Name: 修正Zigmondチャンバーアッセイを使用してトランク神経冠細胞移動の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: 学ぶ 修正Zigmondチャンバーアッセイを用いてトランク神経冠細胞の移動を解析する方法。化学走性と他の移動応答を区別し、Image Jで軌跡データを分析することで、発生生物学研究に有用な低コスト手法を提供します。

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我々は、このメソッドの開発中に技術的な支援のためにリノキム、スティーヴ·グスマンとUjit Satyarthiに特別な感謝を与える。マイロン·ホーソーン、リチャードSpengel、ロベルト·ロハスは、ここで使用室を機械加工し、待望の技術支援を提供した。特筆すべきは、ロベルト·ロハスは、図4を産生した。我々はまた、上記の走化性アッセイの開発に先立っスコットフレイザーの貴重なアドバイスに感謝しています。本研究の一部はMEDBにNIHのMBRをのSCORE-5S06GM048680-13でサポートされているとCSUノースリッジ校大学院学位論文支援プログラムからCWに受賞をされました。

<ol><li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest%3A+a+long+and+still+ongoing+story%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li>
<li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaker%2C+CV+%22Neural+Crest+and+Cranial+Ectodermal+Placodes%22">Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes</a>. , 4th edn, Springer. New York. (2005).</li>
<li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).</li>
<li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+migration%3A+patterns%2C+phases+and+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).</li>
<li>Wang, H. U., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph+family+transmembrane+ligands+can+mediate+repulsive+guidance+of+trunk+neural+crest+migration+and+motor+axon+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth.</a> Neuron. 18, 383-396 (1997).</li>
<li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Eph-related+receptors+and+ligands+confer+rostrocaudal+pattern+to+trunk+neural+crest+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration.</a> Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).</li>
<li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2%2Fsemaphorin+3F+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Cambridge%2C+England%22%5BJournal%5D)">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).</li>
<li>De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+function+of+Slit2+in+repulsion+and+enhanced+migration+of+trunk%2C+but+not+vagal%2C+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells.</a> The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).</li>
<li>Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR4+controls+ventral+migration+of+sympathetic+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells.</a> J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).</li>
<li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morph%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chicken embryo.</a> J. Morph. 88, 49-52 (1951).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Davis, E. M., Trinkaus, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+cell-to+cell+contacts+for+the+directional+movement+of+neural+crest+cells+within+a+hydrated+collagen+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

トランクNCCSで走化性研究を実施することの理由のシリーズのためにやりがいがあると判明しました。トランクNCCSは、長期培養した場合と区別されます異種の幹細胞集団を構成しているので、トランクNCCSはトランクレベルのNTのプライマリ植から取得する必要があります。彼らが最初に細胞が単離され、均質に走化性チャンバー（例えば、ボイデンチャンバー12）に再播種されている必要があるため、in vitroで均一に分散した細胞集団の走化性応答を研究するための従来の方法は、トランクNCCSでテストすることは困難である。国税庁の数十の植が一つでも実験のための十分なトランクNCCSの均一な分布を作成するために必要とされるよう十分なNCCSを分離すると、退屈することができます。さらに、NCCSは、持ち上げられない混合し、均一にそれらの自然な文脈で再配布されることはない。したがって、特定の従来の走化性アッセイを行うために再播種アールNCCSは動作することがありかなり異なった回遊行動に関してのインビボ条件下から。 ここでは、より自然な文脈でトランクN...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>オメガ·サイエンティフィック</td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン溶液</td><td>オメガ·サイエンティフィック</td><td> PS-20 </td><td> 100Xストック濃度</td></tr><tr><td> L-グルタミン</td><td>オメガ·サイエンティフィック</td><td> GS-60 </td><td> 100Xストック濃度</td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>オメガ·サイエンティフィック</td><td> FB-11 </td><td>ロット＃105247（または匹敵する別） </td></tr><tr><td>変性Zigmond室</td><td>ホームメイドの</td><td> N / A </td><td>タンク容量：〜160μlのEA、詳細な仕様については、図を参照してください。 4と補足製造プロトコル</td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><tD&gt;デンヴィル</td><td> T6040 </td><td> 40×10ミリメートル</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> 10Xストックは1ミリリットルH 2 Oおよび9ミリリットルDMEM中で1mgのFNを希釈することにより、整形処理</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャー</td><td> 12から548-B </td><td>予備洗浄し、22×22ミリメートル</td></tr><tr><td> L15培地</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td>ワセリン</td><td>快適さ</td><td> 011110794642 </td><td> 100パーセント</td></tr><tr><td>遠心分離管</td><td> Biologix </td><td> 10から9152 </td><td> 15ミリリットル</td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>電池システム</td><td> 4Z0-850 </td><td> 10Xストック濃度</td></tr><tr><td>注射器</td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 1ミリリットル</td></tr><tr><td>針</td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G X 1.5インチ</td></tr><tr><td>のAlexa Fluor 488-IgMの</td><td>私nvitrogen </td><td> A21042 </td><td>株式は2 mg / mlである。7モル染料/モルのIgM </td></tr><tr><td>解剖用ピンセット</td><td> FST </td><td>その他。 </td><td>デュモン＃5または55;ストレート先端、ステンレス鋼やチタン</td></tr><tr><td>タングステン針</td><td> N / A </td><td> N / A </td><td>自家製、ピンホルダーに配置</td></tr><tr><td>ブラント鉗子</td><td>ティーマン</td><td> 160から18 </td><td>卵黄からリンゲル液に胚を転送するために使用</td></tr></tbody></table>補足議定書：修正Zigmondチャンバーの作製下記のプロトコルのための基準として、図4を参照してください： <ol><li> 3月16日 &quot;厚磨かれたアクリル（4.45ミリメートル実際の厚さ）のシートを購入します。 </li><li>テーブルソーを使用して、33.25ミリメートルX 64.57ミリメートルの大まかな寸法に特大のチャンバーのブランクを切った。これは、加工用の3.175ミリメートル余分な材料が可能になります。 </li><li> VIのチャンバーを空白にして設定するSE。 30.07ミリメートルX 61.39ミリメートル：フライス盤と6.35ミリメートル（1/4 &quot;）エンドミルビット、仕上げ加工、それらの正確な寸法にチャンバーの側面を持つ。 </li><li>フライス盤でチャンバーのブランクを置き、エッジファインダを使って、x軸とy軸の両方に沿ってブランクの中心を見つけ、中心位置がゼロ。 </li><li>上面にエンドミルビットに触れることによりチャンバーの高さ（Z軸）を取得し、高さをゼロにします。 </li><li> 3.91ミリメートル（0.154 &quot;）エンドミルビットを使用して、最初の貯水池のx軸（正方向）に沿ってビット3.03ミリメートルをオフセットします。y軸に沿って移動しながら（2.84ミリメ​​ートルの深さまでチャンバー内に機械加工を開始7.62ミリメートル（0.300 &quot;）、そして7.62ミリメートル（0.300にトラバース&quot; 15.24ミリメートル（0.600 &quot;）の完全な貯水池長に反対（負）の方向）に正の方向）。 x軸（負の方向）に沿って3.03ミリメートル（0.119 &quot;）ビットをオフセットと第二貯水池の同じプロセスを繰り返します。 </li><li>その縁でチャンバーを置き·実験中に培地をロードするためのチャンバの側面に貯水池の端を接続する各リザーバー（計4個）の端に1.09ミリメートル（0.043インチ）のドリルビットを使って穴を開けます。 </li><li>任意の化学汚染物質を除去するために暖かい石鹸水でよくチャンバーを浸す。 </li><li>どんな石鹸を除去するために蒸留水でよくチャンバーを浸して洗ってください。チャンバーは現在上記のように使用する準備が整いました。 </li></ol>

修正zigmondチャンバーアッセイを使用してトランク神経冠細胞移動の解析

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

神経堤細胞は（NCCS）上皮間葉移行1,2を経て神経管背側（NT）から移住している脊椎動物の発生中に存在する細胞の一時的な集団である。彼らは目標に到達するまで、EMTに続いて、NCCSは常の経路に沿って長い距離を移行します。 NCCSは、ニューロン、グリア細胞、メラノサイト、および1-3クロマフィン細胞を含む細胞型の広大な配列に分化する。それらの適切なターゲットの場所に到達し、認識するNCCSの能力はトランク部品3 NCC由来を含むすべての構造の適切な形成のための基礎的です。トランクNCCの移行のための指導のメカニズムを解明すること、したがって非常に重要な問題となっています。多数の分子がNCCの移行4を導くことが実証されている。たとえば、トランクNCCSは、セマフォリン、エフリン、スリットリガンド5月8日のような負の指導の手がかりではじかれることが知られている。ただし、いない最近までトランクNCCS任意の化学誘引物質は、9同定されている。 付着細胞の走化性行動の研究にvitroアプローチで、従来は不死化、均一に分布細胞で最適に動作しますが、最初は均一な分布を欠いており、急速に分化する（例えばNCCSなど）特定の主要な幹細胞培養物に適用することがより困難である。走化性研究のためにトランクNCCSの分布を均一化する一つのアプローチは、持ち上げると、それらはほぼ100％コンフルエントになるようにreplate次に、プライマリNTの外植培養からトランクNCCSを単離することである。しかし、このメッキのアプローチは、時間と労力のかなりの量が十分な細胞を植する必要が過酷であり、 インビボ条件下で見つかっに異なる方法でトランクNCCSを配布しています。 ここでは、requirinずにトランクNCCSの走化性および他の渡り鳥の応答を評価することがin vitroでのアプローチを報告GA均質な細胞分布。この手法は、修正Zigmondチャンバー（標準Zigmond室は別の場所で10記述されています）内部トランクNCCS乱れのない、原発のタイムラプスイメージングを利用しています。彼らの自然な方向性予測に垂直であるchemotactantグラデーションに文化の周縁部にトランクNCCSを公開することにより、適用されたchemotactant勾配によって誘起される渡り鳥極性の変化を検出することができる。この手法は、レプリケート処理あたり2つだけのNT外植片の培養を必要とする過酷な細胞リフティングを（例えばトリプシン処理など）を回避し、植と実験の間の時間が削減され、in vivo条件下でより同様の分布にトランクNCCSを残し、安価である（おそらく差別のリスクを軽減している）、および多数の渡り鳥の特性の経時的評価を可能にします。

植された細胞（幹神経堤細胞）の移行を解析するアプローチが説明されています。この方法は、安価な優しい、そのような主要なトランク神経堤細胞培養内細胞間相互作用に由来するもののような渡り鳥の極性にケモキネシスと他の影響の両方からの走化性を区別することができる。

修正Zigmondチャンバーアッセイを使用してトランク神経冠細胞移動の解析

神経堤細胞（NCC）は、脊椎動物の発生過程に現れる一過性の細胞集団であり、……の後に背側の神経管（NT）から遊走します。

本手順の全体的な目的は、摘出された体幹神経堤細胞において、ある分子が化学走性とその他の遊走反応を誘発する能力を評価することです。これはまず、長さがおよそ8から15ソマイトの間である体幹レベルの神経管を単離し、それぞれの神経管を個別のフィブロネクチンコーティング済みカバーガラス上で一晩培養して、神経堤細胞を遊離させることで達成されます。次に、最適な神経堤培養物が選択されます。神経管を培養液から取り出し、培養細胞が載ったカバーガラスを改良型ジグムンドチャンバーに固定します。この際、培養組織の最も直線的な境界が、組織全体に適用する分子勾配のベクトルと平行になるように配置します。第3の手順では、培養組織に分子勾配を形成させ、あらかじめ選択した直線的な境界に沿って末梢神経堤細胞が移動する様子を撮影します。最後に、Image Jソフトウェアを用いて、選択した境界に沿って配置された末梢神経堤細胞の移動を追跡し、解析します。最終的に、得られた細胞軌跡データの解析を通じて、選択した分子が細胞の方向性や、速度などのその他の遊走特性を変化させることができるかどうかを判断できます。Boyden chamber assayなどの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、非常に低コストであることです。この方法は、タイムラプスイメージングを用いて、一次外植片培養の周辺にある、すでに極性化した細胞の遊走を解析するために利用できます。ニワトリの卵を38 °Cで56時間孵化させた後、インキュベーターから卵を取り出し、70% ethanolを軽くスプレーして乾燥させます。滅菌済みのプラスチック製ペトリ皿にChick ringer solutionを満たし、ガラス製のトレイをUV滅菌します。直径5 cmのガラス製ペトリ皿にdis displaysを満たします。次に、卵を割り、UV滅菌済みのガラス製トレイに入れます。まず曲剪刀を用いて胚の血島周辺を切開し、各胚を卵黄から抽出します。その後、鈍端ピンセットで胚外膜を持ち上げ、リンゲル液を入れた準備済みのペトリ皿に胚を移します。次に、ハンバーガーおよびハミルトンのステージ15から17の間にある胚を約9個選択します。タングステン針を用いて、第10体節より前方にある胚組織をすべて切り離し、さらに、最も新しく形成された第5体節付近から始まるすべての尾側胚組織を除去します。その後、胚外膜を胚から約2 mmの範囲まで切り詰めます。単離した胚幹をディッシュに入れ、37 °C、5% carbon dioxide の条件下で1時間15分間インキュベートします。胚幹のインキュベーション中に、培養用のカバーガラスを6枚準備します。まず、70% ethanol ですすぎ、乾燥させます。次に、ラボマーカーを用いて、各カバーガラスの中央に直径約1 cmの円を描きます。これは、後で同

analysis-trunk-neural-crest-cell-migration-using-modified-zigmond

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の生体内で個々の神経細胞や神経堤細胞のイメージングを説明します。このメソッドは、蛍光共焦点タイムラプス顕微鏡を使用して細胞の行動とアクチンの局在を調べるために使用されます。...

細胞運動やゼブラフィッシュ胚における個々の神経細胞と神経堤細胞のアクチン細胞骨格のライブイメージング

クロス種の移植による神経堤の移行および分化の解析

このプロトコルでは、走電性の間に神経前駆細胞の転座に由来する成体脳のタイムラプスイメージングを可能にするために直流電界を印加することを許可するカスタムチャンバーを構築する方法を示します。...

外部から印加された直流電界における神経前駆細胞の移行動態の解析のための走電性アッセイ

頭蓋間充織は、おそらく神経ヒダの上昇のための駆動力を提供する劇的な形態形成運動を起こす...

頭蓋間葉の細胞挙動を評価するための外植片アッセイ

細胞移植、細胞骨格標識、機能喪失/獲得アプローチを組み合わせて、このプロトコルは、移動するゼブラフィッシュの有望な脊索前板を使用して、in vivo細胞移動における候補遺伝子の機能を分析する方法を説明しています。...

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

このプロトコルはまた、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を決定するために使用される化学誘引物質に応答した細胞遊走を測定するためのカスタマイズ可能な方法を詳述します。...

細胞移動を測定するためのカスタマイズ可能な商工会議所

長い波長多光子蛍光励起顕微鏡レーザーの高度な光学技術の組み合わせは、Tg (sox10:EGFP) および Tg (foxd3:GFP)...

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

このプロトコルは、主に細胞移動の研究のために、マウスモデルからの頭蓋神経堤細胞の解剖および培養について説明する。使用されるライブイメージング技術と速度と細胞形状の変化の解析について述べた。...

神経クレスト細胞の形成と移動の研究のためのマウスからの原発性頭蓋神経クレスト細胞の解剖、培養および分析

この汎用性の高いプロトコルは、ニワトリ胚からの脳神経襞の切除による遊走性神経堤細胞(NCC)の単離について説明しています。プレーティングとインキュベーションを行うと、遊走性NCCが神経襞の外植片から出現し、単純化された2D環境での細胞形態と遊走の評価を可能にします。...

ニワトリ頭蓋神経堤細胞培養物の作製と形態解析

このプロトコルは、神経堤細胞のヒアルロナンに富む細胞外マトリックスへのin vivo移動に関与する分子の機能解析に適したin...

インビトロ ヒアルロン酸に富む細胞外マトリックスが神経堤細胞遊走に及ぼす影響の検討

学ぶ 修正Zigmondチャンバーアッセイを用いてトランク神経冠細胞の移動を解析する方法。化学走性と他の移動応答を区別し、Image Jで軌跡データを分析することで、発生生物学研究に有用な低コスト手法を提供します。

修正Zigmondチャンバーアッセイを使用してトランク神経冠細胞移動の解析

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