Cの加熱ブロックに保管します。

スライドの中央にアロスを少し垂らし、2番目のスライドで、少なくとも2分後にアロスを平らなパッドに押し込み、スライドを慎重に分離します。12, 000 RPMのマイクロ遠心分離機で500マイクロリットルのバチルス微妙な細胞を1分間スピンダウンします。上清を捨て、ペレットを50マイクロリットルの培地に再懸濁します。

アロスパッドの中央に2〜4マイクロリットルの細胞を追加します。次に、鉗子を使用して、エタノールを充填した容器から洗浄したカバースリップを取り出し、加圧空気で乾燥させます。カバースリップをサンプルに慎重に置きます。

顕微鏡検査の前に、細胞を少なくとも2分間安定させます。長期間のイメージングの場合は、カバースリップの端をワセリン、ラノリン、パラフィンの加熱混合物またはValアプリでシールします。芝顕微鏡用にSaccharomyces visi細胞を調製するには、前培養物を希釈し、適切な培地で少なくとも5時間増殖させます。

指数関数的段階には、エタノールを充填した容器からカバースリップを取り出し、ピペットスプレッドで加圧空気で乾燥させます。5マイクロリットル、コンバル、カバーの上の解決策。加圧空気で滑らせて乾燥させると、Aは酵母細胞壁の炭水化物に結合し、酵母細胞を固定します。

次に、4.5マイクロリットルの酵母細胞懸濁液をconの片側に移し、コーティングされたカバースリップを塗ります。カバースリップサンプルを下にして顕微鏡スライドに慎重に置き、一方の端から始めてゆっくりと滴下します。これにより、気泡の形成が回避されます。

顕微鏡検査の前に、長期イメージング用のvalアプリでカバースリップの端をシールする前に、細胞を少なくとも2分間安定させます。このビデオで紹介されているすべての実験は、オリンパス100 x 1.45 NA対物レンズを備えた全自動IMEXスタンドをベースにしたカスタマイズされた芝生のセットアップで行われています。使用される光源は、75ミリワットのダイオード、488ナノメートルおよび561ナノメートルの励起固体またはDPSSレーザーです。

芝の角度と蛍光。光退色後の回復やフラットポジションは、2つのガルバノメーターで瞬時に調整できます。3番目の検流計は、エピ、蛍光、フラップ、および芝を切り替えるために使用されます。

ライブ取得ソフトウェアから直接制御されるガルバノメーターは、EM CCDカメラとカメラの前にある2倍拡大レンズで収集される芝生画像で追跡された物体のローカリゼーションキネティクスを簡単に測定できます。取得は、ライブ取得ソフトウェアによっても制御されます。レーザーを使用する前に、レーザー安全ゴーグルを装着し、芝生モードでレーザーを天井に投影し、レーザーが直線になるようにゼロ度の位置を校正します。

この対物レンズでは、最適な調整後にレーザースポットを最小サイズに集めると、レーザープロファイルはほぼ丸い形状の明確なスポットを形成する必要があります。各セッションの前にキャリブレーションを実行します。最適な画質を得るためには、芝マイクロスコープのアライメントがこの手順の成功に不可欠です。

最適な画質を得るには、画像取得の正しい入射率、角度、およびパラメータを慎重に調整する必要があります。画像取得を開始するには、明視野照明を使用して細胞の位置を特定します。赤色LEDは、大きな写真の損傷を引き起こさないため、特に優れています。

レーザー照明に切り替え、適切なレーザーとフィルターの組み合わせを選択して、選択した蛍光色素を励起し、芝の角度が亜臨界であることを確認します。そうしないと、GFP融合タンパク質から生じるシグナルは検出されません。セルの上部セクション (カバー スリップに面しているセルの側) を見つけます。

レーザービームの入射角を徐々に大きくして信号が消えるまでし、その後、細胞表面で蛍光が再び現れる点までゆっくりと角度を小さくします。Zフォーカスを再度調整して、表面での最適な位置を確保します。許容可能な芝の角度は、この酵母タンパク質の例で示されているように、細胞の端にぼやけたハローを作成しません。

PMA 1つのGFPは、左上から右下に向かって入射角が減少して画像化されています。画像は、臨界角度での信号の突然の損失と、構造情報と信号対雑音比の漸進的な減少を示しており、ダイナミックレンジを最大化するためにレーザー強度とカメラゲインを調整します。通常、E-M-C-C-Dカメラは、高い信号対雑音比で非常に低い信号を検出するのに最適です。

芝顕微鏡は、小さな高さに非常に敏感です。カバースリップの違いにより、同時に画像化できるセルが数個しかありません。蛍光ビーズの密集した懸濁液のこの画像は、視野の一部だけが焦点が合っている不均一な視野の一例です。

したがって、スモールセルの場合、獲得領域は、多くの場合、選択したオブジェクトを含むサブ領域に縮小できます。ダブルカラーターフ実験では、R-F-P-G-F-Pペアの蛍光色素のにじみを最小限に抑える必要があります。RFPは毎週488ナノメートルの光で励起されるため、別々の発光フィルターを使用してください。

ここでは、にじみやダブルカラーイメージングを回避するための一般的なワークフローを示します。別々のフィルターセットで細胞をイメージングした後、画像は蛍光ビーズを使用してデボルブされ、整列されます 分析のために、画質に影響を与える重要なパラメータはレーザーアライメントとクリーンな対物レンズです。レーザーの位置を合わせ、芝のイメージングに使用されるZ位置に焦点を合わせた後、サンプルを取り出し、すべてのオイルの対物レンズを清掃します。

残留油は、レーザー光の回折とビームプロファイルの斑点につながります。芝顕微鏡法は、細菌細胞内のアクチンホモログと細胞壁酵素の分布を視覚化するために使用できます。この代表的な結果では、アクチンフーグMBLまたはトランスペプチダーゼPBPHのGFP融合を発現するバチルス微量細胞を芝生および通常のエピ蛍光でイメージングしました。

この画像は、運動量がカバーする領域を示す時系列の平均投影法を表しています。MBLパッチは、さまざまなイメージングモードでモニタリングされます。オーバーレイ画像の青いアウトラインは、明視野画像画像から視覚化されたセル境界を示しています。

毎週発現するトランスペプチダーゼPBPHは、エピ蛍光ではほとんど見えない皮質パッチに局在しますが、芝生では明確に区別できます。浸透の減少は、矢印で示された SEPTA での P-B-P-H-G-F-P 信号で最もよく観察できます。これは、エピ蛍光では線として示されますが、芝では点として表示されます。この次の一連の画像は、Saccharomyces visiのTOR複合体コンポーネント(ビット61)の落射蛍光と芝照明の比較を示しています。

このタンパク質は毎週発現し、パッチごとにわずかの数個のタンパク質コピーを持つ小さな皮質パッチを形成します。落射蛍光では、強い背景の上に見えるパッチはごくわずかですが、芝生ではパッチを非常に良好なS/N比でイメージングできます。画像のコントラストのさらなる改善は、ガウス画像や中央値のぼやけた画像の減算や、ローカル背景の減算によるノイズの除去、高強度構造の改善など、さまざまな画像処理ステップを通じて得ることができます。

これは、多くの場合、微細な構造の損失と高強度領域の誇張された増幅という代償を伴います。矢印で示されているように、優れた手順は2Dデコンボリューションであり、これは無料または市販のソフトウェアパッケージで実行できます。デコンボリューション後のコントラストの増加は、生の芝生画像と縮伏した芝生の画像を交互に示しているGFP RAs 2のこのタイムラプス動画によって示されています。

GFP RAs 2は動きの速いタンパク質であるため、迅速な取得時間が分離に重要です。その動的な動作。特に、酵母タンパク質、FET 3G FP、PMA one RFPのタイムラプスダブルカラー動画で示されているように、画像処理は共局在解析において重要です。

最初の 10 フレームは RAW 画像を表し、残りのフレームはデボルブ 画像です 分析を可能にするには、コントラストを最大化し、ぼやけた RAW 画像を鮮明にすることが重要です。ターフとフラップは、皮質タンパク質のダイナミクスを研究するための強力な組み合わせを提供します。この手法をB-F-P-M-B-Lを発現する最も微妙な細胞で使用することで、パッチを含むMBLの観察された運動性のメカニズムとしてトレッドミリングが除外されました。

移動パッチのchmグラフと点線で示されたchmグラフに沿った強度プロファイルは、酵母原形質膜の芝フレープと同様に示されています。TPAのPMAは、酵母原形質膜タンパク質のゆっくりとした再配列を明らかにしました。これは、その開発後、細胞表面全体を覆うドメインのようなネットワークに分布します。この技術は、細菌細胞生物学の分野で、枯草菌の細胞壁合成のメカニズムを探求する研究への道を開きました。

このビデオを見れば、酵母やバクテリアなどの微生物の芝生画像を取得する方法と、この手法が皮質タンパク質の動的特性の研究にどのように役立つかを十分に理解できるはずです。