修正Zigmondチャンバーアッセイを使用してトランク神経冠細胞移動の解析

本手順の全体的な目的は、摘出された体幹神経堤細胞において、ある分子が化学走性とその他の遊走反応を誘発する能力を評価することです。これはまず、長さがおよそ8から15ソマイトの間である体幹レベルの神経管を単離し、それぞれの神経管を個別のフィブロネクチンコーティング済みカバーガラス上で一晩培養して、神経堤細胞を遊離させることで達成されます。次に、最適な神経堤培養物が選択されます。

神経管を培養液から取り出し、培養細胞が載ったカバーガラスを改良型ジグムンドチャンバーに固定します。この際、培養組織の最も直線的な境界が、組織全体に適用する分子勾配のベクトルと平行になるように配置します。第3の手順では、培養組織に分子勾配を形成させ、あらかじめ選択した直線的な境界に沿って末梢神経堤細胞が移動する様子を撮影します。最後に、Image Jソフトウェアを用いて、選択した境界に沿って配置された末梢神経堤細胞の移動を追跡し、解析します。

最終的に、得られた細胞軌跡データの解析を通じて、選択した分子が細胞の方向性や、速度などのその他の遊走特性を変化させることができるかどうかを判断できます。Boyden chamber assayなどの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、非常に低コストであることです。この方法は、タイムラプスイメージングを用いて、一次外植片培養の周辺にある、すでに極性化した細胞の遊走を解析するために利用できます。

ニワトリの卵を38 °Cで56時間孵化させた後、インキュベーターから卵を取り出し、70% ethanolを軽くスプレーして乾燥させます。滅菌済みのプラスチック製ペトリ皿にChick ringer solutionを満たし、ガラス製のトレイをUV滅菌します。直径5 cmのガラス製ペトリ皿にdis displaysを満たします。

次に、卵を割り、UV滅菌済みのガラス製トレイに入れます。まず曲剪刀を用いて胚の血島周辺を切開し、各胚を卵黄から抽出します。その後、鈍端ピンセットで胚外膜を持ち上げ、リンゲル液を入れた準備済みのペトリ皿に胚を移します。

次に、ハンバーガーおよびハミルトンのステージ15から17の間にある胚を約9個選択します。タングステン針を用いて、第10体節より前方にある胚組織をすべて切り離し、さらに、最も新しく形成された第5体節付近から始まるすべての尾側胚組織を除去します。その後、胚外膜を胚から約2 mmの範囲まで切り詰めます。

単離した胚幹をディッシュに入れ、37 °C、5% carbon dioxide の条件下で1時間15分間インキュベートします。胚幹のインキュベーション中に、培養用のカバーガラスを6枚準備します。まず、70% ethanol ですすぎ、乾燥させます。

次に、ラボマーカーを用いて、各カバーガラスの中央に直径約1 cmの円を描きます。これは、後で同じ面にあるフィブリン結合コートを識別するためです。また、カバーガラスの上下を識別しやすくするため、描いた円の外側に非対称の単語または記号を記入します。次に、ラベルを記入した面を下にして、各カバーガラスを別々の40×10 mmの滅菌ディッシュに入れ、殺菌用UVランプの下で蓋を開けたまま10分間放置します。

次に、カバースリップの印のない表面の1 cmの円内に、フィブロネクチンを60 µL滴下し、円内の全領域がコーティングされるようにします。ディッシュを37 °Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。インキュベーション後、各カバースリップからフィブロネクチンを慎重に吸引除去します。

次に、Fibrin（フィブリン）コーティング領域に250 µLの培地を加えます。カバーガラスを回収し、神経管が単離されるまで再度カバーガラスをインキュベートします。カバーガラスのインキュベーション中に、5 cmのガラス製ペトリ皿にL 15培地を満たしておきます。

次に、インキュベーションした胚の体幹部をすべて、準備したペトリ皿に移します。微細鑷子と鋭い解剖針（トンガーおよび針）を用い、神経管と体節の境界に沿って針で慎重に切開し、神経管を切り出します。インキュベーターからカバーガラスを取り出します。

最も長く直線の形状をした神経管を6本選び、培地でプライミングしたマイクロピペットチップを用いて、6枚のカバーガラスにそれぞれ1本ずつ神経管を移します。マイクロピペットを使用して、各神経管がそれぞれのカバーガラスのフィブロネクチンコート領域内にあることを確認し、37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。次に、無血清培地を少なくとも 2 mL、滅菌済みの 15 mL 遠心チューブに入れます。

培地のpHを調整させるため、チューブを37°C、5% carbon dioxideで一晩インキュベートする際は、キャップをわずかに緩めた状態にしておきます。一晩の培養後、3つの培養物の中から、少なくとも1つの直線的な長い縁を持つ、状態の良い神経堤細胞の培養物を3つ選択します。そのうち1つを最初のチャンバーにロードするために選び、残りは後で使用するためにインキュベーターに戻します。

次に、綿棒を使用して、改造したシグモンドチャンバー1つのリザーバー周囲とブリッジ部分に、ワセリンを薄く均一に塗布します。続いて、タングステン針を用い、選択した神経堤細胞培養液を含むカバーガラスから神経管を慎重に除去し、周囲の神経堤細胞はフィブロネクチンコートに付着したままにします。神経堤細胞培養領域の最も直線的な境界の向きを記録するため、ディッシュにラボマーカーで印を付けておきます。

次に、あらかじめインキュベートした培地を数滴、改良型ジグムントチャンバーのブリッジ上に滴下します。その後、微細ピンセットでカバーガラスを拾い上げます。カバーガラスの端をキムワイプで軽く拭き取り、古い培地の大部分を除去した後、すぐにカバーガラスを改良型ジグムントチャンバーに設置します。この際、撮影対象となる神経堤細胞の直線的な境界がブリッジの長手方向の中央に位置し、かつブリッジのリザーバー境界とほぼ垂直になるように配置してください。

倒立顕微鏡を用いて、神経堤細胞の直線的な境界を、ブリッジのリザーバーに近い側へ移動させます。これにより、想定される化学走性物質を封じ込め、神経堤細胞の直線的な境界をブリッジのリザーバー境界に対してより精密に垂直に整列させることができます。次に、カバースリップを慎重に、かつ確実に、ジグムンドチャンバー上にあるワセリンに押し込み、チャンバーに完全に密閉されていることを確認します。

次に、気密性をさらに確実にするため、カバーガラスの縁に沿って追加のワセリンを塗布します。シーリング作業中のずれを修正するため、神経堤細胞境界の角度を再度調整してください。続いて、あらかじめインキュベートした培地を約300 µL、1 mLシリンジに充填します。

25ゲージ、長さ1.5インチの針を装着します。化学走化性因子を含まないリザーバーに、満杯になるまで培地を注入します。この際、リザーバー内に気泡が生じないよう注意してください。

次に、次のリザーバーを充填する前に、両側のリザーバーを十分な量のワセリンで塞ぎます。続いて、目的の化学誘引物質を含む、あらかじめインキュベートした培地300 µLを2本目のシリンジに充填します。その後、同様の方法で反対側のリザーバーに培地を注入します。

再度、リザーバーをワセリンで慎重に密閉します。撮影前に、サンプルをロードしたSigmundチャンバーを37 °Cで1時間インキュベートします。その後、約37 °Cでインキュベートしながら、対照群として神経堤細胞培養の最も直線的な境界を、92秒間隔で3時間イメージングします。同時に、先ほどと同様に、他の2つの最適な神経堤細胞培養をロードしたSigmundチャンバーも準備します。

リザーバーの充填およびブリッジのプライミングには、適切なコントロール処理を用いてください。ImageJのmanual trackingプラグインを使用して、培養領域の直線的な境界に沿った末梢神経堤細胞の遊走を追跡します。得られた遊走軌跡のさまざまなパラメータを解析するには、chemotaxis and migration toolプラグインを使用してください。

伸長した体幹神経堤細胞培養物を、神経管を一夜培養して調製し、少なくとも1つの長い直線的な境界を持つ神経堤細胞培養物を実験用に選択した。選択した培養物の最も長い直線的な境界を、ブリッジリザーバーの境界に対して垂直に、したがって今後印加される勾配のベクトルに対して平行に配置した。ここではマイナス記号で示される、想定される化学誘引物質を含まないリザーバーに先に溶液を充填し、密封した。

次に、もう一方のリザーバーにプラス記号で示される化学誘引物質（ suspected chemo attractant）を充填し、事前に選択した境界に沿って封入した末梢神経堤細胞を、Image Jのmanual trackingプラグインを用いて撮影および追跡しました。このグラフに示されるように、得られた追跡データに基づき、適用した勾配に対する数多くの遊走特性を評価できます。例えば、細胞のx軸方向の変位を総遊走距離で割ることで、化学走性指数（chemotaxis index）を算出できます。追跡したすべての細胞の誘引反応を、ここに示す細胞軌跡プロットで示しています。

各赤色の軌跡は、化学誘引剤と推定される物質が充填されたリザーバーに向かって遊走した細胞の軌跡を示しています。この図では、黒色の軌跡に比べて赤色の軌跡が大幅に多くなっています。別の試験では、改良型シグムンドチャンバーが分子濃度勾配を維持できる能力が検証されました。

Alexa Fluor 488 IGM共役体を左側のリザーバーに加え、ブリッジ全体の蛍光強度をさまざまな時間で測定しました。濃度勾配は少なくとも26時間維持されました。ビデオを視聴することで、改良型ジグムントチャンバーアッセイを用いて、摘出した体幹神経堤細胞培養における分子の化学走性誘発能およびその他の遊走挙動を分析する方法について、十分に理解できたはずです。