Name: 全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-01T12:03:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: 学ぶ TIRF顕微鏡法による細胞壁を持つ微生物のコルテックスタンパク質動態の可視化手法。高コントラスト・高時間分解能で膜タンパク質の局在と挙動を解析し、細菌や酵母の細胞生物学研究に応用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

この作品は、マックス·プランク協会によって資金を供給された。

<ol><li>Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+inflection+fluorescent+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Total internal inflection fluorescent microscopy.</a> J. Microsc. 129, 19-28 (1983).</li>
<li>Axelrod, D., Omann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial microscopy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Dominguez-Escobar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processive+movement+of+MreB-associated+cell+wall+biosynthetic+complexes+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria.</a> Science. 333, 225-228 (2011).</li>
<li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+it%2C+switch+it%2C+bounce+it%2C+pull+it%3A+using+lasers+to+reveal+plant+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics.</a> J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).</li>
<li>Uchida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+and+absolute+configuration+of+avenolide%2C+extracellular+factor+in+Streptomyces+avermitilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis.</a> J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).</li>
<li>Yu, H., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics%3A+Generating+randomness+by+formin%28g%29+and+moving%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving.</a> Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).</li>
<li>Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics+driven+by+formins+and+myosin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V.</a> J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).</li>
<li>Berchtold, D., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TORC2+plasma+membrane+localization+is+essential+for+cell+viability+and+restricted+to+a+distinct+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).</li>
<li>Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+single-molecule+imaging+of+plant+fluorescent+proteins+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

全反射顕微鏡は、画像周辺のタンパク質への選択のテクニックです。エバネッセント場の低浸透深さは、対雑音比が非常に良好なシグナルにつながり、高いフレームレート、または非常に弱く発現したタンパク質のイメージングとデータ収集を可能にするフォーカスライトのうち最小限に抑えることができます。高コントラスト、高フレームレートの組み合わせは、全反射顕微鏡皮質ローカライズされたタンパク質のイメージングの時空間ダイナミクスの最適なツールとなっています。興味深いことに多くの微生物を囲む厚い細胞壁は全反射によって末梢タンパク質のイメージングを妨げることはありません。実際には、一過性の実際の生成は非常に高い細胞壁と原形質膜5,10との間のインタフェースで発生します。終了した細胞でも酵母細胞8に撮像することができ、大きな表面積を説明するかもしれない細胞壁に沿って光の伝播につながる可能性がある光の反射。 TIRF IMの最適な品質のために年齢にもキャリブレーション顕微鏡システムを持つことが重要です。レーザーは、各イメージングセッションの前に集中して調整する必要があり...

<table border="1"><tbody><tr><td> ツール/試薬の名前 </td><td> タイプ </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>ツール</td><td> UniEquip </td><td> UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER </td></tr><tr><td>全反射顕微鏡</td><td>ティル</td><td></td><td>カスタマイズ·セットアップ</td></tr><tr><td>ガラス容器</td><td>ツール</td><td> Vitlab </td><td> 340から232880353 </td></tr><tr><td>セラミック染色ラック</td><td>ツール</td><td>トーマス科学。 </td><td> 8542E40 </td></tr><tr><td>コンカナバリンA </td><td>試薬</td><td>シグマ</td><td> L7647 </td></tr><tr><td>カバーガラス＃1（18×18ミリメートル） </td><td>顕微鏡</td><td>メンツェルグレイザー</td><td> BB018018A1 </td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>顕微鏡</td><td>メンツェルGレーザー</td><td> AA00000102E </td></tr><tr><td>液浸油</td><td>顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> Immersol 518F </td></tr><tr><td>アガロース</td><td>試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> FluoSpheres </td><td>試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> F8795 </td></tr></tbody></table>

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のcortex組織とダイナミクスの可視化、

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

全反射顕微鏡は、in vitroで、細胞1を生体内蛍光分子の時空間ダイナミクスを研究するための強力なイメージング技術として浮上してきました。特性臨界角（に近い境界と平行であることにIE）よりも大きい角度で低屈折率と培地中に高屈折率媒質から通過するとき光全反射の光学現象が発生します。すべての光がそのような条件下で反射されていますが、エバネッセント波は距離とともに指数関数的に減衰し、唯一のインターフェイス2の近くに100から200 nmであるサンプル領域を貫通して境界を越えてとに沿って伝播し、作成されます。優れた軸方向の分解能を提供することに加えて、焦点蛍光体のうちの低下励起対雑音比が非常に高い信号を生成し、2,3退色の有害な影響を最小限に抑えます。広視野のテクニックなので、全反射も高速な画像交流できます。ほとんどのスキャンベースの共焦点顕微鏡のセットアップよりquisition。 一見すると、全反射の低浸透深さは、多くの場合、厚い細胞壁で囲まれている細菌および真菌細胞のイメージングと互換性がないと思われる。それどころか、我々は酵母や細菌の細胞の細胞壁は、実際に全反射の使いやすさを向上させ、観察可能な構造を4-8の範囲を広げることを発見した。多くの細胞プロセスは、したがって、直接、しばしば強力な遺伝子操作技術を提供する小さな、単一細胞微生物で全反射によってアクセスすることができます。これは、私たちはタンパク質相互作用や活動の動態を直接生きた細胞で評価することができるin vivoで生化学の実験で行うことができます。 ここではサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）または枯草菌細胞のための高品質の全反射画像を得るために必要な個々の手順について説明します。我々はaffeできる様々な問題点を指摘CT TIRFは、細胞内蛍光プローブの可視化といくつかのアプリケーション例と手順を示しています。最後に、全反射画像がさらに確立された画像復元技術を使用して改善することができる方法を示しています。

全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡は、高コントラスト分解能と時間分解能で細胞表面に近い構造を観察するための強力なアプローチです。我々は、全反射は、細胞壁で囲まれた細菌や真菌細胞の皮質でのタンパク質のダイナミクスを研究するために用いることができる方法を示しています。

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

TIRF顕微鏡法は、インビトロおよび生細胞内における蛍光分子の時空間ダイナミクスを研究するための強力なイメージング技術として登場しました1。

本手順の全体的な目的は、細胞壁を持つ微生物の高画質な全内部反射蛍光画像またはTURF画像を取得することです。まずカバーガラスと細胞を調製し、次に、最適な画質を得るために顕微鏡セットアップを精密に調整することでこれを達成します。次に、画像または動画を取得するために、適切な入射角、角度、およびイメージング条件を選択します。最後のステップは、取得した画像のイメージング後処理です。最終的に、ターフ顕微鏡法を用いて、細胞皮質におけるタンパク質局在のダイナミクスを研究します。従来の顕微鏡法や共焦点顕微鏡法などの金属を用いた手法に対する本手法の主な利点は、顕微鏡観察における画像コントラストが非常に高く、高速な撮像と低光量での観察が可能であることです。そのため、本手法は側方タンパク質分離のメカニズムや膜タンパク質の可動性など、膜研究分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。TIRF顕微鏡用のカバーガラスは、使用前に埃などの粒子を除去して洗浄してください。turfは、汚れたカバーガラス上の埃に起因する背景信号に敏感です。そのため、カバーガラスの洗浄手順を開始するには、背景ノイズの少ない洗浄済みのカバーガラスが必要となります。ピンセットを使用して、カバーガラスを蓋付きのセラミックホルダーに入れてください。次に、ガラス容器に1 Mの水酸化ナトリウムを満たします。この水酸化ナトリウムは、複数回再利用することが可能です。カバーガラスを入れたセラミックホルダーを水酸化ナトリウムに入れ、低速で連続回転させながら2時間インキュベートします。8時間を超えてインキュベートしないでください。2時間後にカバーガラスが不透明になるためです。カバーガラスを蒸留水で2回、それぞれ5分間、低速で連続回転させながら洗浄します。洗浄後のカバーガラスは、100% ethanolを満たしたセラミックホルダーに保存してください。ターフ顕微鏡観察用のbacillus subtlest細胞を調製するには、適切な増殖培地5 mL中でOD 600が0.01から0.05になるまで希釈し、対数増殖期まで培養します。合成培地で1.25% arosを調製するには、aros粉末を1.5 mLプラスチックチューブに入れ、95 °Cで溶解させた後、ヒーティングブロックを用いて72 °Cで保存します。スライドの中央にarosを少量滴下し、2枚目のスライドで押し付けて平坦なパッド状にします。少なくとも2分間放置した後、慎重にスライドを分離させます。500 µLのbacillus subtlest細胞をマイクロ遠心分離機を用い、12,000 RPMで1分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを50 µLの培地で再懸濁します。2～4 µLの細胞をarosパッドの中央に添加します。次に、ピンセットを使用してエタノールを満たした容器から洗浄

visualization-cortex-organization-dynamics-microorganisms-using-total

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ここでは、機能性分子複合体を追跡し、定量、検出できるようにするために細菌細胞を生きて単一分子蛍光顕微鏡を実行するためのプロトコルを示す。...

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

このビデオでは、アクチンと微小管の重合ダイナミクスを視覚化するための全反射顕微鏡ベースの手法であるTIRFについて説明しています。この手法により、細胞のクロストークを理解するために不可欠な、アクチンと微小管の結合ダイナミクスをリアルタイムで高解像度でイメージングできます。...

アクチンと微小管の結合ダイナミクスを可視化するTIRF顕微鏡法

出典:Daniele, F., et.al SH-SY5Y 神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞ダイナミクスを評価するための TIRFM および pH 感受性 GFP プローブ: 細胞イメージングとデータ解析.J. Vis.

全反射蛍光顕微鏡を用いた細胞イメージング

出典: Winkle, C. C., et al.軸索分岐と神経細胞形態形成中の原形質膜送達の役割を定義するための複合方法論の利用。J. Vis. 経験。...

エキソサイトーシスイベントの可視化のための全反射蛍光顕微鏡

T細胞免疫シナプスにおける糸状アクチンの流れ速度と方向性を調査するために、生細胞の超解像イメージングと全反射蛍光を組み合わせ、時空間画像相関分光法で定量化します。...

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

高速・高分解能を可能にする高度な顕微鏡分離膜と周囲の細胞内のボリュームの両方の画像が表示されます。1 つのセットアップでディスクと全反射蛍光顕微鏡を回転の統合により、3.5 まで高い獲得率でライブ...

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

このプロトコルは、インビトロ表面アッセイを用いて微小管の無標識、高コントラスト、高速イメージングのための標準的な蛍光顕微鏡上の干渉反射顕微鏡を実装するためのガイドです。...

微小管のラベルフリー高速イメージングのための干渉反射顕微鏡の実装

ここでは、TIRF顕微鏡ベースの インビトロ...

TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

我々は、動的微小管および蛍光標識微小管関連タンパク質の同時イメージングのための干渉反射顕微鏡および全内部反射蛍光顕微鏡を実施するためのプロトコルを提示する。...

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

このプロトコルは、 in vitro 全内部蛍光(TIRF)顕微鏡アッセイを使用して動的アクチンおよび微小管を視覚化するためのガイドです。...

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのイン ビトロでの 可視化

学ぶ TIRF顕微鏡法による細胞壁を持つ微生物のコルテックスタンパク質動態の可視化手法。高コントラスト・高時間分解能で膜タンパク質の局在と挙動を解析し、細菌や酵母の細胞生物学研究に応用できます。

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

さらに動画を探す