Name: 低コストの染料を使用して、線虫のグリコーゲン蓄積と腸の完全性を視覚化する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学ぼう、Caenorhabditis elegansを用いた低コストのグリコーゲン染色法と腸透過性アッセイ。ヨウ素溶液と青色染料で代謝と老化過程を視覚化し、教育現場で実験生物学を体験できます。

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注: 大腸菌 OP50(E.coliOP50 )細菌およびブリストルN2野生型株は、米国ミネソタ大学のCGCから、または C.エレガンス 研究所からの寄付から入手できます。研究者の安全のためには、個人用保護具の使用が不可欠です。次亜塩素酸塩や水酸化ナトリウムなどの試薬の濃度は低いですが、これらの化学物質に関連する潜在的なリスクを最小限に抑えるために、原稿で強調されているように、推奨されるPPEを着用することが不可欠です。
1.グリコーゲン含有量
<ol><li>テストプレートの準備<ol><li>線虫株ごとに60 mm x 15 mmのNGM寒天プレート20( 補足表1に記載の線虫増殖培地寒天培地10 mL、NGM)を6枚調製し、室温で1日間乾燥させます。汚染を防ぐためにプレートを閉じたままにしてください。</li>
		<li>プレートあたり200 μLの 大腸菌 OP50液体培養液(光学濃度=0.600、波長約600 nm)を加えて、フローフード内の菌株あたり合計4枚のNGMプレートを接種します。閉じたプレートを37°Cで1日間インキュベートしてから使用してください。 注:6つのプレート(ステップ1.1)を準備しますが、 大腸菌 OP50細菌は4つだけに接種します。残りの2つのプレートは、後でワームを飢餓状態に置くときに使用するために4°Cで予約します。この分析は重複して実行できます。</li>
		<li>試験日には、以前に 大腸菌 OP50細菌を播種した菌株ごとに2つの(6 mm x 15 mm)NGM寒天プレートに200 μLの0.025 M D-Glucoseを加えます。プレートをフローフード内で室温で乾燥させます。 注: 大腸菌 OP50細菌を播種したNGM寒天プレートは、フローフードを使用する代わりに、アルコールランプの近くで乾燥させることもできます。</li>
	</ol></li>
	<li>同期<ol><li>同期の約3日前に、 C. elegans Bristol N2(野生型)をさまざまな段階(チャンクあたり約500匹)で培養したメンテナンスNGM寒天培地から3〜4チャンク(3 cm x 3cm)を、以前に 大腸菌 OP50細菌を播種した新しいプレート(150 mm x 90 mm)に移します。</li>
		<li>新しいプレートをワームと一緒に20°Cの制御された環境に置き、湿度&gt;95%を3日間維持します(72時間でほとんどのワームが妊娠した成虫の段階に達するまで待ちます)。 注:成長温度は、使用されている C.エレガンス 株(複数可)に応じて調整する必要がある場合があります。</li>
		<li>パスツールピペットを使用して、蒸留H2Oで調製したプレートから線虫を回収し、50 mLの遠心チューブに移します。</li>
		<li>重力によるワームの沈降を待ち(約15分)、上清を取り除きます。このプロセスを3回繰り返して、バクテリアを排除します。最後の洗浄後、容量を5mLに減らします。</li>
		<li>漂白液 10mL(別表1)を加え、手で約6分間激しく振る。</li>
		<li>振とうが完了した直後に、M9バッファーをチューブの容量50mLまで満たします。</li>
		<li>1400 x g で3分間遠心分離し、上清を5 mLまで除去し、45 mLのM9バッファーを再度加えます。このプロセスを4回繰り返します。</li>
		<li>最後の洗浄後、容量を15 mLに減らし、制御された温度(20 °C)と湿度(&gt;95%)で約14時間維持します。 注:同期プロセスは、産卵を通じて卵子を得ることによって置き換えることができます:約20匹の成虫の妊娠虫を、以前に200μLの 大腸菌 OP50を播種したNGMプレート(6 mm x 15 mm)に移します。ワームが1日間卵を産むのを待ちます。その後、妊娠中のワームを取り除き、卵が孵化するのを待ちます。</li>
	</ol></li>
	<li>ワームの準備<ol><li>自動ピペットを使用して、10 μLの同期ワーム(ステップ1.2.8)を顕微鏡スライドに加え、ワームの数をカウントします。500-1000 worms/μLを得るためにピペッティングする必要がある容量を計算します。</li>
		<li>500-1000 L1同期線虫(ステップ1.2.8)を、大腸菌OP50細菌を食物源として播種したNGM寒天プレート(150 mm x 90 mm、補足表1)に移し、20°Cで幼虫ステージ4(L4)に到達するまで移します。 注:ワームは自動ピペットを使用して移すことができます。自動ピペットが利用できない場合は、ガラス製パスツールピペットを使用し、マイクロチューブラベルまたはガラス目盛りピペットを使用して容量を制御できます。</li>
		<li>同期20の48時間後:プラスチック製のパスツールピペットを使用して、M9バッファー(補足表1)を含むプレートからL4幼虫を回収し、プラスチック製のパスツールピペットを使用して清潔な円錐管50 mLにし、新鮮なM9バッファーで3回洗浄するか、残りのすべての 大腸菌 OP50細菌が完全に除去されるまで洗浄を繰り返します(室温)。 注意: 一部のワームは手順中に飢餓を経験するため、洗浄ステップは重要です。</li>
	</ol></li>
	<li>アッセイの実行<ol><li>500-1000 L4 ワーム(ステップ 1.3.1)を、以前に調製した新しい NGM 寒天プレート(60 mm x 15 mm)のそれぞれから移します(ステップ 1.1.2 および 1.1.3)。試験日まで20°Cで48時間保管します。このスケジュールにより、次のような3つの実験グループが重複して作成されます(図1)。 A-(飢餓):ワームは 、大腸菌 OP50細菌を含まない通常のNGM寒天プレートで増殖します。 B-(レギュラー):ワームは 、大腸菌 OP50バクテリアを播種した通常のNGM寒天プレートで増殖します。 C-(高グルコース):大 腸菌 OP50細菌を播種し、0.025 M D-グルコースを含むNGM寒天プレート上でワームが増殖します。</li>
		<li>テスト当日(48時間後):ワームを収集し、M9バッファーで3回短時間洗浄します(ステップ1.2.2および1.2.3) 注:ここでは、D-グルコースを添加したNGM寒天プレートを調製し(ステップ1.3)、ワームを追加するまで脇に置いておきます。<ol><li>ヨウ素染色:新鮮なM9バッファーを使用して、5%(v / v)ルゴールのヨウ素溶液(ヨウ素/ヨウ化カリウム溶液)を調製します。 注:ルゴールのヨウ素溶液は、地元の試薬供給業者または薬局から入手できるため、初期濃度は異なる場合があります。必要に応じて、5%(v / v)の溶液が得られるように計算します。</li>
		</ol></li>
		<li>各グループから約100 μLの洗浄済み線虫(ステップ4.2)を、希釈したルゴール溶液(5% v / v)を含む1.5 mLマイクロチューブに移します。自動ピペットを1:5の割合で100μLのワームを400μLのルゴール溶液に移し、続いてミキサーで5分間穏やかに攪拌します。 注意: ミキサーが利用できない場合は、手でマイクロチューブを慎重に振ることができます。</li>
		<li>この5分間の直後に、1.5 mLマイクロチューブ(線虫+ルゴール溶液)を1400 x g で3分間遠心分離します。 注:このアッセイをL4ステージ以降の線虫に対して実施すると、遠心分離機を使用する代わりに重力沈降を達成することができます。すべてのワームがマイクロチューブの底に落ち着くまで、マイクロチューブをベンチトップのラックに10分間開いたままにします。</li>
		<li>上清を取り除き、1.0 mLの新鮮なM9バッファーで線虫を洗います。残りのヨウ素がすべて溶液から除去されるまで(最低3回)、洗浄を繰り返します。</li>
		<li>最後の洗浄ステップの後、約100μLの残留物を除いて上清を取り除きます。これを使用して、ワームを穏やかに再懸濁し、顕微鏡分析を行います。</li>
		<li>再懸濁したワーム溶液約50μLを顕微鏡スライドに移し、カバースリップで覆います。実体顕微鏡(1.5倍)で明視野像を観察します。 注意: 実体顕微鏡が利用できない場合は、通常の顕微鏡を使用でき、アダプターを使用して携帯電話のカメラ(3.4倍)で画像をキャプチャできます。光/明るさ/露出によるエラーを防ぐためには、すべての写真ですべての携帯電話のカメラ設定を一貫していることが重要です。</li>
	</ol></li>
	<li>データ検査<ol><li>定量データ:線虫のヨウ素染色に基づいてグリコーゲン含有量を計算します。<ol><li>グループごとに最低10匹の線虫を含む実体顕微鏡からの画像を.jpegファイルとして保存し、さらに処理することができます。これを行うには、無料のImageJソフトウェアをダウンロードしてください。詳細は、 補足ファイル1、補足図1、補足図2に記載されています。</li>
			<li>ImageJソフトウェア(https://imagej.nih.gov/ij/download.html から無料でダウンロード可能)を使用して.jpegイメージを開きます。[セグメント化された線 ] をクリックし、ワームの輪郭を描きます (一度に 1 つのワーム)。 「Analyze」をクリックし、「 Measure 」を選択して染色の定量化を行います。データはテーブルに平均として表示されます。平均は、寄生虫面積あたりの染色密度から計算されたデータを示します。</li>
		</ol></li>
		<li>定性的データ:各グループの実体顕微鏡から画像を取得し、線虫の染色を視覚的に比較します。必要に応じて、染色を分析するためのスコアリングシステムを作成します:0無色;1つは軽く汚れています。2人は汚れており、3人はひどく汚れています。実体顕微鏡を使用して、ハンドカウンターでグループあたり約10匹(最小)の線虫を手動で数えます。</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig01.jpg"> 図1: C.エレガンスにおける全体的なグリコーゲン含量アッセイの概略図。 グリコーゲン含量アッセイを実施するためにここで行う実験の概略図です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
2. 腸管透過性の評価
<ol><li>ワームの準備<ol><li>同期(ステップ1.2.8)の約14時間後、最初の幼虫期(L1)の500〜1000匹の線虫(ステップ1.3.1および注)を、事前に準備した新しいNGM寒天プレート(60 mm x 15 mm)に移し、試験日まで20°Cに保ちます。このスケジュールにより、次のような2つの実験グループが作成されます(図2)。 A-(若い):ワームは、細菌 大腸菌 OP50を播種したNGM寒天プレート上で、幼虫期4(L4)まで成長します。 B-(旧):寄生虫は、成虫の7日目まで、細菌大腸菌OP50を播種したNGM寒天プレートで増殖します。 注:成体7日目まで 維持された線虫は、毎日M9バッファーで洗浄し、以前に食品の補充と子孫の除去のために播種した200μLの 大腸菌 OP50細菌を含む新しいNGM寒天プレート(60 mm x 15mm)に移す必要があります。若い線虫はデカンテーション中に浮遊し、上清を取り除くことで分離できます。スマーフワームの割合は年齢とともに増加します。ただし、腸透過性の評価は、研究の目的に応じて、どの段階や年齢でも行うことができます。</li>
	</ol></li>
	<li>アッセイの実行<ol><li>試験日には、L4線虫(ステップ2.1.1の2日後)と7日目 (現在は9日目 )に成虫をM9バッファー(補足表1)で収集し、標識1.5mLマイクロチューブに移します。</li>
		<li>1400 x g で3分間遠心分離し、上清を取り除き、M9 1.0 mLを加えて穏やかに混合します。このプロセスを3回繰り返して、バクテリアを取り除きます。最後の洗浄後、容量を500μLに減らします。</li>
		<li>自動ピペットを使用して、10 μLのワーム沈殿物を顕微鏡スライドに加え、ワームの数をカウントします。ピペッティングする容量を計算して、100 worms/μLを取得します。</li>
		<li>スマーフ染色:蒸留水を使用して25%エリオグラウシン二ナトリウム塩(補足表1)溶液を調製します。必要に応じて、渦を使用して可溶化を改善します。</li>
		<li>これまでに同定した新しいマイクロチューブに、自動ピペットを使用して、100匹の線虫、100 μLの25%エリオグラウシン二ナトリウム塩溶液、200 μLの 大腸菌 OP50、M9バッファーを添加して最終容量500 μLにします。 注:エリオグラウシン二ナトリウム、 大腸菌 、およびワームの数の量は固定されています。M9バッファーの容量は可変であり、最終容量を500μLにするために使用できます。</li>
		<li>光から保護されたミキサーで攪拌しながら、室温で3時間インキュベートします。 注意: ミキサーが利用できない場合は、15分ごとに手でマイクロチューブを慎重に振ってください。</li>
		<li>3時間後、1.5 mLマイクロチューブを1400 x g で3分間遠心分離し、上清1.0 mLを除去し、線虫をM9バッファー1.0 mLで洗浄します。</li>
		<li>残りのエリオグラウシン二ナトリウム塩溶液が溶液から除去されるまで、洗浄を繰り返します。.最後の洗浄ステップの後、約250 μLの残留物を除いて上清を取り除き、これを使用してワームを慎重に再懸濁し、顕微鏡分析のために処理します。</li>
		<li>約50個のワームを再懸濁したウォーム溶液を顕微鏡スライドに移し、カバースリップで覆います。顕微鏡スライドを-20°Cの冷蔵庫で10分間インキュベートし、線虫を麻痺させます。 注:ワームを麻痺させる別の方法は、10μLの塩酸レバミゾール溶液(10 mM ; 補足表1)そして、カバースリップでそれらを覆います。</li>
		<li>実体顕微鏡(1.5倍)の明視野を使用して、ワームの総数と完全に染色されたワームを観察してカウントします。画像は、アダプターと組み合わせた携帯電話のカメラ(3.4倍)から取得できます。光/明るさ/露出によるエラーを防ぐためには、すべての写真ですべての携帯電話のカメラ設定を一貫していることが重要です。</li>
	</ol></li>
	<li>データ検査<ol><li>定性的データ:各グループ(成人期のL4および7日目) の実体顕微鏡から画像を取得し、線虫の染色を視覚的に比較します。</li>
		<li>実体顕微鏡を使用して、ワームの総数とスマーフワーム(青いワーム)の数を数えます。</li>
		<li>結果をスマーフワームの割合として表し、若いワーム(対照群としてのL4)と古いワーム(成人期の7日目) を比較します。 A x X = 100 (%) x B X = 100 x B / A ここで、A = ワームの総数 B= スマーフワームの数</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig02.jpg"> 図2: C.エレガンスにおける腸管透過性アッセイ全体の概略図。 (A) C.エレガンス の準備。(B)エリオグラウシン二ナトリウム塩による染色。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<meta charset="utf8"></head><body>線虫Caenorhabditis elegansの代謝と老化パターンの評価

<ol><li>Thorp, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChatGPT+is+fun%2C+but+not+an+author%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ChatGPT is fun, but not an author.</a> Science. 379 (6630), 313(2023).</li>
<li>Lemons, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inquiry-based+approach+to+study+the+synapse%3A+Student-driven+experiments+using+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+J+Undergrad+Neurosci+Educ%22%5BJournal%5D)">An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C.</a> elegans. J Undergrad Neurosci Educ. 15 (1), A44-A55 (2016).</li>
<li>Andersen, J., Krichevsky, A., Leheste, J. R., Moloney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+an+undergraduate+educational+tool+for+teaching+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as an undergraduate educational tool for teaching RNAi.</a> Biochem Mol Biol Educ. 36 (6), 417-427 (2008).</li>
<li>Martins, R. R., McCracken, A. W., Simons, M. J. P., Henriques, C. M., Rera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+catch+a+smurf%3F+-+Ageing+and+beyond...+In+vivo+assessment+of+intestinal+permeability+in+multiple+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">How to catch a smurf? - Ageing and beyond... In vivo assessment of intestinal permeability in multiple model organisms.</a> Bio Protoc. 8 (3), e2722(2018).</li>
<li>Ellingwood, S. S., Cheng, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+clinical+aspects+of+glycogen+storage+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and clinical aspects of glycogen storage diseases.</a> J Endocrinol. 238 (3), R131-R141 (2018).</li>
<li>Cori, C. F., Cori, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+formation+in+the+liver+from+d-and+l-lactic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Glycogen formation in the liver from d-and l-lactic acid.</a> J Bio Chem. 81 (2), 389-403 (1929).</li>
<li>Wosilait, W. D., Sutherland, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+epinephrine+and+glucagon+to+liver+phosphorylase.+II.+Enzymatic+inactivation+of+liver+phosphorylase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The relationship of epinephrine and glucagon to liver phosphorylase. II. Enzymatic inactivation of liver phosphorylase.</a> J Biol Chem. 218 (1), 469-481 (1956).</li>
<li>Zhang, H., Ma, J., Tang, K., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+energy+storage%3A+roles+of+glycogen+metabolism+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Beyond energy storage: roles of glycogen metabolism in health and disease.</a> FEBS J. 288 (12), 3772-3783 (2021).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glycogen+molecular+structure+in+the+worm+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">Characterization of glycogen molecular structure in the worm Caenorhabditis elegans.</a> Carbohydr Polym. 237, 116181(2020).</li>
<li>Cherkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+molecular+mapping+and+assessment+of+glycogen+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.Analyst%22%5BJournal%5D)">Label-free molecular mapping and assessment of glycogen in C.</a> elegans.Analyst. 144 (7), 2367-2374 (2019).</li>
<li>Gusarov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+controls+Caenorhabditis+elegans+lifespan+and+resistance+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Glycogen controls Caenorhabditis elegans lifespan and resistance to oxidative stress.</a> Nat Commun. 8, 15868(2017).</li>
<li>Seo, Y., Kingsley, S., Walker, G., Mondoux, M. A., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+shift+from+glycogen+to+trehalose+promotes+lifespan+and+healthspan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Metabolic shift from glycogen to trehalose promotes lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (12), E2791-E2800 (2018).</li>
<li>Frazier, H. N. 3rd, Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+sugar+provisioning+controls+survival+of+C.+elegans+embryos+in+adverse+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptive sugar provisioning controls survival of C. elegans embryos in adverse environments.</a> Curr Biol. 19 (10), 859-863 (2009).</li>
<li>da Silva, F. N., Zimath, P. L., do Amaral, T. A., Martins, J. R. N., Rafacho, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coadministration+of+olanzapine+causes+minor+impacts+on+the+diabetogenic+outcomes+induced+by+dexamethasone+treatment+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Coadministration of olanzapine causes minor impacts on the diabetogenic outcomes induced by dexamethasone treatment in rats.</a> Life Sci. 322, 121660(2023).</li>
<li>Gusarov, I., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+at+the+crossroad+of+stress+resistance%2C+energy+maintenance%2C+and+pathophysiology+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Glycogen at the crossroad of stress resistance, energy maintenance, and pathophysiology of aging.</a> Bioessays. 40 (9), e1800033(2018).</li>
<li>Untersmayr, E., Brandt, A., Koidl, L., Bergheim, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+barrier+dysfunction+as+driving+factor+of+inflammaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The intestinal barrier dysfunction as driving factor of inflammaging.</a> Nutrients. 14 (5), 949(2022).</li>
<li>Lin, P. Y., Stern, A., Peng, H. H., Chen, J. H., Yang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+and+metabolic+regulation+of+intestinal+barrier+function+and+associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Redox and metabolic regulation of intestinal barrier function and associated disorders.</a> Int J Mol Sci. 23 (22), 14463(2022).</li>
<li>Dambroise, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+phases+of+aging+separated+by+the+Smurf+transition+as+a+public+path+to+death%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Two phases of aging separated by the Smurf transition as a public path to death.</a> Sci Rep. 6, 23523(2016).</li>
<li>Laranjeiro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swim+exercise+in+Caenorhabditis+elegans+extends+neuromuscular+and+gut+healthspan%2C+enhances+learning+ability%2C+and+protects+against+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Swim exercise in Caenorhabditis elegans extends neuromuscular and gut healthspan, enhances learning ability, and protects against neurodegeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (47), 23829-23839 (2019).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C.</a> elegans.WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>McGhee, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">The C. elegans intestine.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2007).</li>
<li>McGee, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+intestinal+nuclei+and+intestinal+integrity+in+aging+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of intestinal nuclei and intestinal integrity in aging C.</a> elegans. Aging Cell. 10 (4), 699-710 (2011).</li>
<li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS genetics. 12 (7), e1006135(2016).</li>
<li>Rera, M., Clark, R. I., Walker, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+links+metabolic+and+inflammatory+markers+of+aging+to+death+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction links metabolic and inflammatory markers of aging to death in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (52), 21528-21533 (2012).</li>
<li>Zhang, G., Gu, Y., Dai, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+bilberry+anthocyanin+extracts+on+dextran+sulfate+sodium-induced+intestinal+damage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Protective effect of bilberry anthocyanin extracts on dextran sulfate sodium-induced intestinal damage in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 14 (14), 2875(2022).</li>
<li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genet. 12 (7), e1006135(2016).</li>
<li>Qu, M., Xu, K., Li, Y., Wong, G., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+acs-22+mutant+Caenorhabditis+elegans+to+detect+the+toxicity+of+nanopolystyrene+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Using acs-22 mutant Caenorhabditis elegans to detect the toxicity of nanopolystyrene particles.</a> Sci Total Environ. 643, 119-126 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mLマイクロチューブ&nbsp;</td><td>地元の</td><td>サプライヤー-37</td><td></td></tr><tr><td>度インキュベータ</td><td>ーKS4000i&nbsp;</td><td>97014-816</td><td></td></tr><tr><td>50 mLコニカルチューブ</td><td>地元の</td><td>サプライヤー-6</td><td></td></tr> <tr><td>cmペトリプレート&nbsp;</td><td>地元のサプライヤー</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>寒天菌学</td><td>Din&acirc;マイカQu&iacute;マイカコンテンポラリー&acirc;ネア株式会社。</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans Bristol N2 (野生型)</td><td>Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>CaCL2</td><td>Din&acirc;マイカQu&iacute;マイカコンテンポラリー&acirc;ネア株式会社。</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース無水&nbsp;</td><td>ネオン</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>蒸留H2O</td><td>地元の</td><td></td>サプライヤー-Erioglaucine<td></td></tr><tr><td>二ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>3844-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coliOP50</td><td>Caenorhabditis elegans Genetic Center(CGC、ミネソタ州、米国)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>フローフード</td><td>Mylabor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>北米のパナソニックヘルスケア会社、MIR-254-PA。</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>ディン&acirc;マイカQu&iacute;マイカコンテンポラリー&acirc;ネア株式会社。</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>塩酸レバミゾール</td><td>RIPERCOL L 150F</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ルゴール溶液</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>L6146</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Synth</td><td>S1063-01-AH</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>遠心分離機 5425R Eppendorf SE, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Din&acirc;マイカQu&iacute;マイカコンテンポラリー&acirc;ネア株式会社。</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ディン&acirc;マイカQu&iacute;マイカコンテンポラリー&acirc;ネア株式会社。</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>N6261</td><td></td></tr><tr><td>ペプトン細菌学</td><td>&ecirc;xodo cient&iacute;fica</td><td>91079-38-8</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Leica S8 Apo 実体顕微鏡 (S&atilde;oパウロ、ブラジル)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン硫酸エス</td><td>トレプトマックス</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

低コストの染料を使用して、線虫のグリコーゲン蓄積と腸の完全性を視覚化する

Using Low-Cost Dyes to Visualize Glycogen Accumulation and Gut Integrity in Caenorhabditis elegans

グリコーゲン含有量アッセイは、グリコーゲンの合成または分解に影響を与える可能性のあるさまざまな菌株の比較研究など、さまざまな試験条件をスクリーニングするための堅牢で迅速な方法を提供します。この研究では、L4線虫を空腹時、摂食、グルコース強化グループの3つの異なる試験条件にさらしました。アッセイは3回実施され、各条件は各アッセイで2回再現されました。代表的な画像を 図3に示します。各アッセイに続いて、ルゴールのヨウ素溶液で染色した線虫を実体顕微鏡で観察し、線虫の染色についてグループ間で定性的に比較しました。目視観察では、空腹時群(飢餓状態)の線虫は、 大腸菌 OP50を給餌した線虫(通常)や大 腸菌 OP50およびD-グルコース(高グルコース)を給餌した線虫と比較して、染色が弱かった。さらに、大腸菌OP50とD-グルコース(高グルコース)を与えられた線虫は、最も強い染色を示しました。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig03.jpg"> 図3:グリコーゲン含量アッセイの代表的な画像。C. elegansのグリコーゲンレベルは、ヨウ素染色によって評価されました。顕微鏡画像は、代表的な線虫を(A)飢餓状態、(B)規則的、または(C)高グルコース条件に48時間さらした様子を示しています。ワームは、ステップ 1.4 で詳述した手順に従って、Lugol のヨウ素/M9 バッファー (1%) の溶液に 5 分間浸漬して染色しました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
腸管透過性の結果から、腸内が無傷の幼虫(L4)と、加齢により腸管が損傷した老齢虫(成虫7日目)の染色に違いが見られます(図4)。C.エレガンスの腸は、消化と代謝に重要な役割を果たし、ストレス応答と老化調節のシグナル伝達センターとして機能するため、健康にとって中心的に重要な組織です21。若い線虫では、C.エレガンスの腸は腸内容物の漏れを防ぐ強力なバリアで構成されています。しかし、これらの線虫が老化するにつれて、腸のバリア機能は低下し、細胞や微絨毛の進行性の劣化と老化腸内の細菌の蓄積による破壊に対してより敏感になります21,22。若いC.エレガンスが染料エリオグラウシン二ナトリウム塩を摂取すると、線虫の腸が染色されます(図4A)。一方、老化した線虫は、線虫の全身に染料の血管外漏出を示し、腸膜の損傷を示していることが観察できます(図4B)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig04.jpg"> 図4: C.エレガンス をエリオグラウシン二ナトリウム塩で染色した代表的な画像。 顕微鏡画像は、腸が無傷の 線虫 (L4期)と腸が破裂した線虫(成虫7日目) を示しています。線虫は、ステップ2.2.4に続いて、25%エリオグラウシン二ナトリウム塩溶液に3時間浸漬して染色しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:C.エレガンスの輪郭を選択するためのImageJスクリーンショット。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Figure%201_RE.png" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:平均を計算するためのImageJスクリーンショット。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Figure%202_RE.png" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:培地、バッファー、および培養レシピ。 現在のプロトコルで使用されているさまざまなメディア、バッファー、カルチャの構成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1: 線虫のグリコーゲン含有量を定量化するためのImageJソフトウェアの詳細な説明。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20File%202_NEW.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a transparent, non-parasitic nematode with a simple biology, which makes it a great tool for biological sciences ...

using-low-cost-dyes-to-visualize-glycogen-accumulation-gut-integrity

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、ライブでキューティクルを可視化する手法を提案...

の可視化線虫（Caenorhabditis elegans）</em親油性生体染色色素、DIIを使用する>キューティクルの構造

ここでは、固定された無傷の線虫のゲノムDNAを視覚化するために使用される技術について説明します。このビデオには、未受精のC.エレガンス卵子のクロマチンをカウントするプロトコルの例が含まれています。...

エタノール固定とDAPI染色:C.エレガンスのDNAを可視化する方法

私たちは、勉強のための堅牢な生化学的および顕微鏡的手法を提示...

内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

骨格筋は歩行のために不可欠であり、団体「メインタンパク質店です。 C.エレガンス内の筋肉の健康の測定について説明する。筋肉の構造と機能の将来の変更は、ローカライズされたGFPおよびカチオン染料を使用して評価される。...

筋肉の細胞内コンパートメントを評価するための方法 C。エレガンス

PH に敏感な重要な染料 6 - カルボキシ - を使用して 2', 7'-ジクロルフルオレッセン アセテート (cDCFDA) のc. の elegansの腸のライソゾーム酸性度の損失をプローブするステップ バイ ステップ...

腸の生きている線虫のライソゾーム アルカリ化を評価します。

変更された小規模な抽出と乳酸と線虫のピルビン酸の比色定量法について述べる線虫。商業アッセイ...

小規模な比色試金の細胞内乳酸と線虫の線虫のピルビン酸

このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質 (GFP) の融合タンパク質マーカーとして、4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) による熱ストレス蛋白質の核移行を追跡する方法を示しますを汚します。プロトコルを汚す DAPI は速く、GFP...

緑色蛍光タンパク質タグと 4', 6-Diamidino-2-phenylindole線虫の染色によるタンパク質細胞内局在を検出

このプロトコルは固体媒体で線虫の大規模栽培の方法をについて説明します。液体培養する代わりに、このプロトコルは、栽培プレート...

線虫の大規模栽培のプレート ・ ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製

このプロトコルは、カエネラブディティスエレガンスの腸透過性を測定する方法を記述します。この方法は、腸内細菌とその宿主との相互作用に関連する腸の健康に関する基礎生物学的研究や、漏出性腸症候群および炎症性腸疾患を治癒するためのプロバイオティクスおよび化学薬品を同定するためのスクリーニングに役立ちます。...

ケネラブディティス・エレガンスの腸透過性に及ぼす細菌および化学物質の影響の測定

Caenorhabditisエレガンスにおける自動包接計数を用いた生体内のタンパク質凝集動態のモニタリング

学ぼう、Caenorhabditis elegansを用いた低コストのグリコーゲン染色法と腸透過性アッセイ。ヨウ素溶液と青色染料で代謝と老化過程を視覚化し、教育現場で実験生物学を体験できます。

低コストの染料を使用して、線虫のグリコーゲン蓄積と腸の完全性を視覚化する

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