Name: 滑液における培養ヒト関節軟骨細胞用の3Dシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学ぶ滑液を用いた3D培養システムでヒト関節軟骨細胞を長期培養する方法。アルジン酸ビーズ封入技術により生理的環境を模倣し、軟骨再生研究や関節炎治療薬のスクリーニングに応用可能です。

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我々は、滑液の貯蔵及び遠心分離のヘルプを提供するためのロビンナイ（タフツ医療センター）、智也内村とダナケアンズ（タフツ大学）に感謝いたします。この作品は、LZのためのNIH（1R01AR059106 - 01A1）によって賄われていた

滑液の培養ヒト関節軟骨細胞用3Dシステム本研究では、我々は、修正された製造元で推奨されるカプセル化プロトコル（ロンザ、および31）を用いてアルギン酸ビーズで人間の関節軟骨細胞をカプセル化。これらの3次元構造体を使用して、我々は人間の滑液の様々な割合を含有する培養培地で細胞を培養するためのシステムを開発し、軟骨の遺伝子発現のためのこれらの3次元構造を評価している。 1。三次元（3D）カプセル化のためのヒト関節軟骨細胞（HAC）を準備<ol><li> 37 1分間° Cの水浴中で人間の関節軟骨細胞（HAC）（ロンザ）（パッセージ2）のバイアル（1ml）を解凍。 </li><li>軟骨細胞増殖培地（ロンザ）を1mlと混合し、細胞を収集するために3〜5分間3000rpmで遠心する。上清を捨てる。 </li><li>軟骨細胞増殖培地に再懸濁し、細胞ペレット（ロンザ）。 </li><li> 10cmの組織で細胞をプレート培養プレート（BD Biosciences社）、および軟骨細胞増殖培地で培養（ロンザ）細胞がコンフルエントになるまで。日立空調は3または4（P3またはP4）よりも高い継代数で使用してください。 </li><li>アルギン酸ビーズのカプセル化のために細胞を収集するtrypsinzation続いて、15​​5ミリNaClの代わりに、標準PBSでプレート上に日立空調を洗浄してください。一度細胞が切り離されて、5分間3000rpmの時に細胞をスピンダウン。細胞は、今の3Dカプセル化するための準備が整いました。 </li></ol> 2。 3Dビーズに日立空調をカプセル化 8 × 10 5細胞/ mlの密度で1.2％のアルギン酸塩溶液（シグマ）で日立空調を再懸濁します。細胞数は、スタンダードセルのカウンタを使用して、前のカプセル化に決定した。それは、ビーズの細胞の均等な分配を確保するためによく混合することは非常に重要です。 <ol><li>ピペット22ゲージ針（タイコヘルスケア、（株））に接続された12mlのシリンジにHAC /アルギン酸塩溶液の混合物。 </li><li>一方、102メートルと50 mLのビーカーを用意するボリュームでM CaCl 2を 5回HAC / aginateソリューションのこと。ビーカー内の攪拌棒を配置して（約150rpmで）徐々に102 mMのCaCl 2溶液をかき混ぜる。 </li><li> CaCl 2溶液の表面に上記の6インチ約シリンジの先端を保持し、CaCl 2溶液の滴下にHAC /アルギン酸塩混合物を追加。一般的に、結果として得られるアルギン酸ビーズは、約10 4細胞/ビーズのカプセル化の密度と直径で2mmです。注：CaCl 2溶液上にシリンジの高さが重要である。短い距離は、不均一な機械的完全性と細胞のカプセル化を引き起こし、球状ビーズの代わりに、形のティアドロップになります。 </li><li>ビーズは、20〜25分のCaCl 2溶液に撹拌してみましょう。他のアルギン酸カプセル化プロトコルは、10分の非常に短いインキュベーション時間を示す一方で、我々は、CaCl 2溶液と長いインキュベーション時間がなるの整合性を高めることを発見広告。 </li><li> CaCl 2溶液を除去する、軟骨細胞分化培地（ロンザ）で一度して2-3倍のNaClの2-3量のビーズを洗浄し、。他のアルギン酸ビーズのカプセル化プロトコルは、上記の洗浄手順については、フィルタを使用して関与しながら、我々は、アルギン酸ビーズはしばしばこのようにカプセル化の効率を減少させる、フィルターとドライアウトに閉じ込められることがわかった。我々はそれが最も効率的なビーズが廃棄するまでビーカーの底に解決を解決できるようにすることがわかった。 </li><li>培養皿にビーズを転送する標準的なヘラを使用してください。通常、我々の文化軟骨細胞は、それらが滑液と軟骨細胞分化培地（ロンザ）に切り替える前に増殖させた培地でカプセル化のプロセスに適応できるように、軟骨細胞増殖培地で2日間ウェル3 cmあたり12のビーズを。 </li></ol> 3。滑液の培養液で培養軟骨細胞<ol><li>新鮮な滑液は、oから入手できます。utpatientクリニック（我々は、タフツ医療センターから滑液が得られる）。滑液は、実験室に15ミリリットルファルコンチューブに移し、そして直ちに細胞破片を除去するために15分間3000rpmで遠心分離することができます。一定分量の無細胞滑液1.5 mLのマイクロ遠心チューブに、凍結融解を避けるために。上清を-80℃で使用時まで保存することができます。 </li><li>培養前にCaCl 2をこの微量がアルギン酸の整合性を確保するためである、100mMのアスコルビン酸の一定濃度で、体積比率を変化させることで、軟骨細胞分化培地（CDM、ロンザ）で滑液を混ぜると9ミリのCaCl 2（ビーズ）。 </li><li> 37℃インキュベーターで振盪プラットフォーム上でプレートを保持（ロッキング周波数：約75回/分）アルギン酸ビーズ内に栄養分布を手助けするために、ビーズの凝集を軽減する。これは長期間（最長4週間）のために我々は文化これらの軟骨細胞をとして特に重要です。 （注）：軟骨細胞の増殖と分化のメディア（ロンザ）は2つの一般的に使用される抗生物質ゲンタマイシン、アムホテリシンを含んでいますが、我々は軟骨細胞を培養するための滑液中の別の割合を使用していた抗生物質を補足していない。の汚染はこれまで観察されなかった。 </li><li>すべての2〜3日メディアの混合物を変更する。滑液の粘度は、長期培養中にアルギン酸ビーズ内にカプセル化された培養軟骨細胞における大きなハードルとなっています。我々はまた、アルギン酸ビーズの整合性を強化付き102mmのCaCl 2（50％V / V）、と滑液添加培地を希釈することが最も効果的な発見。このように、培地を徐々にビーズを傷つけることなく、ピペットで除去することができます。 </li></ol> 4。遺伝子発現解析のためのアルギン酸ビーズの収穫の日立空調遺伝子発現解析のためのアルギン酸ビーズから日立空調を収穫するときに特別な注意が必要です。 <ol><li>アルギン酸ビーズ3 Tiを洗う約5分間ずつで102 mMのCaCl 2でのMES。 </li><li> 4-5回そのビーズの体積で55 mMのNaCitrateを追加することにより、軟骨細胞を取得する。アルギン酸ビーズが完全にNaCitrate溶液に浸漬されていることが重要です。振ったり、20〜30分の岩。 </li><li>細胞をスピンダウンし、上清を捨てる。 </li><li> RT - PCR解析のために、細胞溶解緩衝液（キアゲンRNA単離キット）で細胞ペレットを再懸濁し、そしてRNAの精製に進みます。 </li></ol> 5。組織学的分析のためにアルギン酸ビーズの日立空調を修正特別なケアは、組織学的分析のための3Dビーズから日立空調を収穫するために取られる必要があります。 <ol><li>アルギン酸ビーズを約5分間ずつで102 mMのCaCl 2で 3回洗浄する。完全に粘性滑液を洗い流すために、我々は、37℃インキュベーター（ロッキング周波数で揺動、一晩軟骨細胞分化培地（ロンザ）で洗浄することが最も効果的な発見：約75時間秒/分）。軟骨細胞増殖培地は、この長期にわたる洗浄の軟骨細胞の生存を確保し、固定剤の最大の浸透を可能にするために使用されていました。 </li><li>一晩70％エタノールでビーズを固定し、組織学的分析を進める。 DAPI染色を実行するには、穏やかな振盪下1時間のためにDAPI溶液（500ng/ml）をアルギン酸ビーズをインキュベートし、15分間付き102mm CaCl 2を各時間で3回洗浄する。 DAPI画像はその後、蛍光顕微鏡で観察することができます。ビーズはまた、アルシアンブルーとH＆E染色用切片にすることができます。 </li></ol> 6。代表的な結果滑液の高い割合で、人間の軟骨細胞のための私達の3次元培養法は、図1に示す模式図に描かれています。人間の軟骨細胞をアルギン酸ビーズ中にカプセル化された後、彼らは滑液の比率を変えて添加した培地で増殖させた。ために滑液の粘度が、それは不可欠です軟骨の構造の凝集を防ぎ、栄養素の均一な分布を確保するために一定の揺動条件下での培養軟骨細胞。それは、固定または溶解バッファーは、（図1）ビーズを貫通できるように、軟骨細胞を取得する前に広範囲にアルギン酸ビーズを洗浄するためにも不可欠です。アルギン酸ビーズ中の軟骨細胞の明視野（BF）画像をFig.2に示します。 DAPI染色は、ビーズ（図2）内のセルのusniform分布を確認するために実施した。 21日間の培養期間の終了時に、遺伝子発現解析は、定量RT - PCRによって行った。リファレンス遺伝子GAPDHは、それが軟骨細胞32上のqPCR解析のための最も信頼できるリファレンス遺伝子の一つであると決定されたとして、すべてのPCR反応のために正規化のために使用されていました。例を図に示します。我々は変形性関節症患者6例からプールされた滑液で培養したヒト関節軟骨細胞からの結果を分析した3。事実と一致することから軟骨細胞ロンザは必然的に脱分化33につながる2次元の文化、で展開されている、我々は、0日目軟骨細胞は軟骨基質遺伝子の最小限のレベル（図3）を発現しています。滑液を補充した軟骨細胞分化培地（ロンザ）または培地で軟骨細胞の3次元培養では有意に21日目（図3）34での再分化軟骨細胞を示すコラーゲン、アグリカンとMMP13、の軟骨の遺伝子発現を増加させた。メディアにおける滑液の割合を増やすと、軟骨基質のマーカーコラーゲンIIとアグリカンのmRNA発現（Fig.3Aおよび3B）の同等のレベルになりました。培地のみ（図3c）の培養と比較してさらに、100％滑液で培養した軟骨細胞は、さらに軟骨分解酵素MMP13のmRNA発現の減少を示した。興味深いことに、細胞死インジケータカスパーゼ3の発現レベルは徐々に示唆し、滑液の増加比で減少しているのynovial液体培養では減少アポトーシスレベル（図3D）につながっている。したがって、我々の結果は、3D設定の滑液中に高レベルの培養ヒト関節軟骨細胞は、実現可能な技術であることを示している。 テーブルと図<img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3587/3587fig1.jpg" /> 図1 3Dアルギン酸ビーズの滑液の割合が高いの文化、ヒト関節軟骨細胞への法の模式図。最初に、軟骨細胞およびアルギン酸塩溶液を混合されています。 CaCl 2溶液に滴下適用された場合、軟骨細胞は、架橋のCa -アルギン酸ハイドロゲルビーズ内に固定されています。これらの3次元構造は、ヒト滑液の比率を変化させた軟骨細胞分化培地（ロンザ）で培養されています。ロッキング条件下で培養21日後、細胞を含むアルギン酸ビーズは細胞が遺伝子のために取得された後に洗浄されています発現解析。 <img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3587/3587fig2.jpg" /> 図2。ブライトフィールド（BF）およびヒト関節軟骨細胞のDAPI画像0％、30％、50％、70％と100％滑液とカプセル化された文化。軟骨細胞は、すべての培養条件で形状が球形であった。明視野（BF）およびDAPIの画像は、軟骨細胞の位置と分布を確認するために重ねていた。インセット、拡大画像。矢尻、BFとDAPI染色像における軟骨細胞の局在。 <img alt="図3。" src="/files/ftp_upload/3587/3587fig3.jpg" /> 図3。一日でカプセル化されたヒト関節軟骨細胞の定量RT - PCR解析0（D0）滑液（SF）（0％、30％、50％、70の様々な比率で添加した培地で培養する（D21）の21日後に％と100％）。つの独立したサンプルの結果がここに表示されます。 GAPDHは、すべてのPCRのための内部基準として使用されていました。 <strオング&gt; A。コラーゲンIIのmRNA発現。B。アグリカンのmRNA発現。C。 MMP13のmRNAの発現。D。カスパーゼ3 mRNAの発現。統計的有意性は、INSTATのソフトウェアを使用して、0日の試料と21日目0％のサンプルと100％関節液（SF）培養に評価した。 *はP &lt;0.05。

<ol><li>Centers for Disease Control and P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projected+state-specific+increases+in+self-reported+doctor-diagnosed+arthritis+and+arthritis-attributable+activity+limitations--United+States%2C+2005-2030%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR.+Morb.+Mortal.+Wkly.+Rep%22%5BJournal%5D)">Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations--United States, 2005-2030.</a> MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).</li>
<li>Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+correlates+of+arthritis-attributable+work+limitation+in+the+US+population+among+persons+ages+18-64%3A+2002+National+Health+Interview+Survey+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data.</a> Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).</li>
<li>Chung, C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cartilage+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Engineering cartilage tissue.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 60, 243-262 (2008).</li>
<li>Glowacki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+engineering+of+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Rehabil.+Res.+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro engineering of cartilage.</a> J. Rehabil. Res. Dev. 37, 171-177 (2000).</li>
<li>Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-In+vitro+Effects+of+Compression+and+Time+in+Culture+on+Aggregate+Modulus+and+on+Gene+Expression+and+Protein+content+of+Collagen+Type+II+in+Murine+Chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes.</a> Tissue Eng. Part A. , (2009).</li>
<li>Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tissue+engineering%3A+the+role+of+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Functional tissue engineering: the role of biomechanics.</a> J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).</li>
<li>Goldring, M. B., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis.</a> J. Cell. Physiol. 213, 626-634 (2007).</li>
<li>Zvaifler, N. J., Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+in+chronic+inflammatory+synovitis%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Rheumatol.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Cytokines in chronic inflammatory synovitis.</a> Scand. J. Rheumatol. Suppl. 76, 203-210 (1988).</li>
<li>Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secreted+glycoprotein+lubricin+protects+cartilage+surfaces+and+inhibits+synovial+cell+overgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth.</a> J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).</li>
<li>Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+reduces+inflammation+in+experimental+arthritis+by+modulating+TLR-2+and+TLR-4+cartilage+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression.</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2011).</li>
<li>van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loading-induced+changes+in+synovial+fluid+affect+cartilage+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism.</a> Biorheology. 37, 45-55 (2000).</li>
<li>Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+arthritic+synovial+fluid+influences+proteoglycan+biosynthesis+and+degradation+in+organ+culture+of+bovine+nasal+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Coll.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage.</a> Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).</li>
<li>Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+normal+synovial+fluid+on+the+metabolism+of+articular+chondrocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).</li>
<li>Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte+nonresponsiveness+to+insulin-like+growth+factor+1+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis.</a> Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).</li>
<li>Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+stimulation+of+chondrocyte+proteoglycan+synthesis+by+human+synovial+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid.</a> Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).</li>
<li>Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte+unresponsiveness+to+insulin-like+growth+factor-1.+A+novel+pathogenetic+mechanisms+for+cartilage+destruction+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Agents+Actions%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis.</a> Agents Actions. 26, 193-195 (1989).</li>
<li>Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid+and+peripheral+blood+immune+complexes+of+patients+with+rheumatoid+arthritis+induce+apoptosis+in+cytokine-activated+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatol.+Int%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes.</a> Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).</li>
<li>Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+and+autologous+synovial+fluid+induce+chondrogenic+differentiation+of+equine+mesenchymal+stem+cells%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study.</a> Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).</li>
<li>Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneration+of+normal+articular+cartilage+induced+by+late+phase+osteoarthritic+synovial+fluid+in+beagle+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs.</a> Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).</li>
<li>Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+of+human+subchondral+progenitor+cells+is+impaired+by+rheumatoid+arthritis+synovial+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid.</a> J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).</li>
<li>Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+culture+system%3A+Synovial+fibroblasts+modulate+articular+chondrocyte+matrix+synthesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro.</a> Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).</li>
<li>Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+synovial+fluid+from+injured+knee+joints+on+in+vitro+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis.</a> Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).</li>
<li>Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+growth+factors+and+synovial+fluid+on+chondrogenesis+in+perichondrium%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Plast.+Reconstr.+Surg.+Hand.+Surg.%22%5BJournal%5D)">The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium.</a> Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).</li>
<li>Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+synovial+fluid+and+synovial+fluid+cells+on+chondrocyte+metabolism+in+short+term+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture.</a> J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).</li>
<li>Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritic+synovial+tissue+inhibits+proteoglycan+production+in+human+osteoarthritic+cartilage%3B+Establishment+and+characterisation+of+a+long-term+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture.</a> Arthritis Rheum. , (2011).</li>
<li>Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+human+knee+synovial+fluid+on+chondrogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Knee.+Surg%22%5BJournal%5D)">Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro.</a> Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).</li>
<li>van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loading-induced+changes+in+synovial+fluid+affect+cartilage+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism.</a> Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).</li>
<li>Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritic+synovial+fluid+and+synovium+supernatants+up-regulate+tumor+necrosis+factor+receptors+on+human+articular+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes.</a> Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).</li>
<li>Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+affects+positively+the+proliferation+of+bovine+satellite+cells+and+their+myogenic+differentiation+through+up-regulation+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD.</a> Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).</li>
<li>Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chondrocytic+gene+expression+by+biomechanical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Eukaryot.+Gene.+Expr%22%5BJournal%5D)">Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals.</a> Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).</li>
<li>Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+growth+characteristics+of+chondrocytes+encapsulated+in+alginate+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Connect.+Tissue.+Res%22%5BJournal%5D)">Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads.</a> Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).</li>
<li>Toegel, S., Huang, W., Piana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+reliable+reference+genes+for+qPCR+studies+on+chondroprotective+action%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action.</a> BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).</li>
<li>Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+of+human+chondrocytes+during+passaged+monolayer+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation.</a> J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).</li>
<li>Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chondrocytes+differentially+express+matrix+modulators+during+in+vitro+expansion+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).</li>
<li>Anat, J. 121, 107-118 (1976).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もない。

このレポートでは、我々は人間の滑液の高濃度を含む培地で、3D環境でのヒト関節軟骨細胞の培養を可能にする方法を開発した。滑液は関節軟骨細胞が存在する関節腔、自然環境を構成する主要コンポーネントの一つです。しかし、滑液の粘度は、軟骨細胞の三次元の長期培養するための大きな課題となっています。粘性環境での3D構造でさえ栄養分布を維持するための課題を克服し、凝集を防ぐために、我々は、穏やかな揺れで一定の動きの下に軟骨の構成要素を配置する。軟骨の構成要素の構造的完全性を高めるために、我々はビード形成とメディアを変える手順31の時間の長さの最適化を含むアルギン酸ハイドロゲル中に軟骨細胞を播種の伝統的な手順を修正。とき、そのような手続きが不可欠である軟骨の構造は、長期培養中に粘性滑液で処理されます。 我々は、この方法は、私たちは彼らの自然なmilleu、滑液中のヒト関節軟骨細胞の生物学を勉強できるようになると考えています。つの潜在的な懸念は、試薬の拡散は、アルギン酸ビーズ中にカプセル化し、粘性のある環境で育った軟骨細胞のための理想的でないかもしれないことである。このように軟骨...

特定の試薬と機器の表： <table border="1"><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>アルギン酸（アルギン酸ナトリウム塩） </td><td>シグマ</td><td> A2158 - 250G </td><td> 2.4％のソリューションは、40 ° Cで保存</td></tr><tr><td>粒状塩化カルシウム二水和物、 </td><td> JTベーカー</td><td> A19339 </td><td></td></tr><tr><td width="239" rowspan="2" >軟骨増殖培地</td><td width="254" rowspan="2" >ロンザ</td><td width="182" > CC - 3156（ベースのメ​​ディア） </td><td width="141" rowspan="2" ></td></tr><tr><td width="182" > CC - 4409（サプリメント） </td></tr><tr><td width="239" rowspan="2" >軟骨細胞分化のメディア</td><td width="254" rowspan="2" > Lonza </td><td width="182" > CC - 3226（ベースのメ​​ディア） </td><td width="141" rowspan="2" ></td></tr><tr><td width="182" > CC - 4408（サプリメント） </td></tr><tr><td>ヒト関節軟骨細胞</td><td>ロンザ</td><td > CC - 2550 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI（4&#39;,6 -ジアミジノ-2 - フェニル二塩酸塩） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td > D9542 </td><td></td></tr><tr><td> RNeasyミニキット（RNA抽出用） </td><td>キアゲン</td><td > 74104 </td><td></td></tr><tr><td> PCR試薬：SYBR -緑色</td><td>クアンタ</td><td > 95053-500 </td><td></td></tr><tr><td> 12mlの注射器</td><td>タイコ-ケンダルMonoject </td><td > 512852 </td><td></td></tr><tr><td> 22 - Gague注射針</td><td>タイコ-ケンダルL - Monoject </td><td > 8881 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td > IX71 </td><td></td></tr><tr><td>プラットフォームのロッカー</td><td> Thermoscientific thermolyne </td><td >バリミックス</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td ></td><td></td></tr><tr><td> プライマーの配列 </td><td></td><td ></td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンIIaのフォワード</td><td> 5&#39; - TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT - 3&#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンIIA -逆</td><td> 5&#39; - CCTCTGCCTTGACCCGAA - 3&#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> MMP13フォワード</td><td> 5&#39; - TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT - 3&#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> MMP13 -逆</td><td> 5&#39; - GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC - 3&#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td>カスパーゼ3フォワード</td><td> 5&#39; - TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA - 3&#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td>カスパーゼ3の逆</td><td> 5&#39; - TGG ATG AACのCAG GAG CCA TCC TTTの-3&#39; </td><td ></td><td></td></tr></table>

滑液における培養ヒト関節軟骨細胞用の3dシステム

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

軟骨破壊は、変形性関節症の中心的な病理学的特徴、米国における障害の主要な原因です。成人の軟骨は、 生体内で非常に効率的に再生成されません、そしてその結果として、変形性関節症は軟骨の損失を不可逆的につながると慢性的な痛みと不動の1,2が付属しています。軟骨組織のエンジニアリングは、組織機能を再生成し、復元するために有望な可能性を提供しています。この技術は、通常、結果として得られる3Dは、エンジニアリングの目標生体 3-6 に欠損部位に移植することができる生化学的および生体力学的に成熟した組織で、ある期間にわたってバランスのとれた培地で構築する天然または合成の足場と培養に播種した軟骨細胞を含む。軟骨細胞の成長とマトリックスの沈着のための最適な条件を達成することが軟骨の組織工学の成功に不可欠です。 北極でのネイティブ関節腔、軟骨の骨のウラル表面は滑液に包まれている。この透明で粘性のある流体には、無血管性の関節軟骨に栄養を提供し、軟骨細胞の代謝7,8にとって重要な成長因子、サイトカインや酵素が含まれています。さらに、滑液は主に分泌する2つの主要なコンポーネント、ヒアルロン酸とlubricin 9 10を通じて、軟骨表面の間に低摩擦の移動が容易になります。対照的に、軟骨培養組織は、最も頻繁に人​​工培地で培養される。これらのメディアは、おそらく軟骨細胞代謝を研究するための複数の定義された条件を提供することができますが、関節液は、最も正確に関節軟骨細胞が入って置かれての自然環境を反映している確かに、滑液は、取得および保存するために容易であるという利点があり、多くの場合、定期的に体内で補充することができます。いくつかのグループが増殖するヒト、ウシ、ウサギおよびイヌcで滑液で培養液を補充しているhondrocytes、そのほとんどは滑液（20％以下）11月25日の唯一の低レベルを使用していました。鶏、馬と人間の軟骨細胞が滑液のより高い割合と培地で培養されているが、これらの培養システムは、2次元の26から28でした。ここでは、21日の期間にわたって滑液の割合が高く（最大100％）で、3Dシステムで培養ヒト関節軟骨細胞の我々の手法を提案する。そうすることで、我々は滑液の高粘度によって提示される主要なハードルを克服した。このシステムは、さらなるための自然環境を模倣するために軟骨のための自然環境を構成する2つの他の重要な要因（酸素張力および機械的荷重）29,30と組み合わせることができる3D設定で滑液中に人間の軟骨細胞を研究の可能性を、提供します。軟骨の成長。さらに、このシステムはまた、軟骨細胞の滑液の活性を測定するために使用し、開発するためのプラットフォームを提供することができます軟骨再生技術や関節炎の治療オプション。

滑液の高濃度の培養ヒト関節軟骨細胞の3次元システムについて説明する。滑液は関節軟骨のための最も自然な微小環境を反映し、容易に入手し、保存することができます。このシステムは、このように軟骨再生の研究や、関節炎を治療するための治療薬をスクリーニングするために使用することができます。

滑液における培養ヒト関節軟骨細胞用の3Dシステム

軟骨破壊は、米国における障害の主要な原因である変形性関節症の中心的な病理学的特徴である。成人の軟骨は……

本実験の目的は、ヒト関節軟骨細胞を滑液中で長期培養することです。まず、軟骨細胞をアルギン酸ビーズに封入します。その後、滑液中で軟骨細胞を培養することで、通常の成長条件を模した3D環境で軟骨細胞を増殖させます。細胞に十分な栄養を行き渡らせるため、培地は定期的に交換する必要があります。本手順の最終ステップは、遺伝子発現および組織学的解析のために、アルギン酸ビーズから軟骨細胞を回収することです。これらの解析により、アルギン酸ビーズ内で培養された軟骨細胞が生存し、増殖しており、かつ相当量の軟骨基質を発現していることが確認されます。この手法を既存の方法よりも利用する主な利点は、軟骨細胞を2Dではなく3次元の設定で分析できることです。また、人工培地ではなく滑液を培地として使用しています。このように、3次元構築物と滑液を併用することで、プレート上の2次元設定や人工培地とは異なり、より自然な環境で分析することが可能になります。この手法は、軟骨生物学および組織工学の分野における重要な疑問への回答に役立ちます。例えば、軟骨細胞や軟骨細胞は、長期的に滑液中でどのように振る舞うのか。また、宿主に移植する前に、軟骨細胞を滑液に慣らしておくべきか、といった点です。ヒト関節軟骨細胞または凍結保存細胞の1 mLバイアルを、温水で1分間解凍して準備します。次に、温めた軟骨細胞増殖培地2 mLを含むバイアルに、解凍した細胞を混ぜ合わせます。DMSOを含む凍結保存液を除去するため、細胞を3000 RPMで3〜5分間遠心分離し、上清を捨ててから、細胞を軟骨細胞増殖培地7 mLで再懸濁します。次に、細胞を10 cmプレートに移し、細胞がコンフルエントになるまで培養します。継代数は3回または4回以下としてください。コンフルエントになったら、PBSではなく塩化ナトリウム溶液で細胞を洗浄します。次に、0.5 mLの標準的なトリプシンEDTA溶液を用いて、トリプシンで細胞を回収します。細胞が剥離したら、遠心分離して沈殿させ、3D封入の準備を整えます。ピペットでペレットを回収し、上清を除去した後、1.2%アルギン酸溶液に1 mLあたり800,000個の密度で懸濁させます。次に、ハックアルギン酸溶液の5倍の量の塩化カルシウム溶液を調製します。ハックアルギン酸の調製中、溶液をゆっくりと撹拌し続けてください。ハックアルギン酸溶液を、22ゲージの針を装着した12 mLシリンジにピペットで分注します。塩化カルシウム溶液の準備が整ったら、シリンジの先端を塩化カルシウム溶液の表面から約6インチ上の位置に保持します。シリンジの高さが重要です。塩化カルシウム溶液は非常に重要です。十分に高く保持しないと、ビーズが球形にならず形が崩れます。次に、アルギン酸混合液を滴下します。通常、得られるビーズの直径は 2 mm で、1 粒あたり

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

軟骨細胞による軟骨細胞外基質の生合成は、機械的刺激を印加することによって影響を受けることができます。このメソッドは、3Dコンストラクトおよび軟骨代謝の誘導された変化の評価にカプセル化された軟骨細胞への動的圧縮歪みを適用する方法について説明します。...

軟骨アガロースゲルの機械的刺激

このホワイトペーパーで説明する方法は、同時UV重合とbioprinterに市販のインクジェットプリンターを変換する方法を示しています。プリンタは、細胞と生体材料との三次元組織構造を構築することが可能である。ここに実証研究では、3Dの新軟骨を構築した。...

三次元インクジェット印刷技術を用いて、ヒト軟骨組織の作製

軟骨修復は満たされていない医学的課題であり、ヒトの関節軟骨を操作するための細胞ベースのアプローチは有望な解決策です。ここでは、ヒト関節軟骨細胞の拡大と成熟のための理想的なツールとして、3次元(3D)生体模倣ハイドロゲルについて説明します。...

関節軟骨細胞培養軟骨の生成のための3Dハイドロゲルの足場

ここでは、自己組織化ペプチドのひと関節軟骨細胞の脱分化型軟骨への分化を促進する足場の 3 D 培養システムを取得するためのプロトコルを提案する.

三次元ペプチド足場で哺乳動物の細胞を培養

この記事では、簡単な分離そしてニュージーランド白ウサギ滑液からの間葉系幹細胞の浄化のためのシンプルで経済的プロトコルを示します。...

磁気活性化細胞を分離し、滑膜液由来間葉系幹細胞が家兎モデルからの浄化戦略を並べ替え

この記事では、軟骨細胞圧縮のための空気作動性マイクロ流体デバイスを製造し、特徴付けるための詳細な方法を提供します。...

動的圧縮で軟性細胞を刺激するマイクロ流体プラットフォーム

ヒト間葉系幹細胞から4種類の組織を作製し、ヒト膝関節の軟骨、骨、脂肪パッド、滑膜を再現するための詳細な方法を提供します。これらの4つの組織は、カスタマイズされたバイオリアクターに統合され、マイクロ流体工学を介して接続されるため、膝関節オンチップが生成されます。...

関節疾患のモデリングと薬剤検査のための膝関節チップの作成

このプロトコルでは、軟骨細胞、フィブロネクチン接着アッセイ由来軟骨形成因子(FAA-CP)、およびヒト関節軟骨からの移動性軟骨形成因子(MCP)の単離について詳しく説明します。酵素消化、フィブロネクチン接着、およびこれらの細胞を単離および特性評価するための遊走ベースのアッセイをカバーしています。...

フィブロネクチン接着および回遊アッセイを用いた軟骨細胞および軟骨形成細胞の単離

本研究では、重力を利用して低接着条件下で細胞をスフェロイドに凝集させ、得られたスフェロイドをミニバイオリアクターで培養することにより、軟骨球性スフェロイドを作製する方法について述べています。...

重力下での低接着条件と自家製ミニバイオリアクターを用いた種々の軟骨細胞からのスフェロイド作製

急性炎症性、感染性、構造的滑膜の変化を評価することができるヒト の生外...

機能と構造が保存された体内ヒト滑膜 組織を用いた前 臨床モデル

学ぶ滑液を用いた3D培養システムでヒト関節軟骨細胞を長期培養する方法。アルジン酸ビーズ封入技術により生理的環境を模倣し、軟骨再生研究や関節炎治療薬のスクリーニングに応用可能です。

滑液における培養ヒト関節軟骨細胞用の3Dシステム

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