滑液における培養ヒト関節軟骨細胞用の3Dシステム

次の実験の全体的な目標は、長期培養で滑液中でヒトの関節軟骨細胞を成長させることです。これは、最初に軟骨細胞をアルギン酸ビーズにカプセル化することによって達成されます。次に、軟骨細胞を滑液中で培養し、軟骨細胞を通常の成長条件を模倣した3D環境で増殖させることができます。

中央値は、細胞が栄養素に十分にアクセスできるように、定期的に変更する必要があります。手順の最後のステップは、遺伝子発現と組織学的分析のためにアルギン酸ビーズから軟骨細胞を採取することです。これらの解析により、アルギン酸ビーズで培養した軟骨細胞は生存性があり、増殖し、かなりの量の軟骨マトリックスを発現することが確認されました。

この手法を既存の方法よりも使用する主な利点は、軟骨細胞を2Dではなく3次元の設定で分析できることです。また、人工的なメディアではなく、滑液をメディアとして使用しています。したがって、3次元構造の使用と滑液の使用の組み合わせにより、プレート上の2次元設定と人工媒体とは対照的に、より自然な環境でそれらを分析できます。

この方法は、軟骨生物学および組織工学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、軟骨細胞や軟骨細胞は滑液中で長期間にわたってどのように振る舞うのでしょうか?また、宿主に移植する前に、軟骨細胞を滑液に慣れさせる必要がありますか?

ヒト関節軟骨細胞またはハックの1ミリリットルのバイアルを、温水で1分間解凍して調製します。次に、ハックを2ミリリットルの温めた軟骨細胞成長培地を含むバイアルに混ぜます。DMSOを含む凍結培地を除去するには、細胞を3000RPMで3〜5分間ペレット化し、上清を廃棄し、細胞を7ミリリットルの軟骨細胞増殖培地に再懸濁します。

次に、細胞を10cmプレートに移し、細胞がコンフルエントになるまで培養します。ハックは、3つまたは4つ以下のパッセージ番号で使用する必要があります。コンフルエントになったら、PBSではなく塩化ナトリウム溶液でハックを洗います。

次に、0.5ミリリットルの標準トリプシンEDTA溶液を使用してトリプスで細胞を採取します。細胞が分離したら、スピンダウンすると、3Dカプセル化の準備が整います。アプリのペレットハックで拾い上げ、上清を取り除き、1.2%アルギン酸溶液に800, 000細胞/ミリリットルの密度で懸濁します。

次に、ハックアルギン酸溶液の5倍の容量で塩化カルシウム溶液を調製します。ハックアルギン酸塩が準備されている間、溶液をゆっくりと攪拌し続けます。ハックアルギン酸溶液を22ゲージの針に取り付けられた12ミリリットルの注射器にピペットで移します。

塩化カルシウムの準備ができたら、シリンジの先端を塩化カルシウム溶液の表面から約6インチ上に保持します。シリンジの高さがオーバーしました。塩化カルシウム溶液は本当に重要です。

十分に高く保持しないと、ビーズは球形で形作られません。次に、ハックアルギン酸塩混合物を追加します。滴下。典型的には、ビーズの結果は直径2ミリメートルで、ビーズごとに約10〜4番目の細胞があります。

ビーズの完全性を高めるために、ビーズを溶液中で20〜25分間攪拌します。ビーズの攪拌が終了したら、ビーズを沈殿させ、塩化カルシウム溶液からデカントします。次に、ビーズの約2〜3倍の容量で、ビーズを塩化ナトリウム溶液で2〜3回洗浄します。

フィルターを使用する代わりに、洗浄液の交換の間にビーズを沈殿させることで、ビーズを湿らせておきます。塩化カルシウム洗浄液を1回の洗浄液と軟骨細胞分化培地で追跡します。次に、へらを使用して、ビーズを培養皿に移し、ビーズを48時間培養し、軟骨細胞増殖培地を軟骨細胞に切り替えます。

滑液、滑液を含む分化培地は、収穫直後に調製する必要があります。新鮮な滑液を15ミリリットルのチューブに移し、すぐに3000RPMで15分間遠心分離します。細胞の破片を除去するために、上清はきれいな滑液であり、液体を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに分注して、滑液の最適な濃度が決定されるまで摂氏マイナス80度で保存します。

滑液と軟骨細胞の分化、アスコルビン酸と塩化カルシウムの培養物を一定濃度でさまざまな体積比で培地とするさまざまな培地を使用します。37°Cのインキュベーターのロッキングプラットフォーム上のプレート。古いメディアを取り外す前に、2〜3日ごとにメディアを交換してください。

塩化カルシウム溶液で希釈すると、粘度が下がり、偶然にもビーズの完全性が強化されます。次に、プレートからゆっくりとピペットで移します。ビーズは、増殖マトリックスの産生と実験の目的に応じて、収穫前に最大4週間培養できます。

遺伝子発現または組織学的解析のためにアルギン酸ビーズからハックを採取する場合は、遺伝子発現解析用のフィルターを使用せずに、アルギン酸ビーズを塩化カルシウム溶液で3回洗浄してください。軟骨細胞をビーズの4〜5倍の容量でクエン酸ナトリウムに浸して、軟骨細胞を単離します。混合物を20〜30分間撹拌し、次に15ミリリットルのチューブ内の細胞をスピンダウンします。

上清を廃棄し、従来のキットから細胞ペレットと細胞溶解バッファーを再懸濁し、標準化されたRNA精製プロトコルを進めて、洗浄したビーズを固定用に調製します。塩化カルシウム洗浄後、Wash Inc. Chondro分化培地を一晩使用してください。

ビーズを2ミリリットルの70%エタノールに摂氏4度で15分以上固定し、ダッピー染色の組織学的分析を進めます。アルギン酸ビーズをDAPI溶液中で1時間、穏やかに揺さぶってインキュベートします。次に、ビーズを塩化カルシウム溶液で3回洗浄してから、蛍光顕微鏡でアルギン酸ビーズを視覚化します。

ビーズはIan Blueのために切片化することもでき、明視野画像を重ねて重ね合わせた薄汚れたアルギン酸ビーズの組織学的切片化は、滑液を欠く培地から完全に滑液に基づく培地まで、すべての条件下で培養されたビーズ内の細胞が均一に分布していることを示しました。21日間の培養期間の終わりに、以前の報告と一致する変形性関節症の6人の患者からプールされた、滑液で培養されたヒト関節軟骨細胞から遺伝子発現を測定しました。0日目の軟骨細胞は、軟骨細胞の分化を伴う軟骨細胞の軟骨マトリックス遺伝子の3D培養、滑液を補給した中または中程度の軟骨遺伝子発現を有意に増加させたコラーゲン2つのacanおよびMMP13の軟骨遺伝子発現を発現し、軟骨細胞の赤分化を示しています。

21日目までに、培地中の滑液の割合を増やすと、同等のレベルの軟骨マトリックスマーカーが得られました。コラーゲン2種、ANDCAN mRNA発現率100%滑液中で培養した軟骨細胞は、培地単独で培養したものと比較して軟骨分解酵素MMP13mRNA発現の低下さえ示した。興味深いことに、細胞死指標であるカスパーゼ3の発現レベルは、滑液の割合の増加に伴って徐々に減少し、滑液の培養がアポトーシスレベルの低下につながったことが示唆されています。

したがって、ヒトの関節軟骨細胞と高レベルの滑液を3D環境で培養することは、実現可能な技術です。一度習得すると、カプセル化技術は完了するのに1時間もかかりません。メディア交換の合間にビーズをよく洗うようにする必要があります。

また、ピペットの使用中にビーズを傷つけないように注意したいものです。