Name: ナノ析出法を通じて、ジブロック高分子ナノ粒子の製剤 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学ぶナノ析出法によるジブロック高分子ナノ粒子の製剤技術。PLGA-PEG共重合体を合成し、難溶性抗がん薬を封入する薬物送達システムの構築方法を解説。動的光散乱や透過型電子顕微鏡による特性評価も含む。

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この作品は、がん、ナノテクノロジー優秀パイロット助成金、大学のがん研究基金と国立予防衛生研究所K - 12キャリア開発賞のためのキャロライナセンターに対するゴルファーによって賄われていた。

1。 PLGA - B - PEGポリマーの合成<ol><li>ターミナルカルボキシレート基（PLGA -カルボン酸）とポリ（D、L -ラクチド- co -グリコリド）（PLGA）を5mMの濃度で（のような材料のセクションに記載されている）PLGAのための任意の溶媒に溶解させる。 PLGAは、穏やかに攪拌しながらこの濃度で溶解させることができる。 </li><li> NHS（分子量115.09）とEDC（分子量191.7）の両方は、25mMの濃度でPLGA溶液に溶解されています。 （EDCとNHSの両方が、PLGAに比べて5倍の化学量論的過剰量で添加されています）。 PLGA -カルボキシレートは、約1時間穏やかに撹拌しながら、PLGA -カルボン酸液にEDCとNHSを追加することにより、PLGA - NHSに変換されます。 </li><li>反応生成物PLGA - NHSは、洗浄液のメタノールを添加することにより沈殿させる。メタノールの約10倍の量の過剰がソリューションに追加されます。ソリューションをPLGA - NHS外沈殿、2000 × gで遠心分離し、上清を破棄され（EDCとNHSのトレースを削除します。メタノールで洗浄のこの手順では、少なくとも3回繰り返される。 </li><li> PLGA - NHSペレットは、洗浄溶液の痕跡を除去するために30分間真空下で乾燥させる。 </li><li> PLGA - NHSペレットは現在、PLGAを溶解するために最初に使用したのと同じ濃度で同じ溶媒に再溶解している。ヘテロPEG（アミン- PEG -カルボン酸）は、その後、5mMの濃度のPLGA溶液に添加される（1:1の化学量論比）。混合溶液を絶えず撹拌しながら24時間インキュベートされる。 </li><li> 24時間後、反応生成物PLGA - B - PEGブロック共重合体は、過剰の洗浄液のメタノールを添加することにより沈殿させる。三回上記のように洗浄し、遠心分離処理を繰り返します。これは、すべての過剰な未反応のPEGを削除します。 </li><li> PLGA - B - PEGブロック共重合体は、真空下で乾燥させる。 </li></ol> 2。 PLGA - B - PEGナノ粒子の調製表面にPEGで覆われたPLGAのコアを持つナノ粒子は、これらのジブロック共重合体を調製することができる。別の疎水性薬物の様々なそのようなナノ粒子に封入することができる。蛍光化合物がナノ粒子に封入することができますまたはPLGAに結合させることができるため、これらのナノ粒子は、蛍光イメージングに使用することができます。 ナノ析出法は、カプセル化するために必要な貨物は、本質的に疎水性の高い場合は特にナノ粒子を作るために使用されます。 <ol><li> PLGA - B - PEGブロック共重合体と薬/貨物は、（カプセル化する）PLGAを溶解する任意の溶媒に溶解されています。 PLGAは、アセトニトリル、DCM、テトラヒドロフラン、アセトンや酢酸エチルなど、多くの一般的な溶剤で溶解させることができる。それはナノ粒子の性質に影響を与えるとして、溶媒の選択は、重要です。したがって、適当な溶媒は、このステップで使用する必要があります。 </li><li>ポリマー/薬剤混合物を次いで、約3 mg / mLの最終的なポリマーの濃度を与える水を攪拌しながら3〜5ボリュームに滴下する。 （図2） </li><li>攪拌は、ナノ粒子が自己集合によって形成し、有機溶剤の痕跡を除去できるように、減圧下で2時間継続される。 </li><li>収穫と精製：ナノ粒子を洗浄し、アミコンフィルター（MWCO 20KDa）を使用して10分間2700 × gで遠心分離によって濃縮し、PBSに再構成されています。これは、すべての非捕捉された薬剤/貨物を削除します。このようなサイズ、表面電荷、および薬物充填効率などの基本的な生物物理学的特性評価は、より良いナノ粒子の特性を理解するために実行することができます。 </li></ol> 3。ストレージ凍結乾燥は、ナノ粒子11を格納するために一般的に使用される方法です。凍結乾燥は、長期安定性12ナノ粒子の物理的および化学的特性を保持します。凍結乾燥プロセスは、粒子へのストレスの原因と処方を不安定にすることができます、凍結保護剤（凍結​​ストレスからの保護）とlyo -保護剤を（乾燥ストレスからの保護）一般的に使用されるように。これらの保護剤の選択は、蓄積時間13の所望の長さによって決定されます。 <ol><li>凍結乾燥では、そのTg以下に凍結することにより、サンプルの総凝固があります。 </li><li>乾燥工程では、氷が昇華によって除去される。温度と圧力は、効率的な凍結乾燥のプロセスを達成するために最適化する必要があります。 </li></ol> 4。代表的な結果： PLGA - B - PEGジブロック共重合体のキャラクタリゼーションさまざまな手法は、ポリマーの成功共役を確認するために使用することができます。 PLGA - B - PEGの組成は、400 MHzの1H核磁気共鳴（NMR）を用いて特徴づけることができる。形成された生成物（PLGA - B - PEG）の分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（GPC）によって確認することができます。 PLGA - B - PEG分子量distribution個の曲線と溶出時間は、PLGAとPEG単独で異なっている必要があります。組み合わせでは、これらの技術は、形成された製品を特徴づけ、抱合反応が成功したかどうかを判断する必要があります。 PLGA - B - PEGナノ粒子のキャラクタリゼーション粒径と粒度分布は動的光散乱法によって測定することができる。ナノ析出プロセスのさまざまなパラメータは、粒子の大きさに影響を与えます。最初に使用されるポリマー（PLGAとPEGの両方）の分子量は、また粒度分布に影響を与えます。遷移電子顕微鏡（TEM）も、図3に示すようにナノ粒子のサイズ分布と構造を確認するために使用することができます。粒径の範囲は、nmの範囲である。不均一なサイズ分布を持つ大規模な粒子サイズは、抱合反応やナノ析出法のニーズの最適化でエラーを示している可能性があります。さらに、表面のゼータ電位はZetaPALSによって測定することができる。 薬/貨物積載効率は標準HPLCで定量することができる。 粒子は、有機溶剤及びHPLCに溶解させる薬剤/貨物（図4）の吸光度を測定するために実行することができます。ナノ粒子の固定量を30スライド- A - Lyzer MINI透析ユニットで透析されている既知の場所薬物放出動力学的研究を行うことができます。一定の時間間隔で、透析ユニット内のコンテンツが収集され、有機溶剤の等量は、ナノ粒子を溶解するために追加されます。 HPLCは、薬物/貨物コンテンツを定量化するために、これらのサンプルに対して行われます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1。 EDC / NHS化学 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2。高分子ナノ粒子を調製するためのナノ析出法は、PEG - PLGAジブロックおよび粒子にロードされる薬物や貨物を含む（アセトニトリルまたはDCM）溶剤の有機溶液をH 2 Oを攪拌しながら3〜5 mLを滴下する<img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3"> 図3。 nanoparticesの透過型電子顕微鏡。PEG - PLGAはwortaminを含むナノ粒子のTEM像。リンタングステン酸は、造影剤として使用されました。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3398/3398fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図4"> 図4。 PBSで透析後のナノ粒子からのパクリタキセルのナノ粒子からの薬物の放出制御が。リリース。記載時に、粒子は透析カセットから取り出し、アセトニトリルに可溶化。溶液をHPLCで測定した。ナノ粒子の2つの別個のロットを比較した。 <div id="myEventWatcherDiv"></div><div id="myEventWatcherDiv"></div>

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ジブロックコポリマーを用いたナノ析出法は、高分子ナノ粒子を設計するための簡単​​、迅速な方法を表します。得られたナノ粒子は、難溶性化合物の送達に利用することができる疎水性のコアで構成されています。標的リガンドへの潜在的な、さらに結合のための部分を提供しながら、表面親水性層は、優れた水溶性を可能にします。 リポソーム、高分子ナノ粒子、デンドリマー、金属粒子、量子ドット14を含む多くのナノ粒子のプラットフォームでは、あります。これらのプラットフォームの中で、高分子ナノ粒子のプラットフォームは、アプリケーションの観点から定式化する最も簡単で汎用性の一つです。それは、最小限の機器のセットアップを必要とし、技術は数時間で学ぶことができます。また、アプリケーションの広い範囲を持ち、その生体適合性は、in vitroおよび in vivoアプリケーションの両方で有効になります。貨物を運ぶために、その能力は、イメージングと治療機能を備えている。 EDC / NHS化...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> EDC </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 22980 </td><td>共役試薬</td></tr><tr><td> NHS </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 24500 </td><td>共役試薬</td></tr><tr><td>アミン- PEG -カルボン酸</td><td>ライサン島バイオ（株） </td><td> NH2 - PEG - CM - 5000 </td><td>ポリマー（任意のPEG MW、5000がここに記載されている使用可能） </td></tr><tr><td> PLGA - carbxylate </td><td> Lactel </td><td> B6013 - 2 </td><td>高分子</td></tr><tr><td>ジクロロメタン（DCM） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 34856 </td><td>溶剤</td></tr><tr><td>アセトニトリル&gt; 99％純度</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 34851 </td><td>溶剤</td></tr><tr><td>メタノール&gt; 99％純度</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 34860 </td><td>洗う</td></tr></tbody></table>

ナノ析出法を通じて、ジブロック高分子ナノ粒子の製剤

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

ナノテクノロジーは、活用のスケールでナノメートル（ナノ粒子）の粒子のユニークな特性を含む科学の比較的新しい支店です。ナノ粒子はその大きさ、組成や表面の化学的性質を注意深く制御することができる正確な方法で設計することができる。これは、溶解性、拡散性、体内分布、放出特性と免疫原性のようなそれらの貨物の基本的なプロパティの一部を変更するために前例のない自由を可能にします。世の中に出て以来、ナノ粒子は、薬物送達、イメージング、および細胞生物学1から4を含む科学や医学の多くの分野で利用されている。しかし、それは完全に知覚される技術的な障壁のために&quot;ナノテクノロジー研究所&quot;の外で利用されていません。この記事では、我々は潜在的なアプリケーションの広い範囲を有するポリマーベースのナノ粒子のプラットフォームを合成する簡単な方法を説明します。 最初のステップは、疎水性ドメインと親水性ドメインの両方を持つジブロック共重合体を合成することである。モデルポリマーとしてPLGAとPEGを使用して、我々は、EDC / NHS化学5（図1）を使用して結合反応を説明した。我々はまた、ポリマーの精製のプロセスについて説明します。合成したジブロックコポリマーは、疎水性 - 親水性相互作用を通してナノ析出プロセスでナノ粒子に自己集合することができます。 に記載のポリマーナノ粒子は、非常に汎用性があります。ナノ粒子の疎水性コアは、薬物送達experiments6に対して難溶性薬物を運ぶために利用することができます。さらに、ナノ粒子は、DMSOのような溶剤を必要とするワートマニン、などの難溶性分子生物学試薬、のために有毒な溶剤の問題を克服することができます。しかし、DMSOは細胞毒性が、実験の妨げになることがあります。これらの難溶性の薬物や試薬は、効果的に最小限の毒性を有するポリマーナノ粒子を使用して配信することができます。ポリマーナノ粒子はまた、蛍光色素でロードされ、細胞内輸送の研究に利用することができます。最後に、これらのポリマーナノ粒子は、表面のPEGを介してリガンドを標的に結合させることができる。そのような標的ナノ粒子は,7 - 10や細胞内の特定のエピトープにラベルを付けるために利用することができます。

この記事では、ジブロック共重合体を用いたポリマーをベースとしたナノ粒子を合成するナノ析出の方法を説明します。私たちは、ジブロックの合成共重合体、ナノ析出技術、及び潜在的なアプリケーションについて説明します。

ナノテクノロジーは、ナノメートルスケールの粒子が持つ固有の特性を利用する、比較的新しい科学の一分野です。

本手順の目的は、ナノ沈殿法を用いて高分子ナノ粒子を合成することです。まず、EDC/NHS反応を行うことでPLGA-PEG共重合体を生成します。次に、このPLGA-PEG共重合体を用いて、ナノ沈殿法により目的の薬物またはカーゴを封入したナノ粒子を生成します。この段階で、動的光散乱法、透過型電子顕微鏡、またはHPLCを用いて、サイズ、表面電荷、薬物封入効率を含む基本的な生物物理学的特性評価を行うことができます。この技術の意義は腫瘍治療にまで及び、難溶性の抗がん剤を輸送できるため、現在の治療法よりも効果的である可能性があります。この手法は、がん治療に関する知見を提供し得ます。本手法は、細胞内輸送などの他の系の研究にも利用可能です。ナノ粒子に標的リガンドを結合させ、イメージング剤を用いてin vivoまたはin vitroで可視化することで、本技術を実証できます。本日は、当研究室の技術者であるRohit SukumarとNatalie Cummingsの2名が担当します。PLGA-PEG共重合体の合成を開始するには、カルボキシル化PLGAをアセトニトリルに5 mMの濃度で溶解し、緩やかに撹拌します。次に、PLGAに対して5倍モル過剰となるよう、NHSとEDCをそれぞれ25 millimolarの濃度になるまで添加します。溶液を約1時間緩やかに撹拌し、PLGAのカルボキシ基をPLGA-NHSに変換させます。1時間後、洗浄液であるメタノールを溶液の約10倍量添加し、反応生成物であるPLGA-NHSを沈殿させます。溶液を2000 ×gで遠心分離してPLGA-NHSをペレット化し、遠心分離後に上清を廃棄してEDCとNHSの痕跡を除去します。このメタノールによる洗浄手順を少なくとも3回繰り返します。洗浄完了後、PLGANHSを真空下で30分間乾燥させ、洗浄液の残渣を完全に除去します。次に、PLGAの溶解に最初に使用したときと同じ濃度になるように、PLGANHSペレットをアセトニトリルで再溶解させます。溶解後、ヘテロ二機能性PEGをPLGA溶液に添加します。濃度は5 mMとして添加してください。混合溶液を、一定の速度で攪拌しながら24時間インキュベートします。過剰量のメタノールを添加し、PLGA-PEGブロック共重合体の反応生成物を沈殿させます。洗浄および遠心分離工程をさらに3回繰り返し、未反応の過剰なPEGをすべて除去します。合成の最終工程として、PLGA PEGブロック共重合体を真空状態で乾燥させます。ナノ粒子沈殿法は、PLGA PEGブロック共重合体と封入する薬剤をA-P-L-G-A溶媒に溶解させることから始まります。溶媒の選択は、ナノ粒子の特性に影響を与えるため極めて重要です。次に、ポリマーと薬剤の混合液を、攪拌した3〜10倍量の水に滴下し、最終的なポリマー濃度が約3 mg/mLになるようにします。滴下して加えてください。適切なサイズのナノ粒子を形成させるためには、水相への有機溶液の添加が極めて重要です。減圧下で2時間撹拌を続け、自己組織化によるナノ粒子の形成を促し、有機溶媒の痕跡を除去します。2時間の撹拌後、アムコンフィルターを用い、2,700 ×gで10分間遠心分離してナノ粒子を濃縮します。次に、PBSでナノ粒子を洗浄して捕捉されなかった薬物を除去し、続いて遠心分離を行います。最後に、ナノ粒子をPBSで再懸濁します。ナノ粒子の特性をより詳細に把握するために、サイズ、表面電荷、薬物封入効率を含む基本的な生物物理学的特性評価を行うことができます。ナノ粒子は、書面によるプロトコルに記載されている方法で保存することが可能です。PLGA PEGナノ粒子の特性評価にあたり、ナノ粒子のサイズ、分布、および構造を確認するために透過型電子顕微鏡を用いました。粒子サイズは一般的にナノメートル範囲となります。不均一なサイズ分布を伴う大きな粒子径は、抱合反応のエラーか、あるいはナノ沈殿法の最適化が必要であることを示唆している可能性があります。ここでは、標準的なHPLCを用いてパクリタキセルの封入効率および放出量を定量化した、薬物放出速度論試験を示します。既知の固定量のナノ粒子を、一定の時間間隔で透析しました。透析ユニット内の内容物を回収し、等量の有機溶媒を加えてナノ粒子を溶解させた。その後、これらのサンプルを用いてHPLC測定を行った。パクリタキセルの含有量を定量した。このナノ沈殿法は、習得すれば3時間で適切に実施することが可能である。本手法を実施する際は、粒子形成後の粗大粒子の発生を防ぐため、常に有機相を水相にゆっくりと加えるようにしてください。この技術により、ナノメディシン分野のがん研究者は、従来の手順ではがん患者への毒性が強すぎると考えられていた難溶性薬剤の使用を検討することが可能となりました。難溶性薬剤が有効であるか、全身毒性が解消されたか、あるいは標的リガンドがナノ粒子を適切に目的地へと誘導しているかといった疑問を明らかにするために、in vivo 薬効試験やイメージング解析などの他の手法を併用することができます。

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我々は、生分解性高分子ナノ粒子を用いて、血管新生のための治療因子を過剰発現するためのプログラミング幹細胞の方法を記載している。記載された方法は、 インビトロで脂肪由来幹細胞をトランスフェクトし、マウス後肢虚血モデルにおける血管新生を促進するためにプログラムされた幹細胞の有効性を検証する、ポリマー合成が挙げられる。...

生分解性ポリマーナノ粒子を用いた治療的血管形成のためのプログラミング幹細胞

溝状のマイクロ流体チャネルを通過する2つの隣接流体は、前重合体コアの周りに鞘を形成するように導くことができる。その後、形状と断面の両方を決定します。チオールクリック化学のような光開始重合は、コア液を所定の大きさおよび形状を有するマイクロファイバーに迅速に固化させるのに適している。...

あらかじめ設計されたサイズと形状を用いるポリマー繊維およびバイオハイブリッド繊維のマイクロ流体製造

学ぶナノ析出法によるジブロック高分子ナノ粒子の製剤技術。PLGA-PEG共重合体を合成し、難溶性抗がん薬を封入する薬物送達システムの構築方法を解説。動的光散乱や透過型電子顕微鏡による特性評価も含む。

ナノ析出法を通じて、ジブロック高分子ナノ粒子の製剤

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