Chromosomics：同時に新規OctoChrome FISHアッセイを使用した全24ヒト染色体における数値と構造変化の検出

Octa Chrome Fishアッセイでは、1枚のスライド上の単一のハイブリダイゼーションにより、ヒトの全24本の染色体を同時に検査します。まず、専用の8正方形スライド上に中期分裂像を調製します。次に、サンプルスライドの自動スキャンを行い、すべての中期分裂像の位置特定および、後のすべての細胞画像の再評価を容易にします。

次に、8方形スライドをOcta chromeデバイスの上に配置し、プローブをハイブリダイゼーションさせます。得られた結果では、ROデバイス上の染色体組み合わせの配置に基づき、各方形の中に3種類の異なるペイント染色体全体を表示させることができます。私がこのRO FISH法のアイデアを最初に思いついたのは、1990年代初頭にヒト集団研究にFISH法を適用し始めたときでした。

その後、私は1994年の年次AACRカンファレンスにおいて、3色染色法および細胞を配置するための8正方形スライドというアイデアを導入しました。従来の染色体曲げ法や最新のスペクトラルキャリブレーションのような既存の手法に対する本手法の主な利点は、より多くの細胞においてヒトの全24本の染色体を容易に解析できることです。まず、コントロールとして、懸濁状態で固定した中期細胞を準備し、細胞をピペットでスライド上に滴下して、適切な密度であることを確認します。

次に、8枚の正方形OCクロムに浸し、純エタノールに2分間スライドさせます。細胞の広がりが互いに干渉しないよう、テンプレートスライド上の正方形に交互に5 µLずつ細胞懸濁液を滴下します。隣接するペアをスポットする前に、サンプルを風乾させてください。

0.2 µg/mLのDAPI染色液を20 µLずつスライドの各半分の中央に滴下し、カバーガラスを被せます。次に、サンプルスライドの自動スキャンを行い、中期細胞を特定します。すべての中期細胞の位置特定および、後の細胞画像の再評価を容易にするために、metaverseソフトウェアを使用してください。

スキャン結果を手動で確認し、メタフェーズ（中期）ではないアーティファクトを削除します。まず、2X SSCバッファーでDPI染色を除去し、続いて一連のエタノール洗浄でサンプルを脱水します。スライドを風乾させた後、37 °Cのホットプレートに5分間置きます。

次に、クロマプローブ、マルチプローブハイブリダイゼーションチャンバー、およびハイブリダイゼーションバッファーを、ラベル側を下にして37 °Cのウォーターバスで平衡化します。OCクロマデバイスを37 °Cのホットプレート上に置きます。あらかじめ温めておいたハイブリダイゼーション溶液を、8つの各領域に2 µLずつ加えます。

テンプレートを慎重に反転させ、向きを合わせます。OCクロームデバイスの上にスライドさせます。テンプレートスライドがOcta Chromeデバイスに正しく配置されていることを確認してください。

次に、スライドをハイブリダイゼーション溶液の液滴の上に慎重に下ろし、軽く均等に圧力をかけて、OCクロームデバイスの各隆起部分の端までハイブリダイゼーション溶液を広げます。ガラススライドの曇りガラス端を持ち上げて反転させ、スライドがOCクロームデバイスの下に来るようにします。37 °Cに設定したホットプレートの上に10分間置きます。

その後、75 °Cに設定したホットプレートに5分間置きます。ハイブリダイゼーション工程のためにサンプルを変性させるため、Chroma Probeマルチプローブハイブリダイゼーションチャンバーに移します。蓋を閉め、チャンバーを37 °Cの恒温水槽に浮かべて一晩放置します。

デバイスからスライドを慎重に取り出し、72 °Cで2分間、0.4 excess SCで洗浄します。2回目の洗浄を室温で30秒間行います。続いて、スライドの各半分の中央に20 µLのDPIを滴下し、カバーガラスを被せます。

蛍光顕微鏡で観察する前に、サンプルを室温の暗所で10分間インキュベートします。Octa chrome fish assayを用いることで、1枚のスライド上の単一のハイブリダイゼーションにより、ヒトの全24本染色体を同時に検査することが可能です。各正方形には、異なる色の蛍光色素で直接標識された3種類の全染色体ペインティングプローブが含まれています。

Octa CHROシステムのスクエア2における正常な中期細胞の観察では、染色体 8、21、および 12 がそれぞれ赤、緑、青に染色されています。これらは各フィルターを用いて個別に可視化するか、あるいは DAPI Fitzy、Texas Red トリプルフィルターを通じて同時に可視化することができます。この染色体アプローチは、白血病特異的な染色体転座や異数性を伴う異常細胞の検出に有用です。

例えば、t(8;21)は急性骨髄性白血病における一般的な染色体転座です。21トリソミー（21番染色体が3コピー存在すること）は、白血病の発症後によく見られる異数性です。この手法は、分子細胞遺伝学および分子疫学分野の研究者が、白血病やリンパ腫で検出される最も一般的な染色体再構成を探索し、臨床患者または毒性化学物質に曝露した集団における全ヒト染色体の選択的倍数性を調査するための道を開きました。

このビデオを視聴することで、Octo Chrome Fishアッセイを用いて、1枚のスライド上の単一のハイブリダイゼーションでヒトの全24本の染色体を同時に検査する方法について十分に理解できるはずです。これを私たちは染色体として定義します。