Name: Chromosomics：同時に新規OctoChrome FISHアッセイを使用した全24ヒト染色体における数値と構造変化の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: 学ぶOcta Chrome FISHアッセイによる全24ヒト染色体の同時解析法。1枚のスライドで単一ハイブリダイゼーションにより染色体数異常と構造異常を検出し、白血病やリンパ腫の研究に応用できます。

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著者らは、批判的に読み、原稿を編集するための博士Cliona M.マクヘイルに感謝します。この作品は、環境健康科学研究所、Lチャンに健康補助金R01ES017452の国立研究所によって資金を供給された。

1。サンプルスライドの準備<ul><li> OctoChrome FISHは含むが、培養された末梢血細胞、幹細胞/前駆細胞、および細胞株に限らず、ヒト細胞の分裂中期スプレッドの染色体の変化を調べるために設計されています。中期の細胞を逮捕するためにコルセミド処理を採用することにより、細胞を膨潤する低張処理し、約0.5×10 6細胞懸濁液で細胞を固定するためのカルノア固定液：サンプルは分裂3,11-13を収集するための標準手順に従って準備する必要がありますmlあたり。 </li><li> 2分間純エタノールに浸漬：8平方スライド（PMP 803、Cytocell株式会社は、英国ケンブリッジ、図2 OctoChromeキットで提供され、カタログ＃）を清掃してください。 </li><li>サンプルスライドを作成する前に、細胞密度を確認するにはスライド上に細胞を少量のドロップします。細胞密度が（あまりにも多くの重複セル）が高すぎる場合は、新鮮な固定液で懸濁液を希釈してください。細胞密度（細胞数が少なすぎる低すぎる場合スライド上のs）は、新鮮な固定液の少量の細胞をスピンダウンし、再懸濁する。 2月8日 - - 5分の3〜6分の4の正方形1月7日を交互シーケンスのテンプレートのスライドの8の各分野への細胞懸濁液をピペット5〜10μlの。最初の二つの正方形は、空気乾燥させていたら、同じ方法で残りの四角形を見つける。これは、互いに干渉するからセルのスプレッドを防ぐことができます。 </li><li>乾燥したスライドは、ハイブリダイゼーションの前に5年以上のために窒素雰囲気下で-20℃で保存することができます。 </li></ul> 2。自動化システムを使用して、中期の局在<ul><li>スライドの各半分の中央に4を20μl &#39;,6-ジアミジノ-2 - フェニルインドール（0.2μg/ ml）を適用し、カバースリップでカバーしています。 </li><li> Metaferソフトウェア（メタシステム、Altlussheim、ドイツ）を用いて分裂中期細胞をローカライズするためのサンプルスライドの自動スキャンを実行します。これは、すべての分裂と今後のすべてのセル画像の再評価の位置を容易にします。 </li><li>手動でスキャン結果を表示し、非分裂アーティファクトを削除します。 </li></ul> 3。ハイブリダイゼーション<ol><li>サンプルスライドとOctoChrome装置の準備</li><ul><li> DAPIを洗い流すために30分間室温で2×SSC緩衝液のサンプルスライドを浸します。 </li><li>エタノール洗浄（2 70％分ずつ、85％および100％エタノール）の一連のサンプルスライドを脱水、乾燥、37、5分間°C、ホットプレート上に配置することができます。 </li><li> 37°Cの水浴中でChromoprobeのマルチプローブハイブリダイゼーションチャンバー（OctoChromeキットで提供）を配置し、37と同じになるように°C（+ / - 1°C）。 </li><li> 37℃にOctoChromeデバイスごとに繰り返しピペッティングし、事前暖かい25μlのアリコートでハイブリダイゼーション溶液（OctoChromeキットで提供）ミックス</li><li>ホットプレート上でデバイスのラベル面を下に配置することにより、37°C​​まで（図2を参照してくださいOctoChromeキットで提供）は、各OctoChromeデバイスプレ暖かい。 tを触れないでください彼OctoChromeデバイスのエンボス面がプローブを含んでいるので。 </li></ul><li> OctoChromeデバイス上のサンプルスライドの位置（図2） </li><ul><li>それは37℃のまま予め温めておいたOctoChromeデバイス上の8つの領域のそれぞれに予め温めておいたハイブリダイゼーション溶液2μlを加え℃に</li><li>慎重に逆さまになりました数1は、OctoChromeデバイスの右上領域の上に配置されているようなOctoChromeデバイス上のテンプレートスライドを反転させる。正方形の1を見つけやすくするために、デバイス上のその位置はオレンジでマークされています。 </li><li>テンプレートのスライドを注意深くOctoChromeデバイス上でマッチング領域に揃えて配置されていることを確認してください。ハイブリダイゼーション溶液の滴スライドに接触するように慎重にOctoChromeデバイス上のスライドを下げる。ハイブリダイゼーション溶液はOctoChromeデバイス上で発生した領域のそれぞれの端に広がっていることを確認するために穏やかな、均一な圧力を適用します。 </li><li>持ち上げるスライド/ OctoChrome、慎重にスライドガラスのフロスト端を保持し、スライドがOctoChromeデバイスの下になるように反転させる。これはプローブの交差汚染を引き起こす可能性があり、デバイスがテンプレートのスライドを越えて塗抹しないことを確認してください。 </li><li> 37場所°C（+ / - 1℃）10分間ホットプレート。 </li></ul><li>変性</li><ul><li>それはレベルを保持するために特定の世話をしてホットプレートにサンプルスライド/ OctoChromeデバイスに転送します。サンプルスライド均等に接触するホットプレートを確認します。 </li><li> 75ホットプレート上で変性℃（+ / - 1°C）で5分間。 </li></ul><li>ハイブリダイゼーション</li><ul><li> Chromoprobeのマルチプローブハイブリダイゼーションチャンバー内の場所のサンプルスライド/ OctoChrome装置。 </li><li>蓋を交換し、37室をフロート°C（+ / - 1℃）の水浴（非 - 攪拌）で一晩。ご注意：ハイブリダイゼーションチャンバーの蓋を密封しないで、水浴上で蓋を密封しないでください。でハイブリダイズしないインキュベーター。これらの手順は、湿度を制御するために重要です。 </li></ul><li>ハイブリダイゼーション後の洗浄</li><ul><li>洗浄溶液の調製 解決策1：20倍拡大SSCを含むコプリン/ Hellendahl jarファイルを準備します。 72平衡℃（+ / - 1℃）の水浴中とpHを7.0に調整します。 解決策2：2×SSC、0.05％Tween 20を含むコプリン/ Hellendahl jarファイルを準備します。室温で放置することができます。 </li><li>スライドから慎重にOctoChromeデバイスを削除し、2分間解決方法1のスライドに配置します。 </li><li> 30秒間ソリューション2にスライドを配置します。 </li></ul></ol> 4。マウントと結果の可視化<ul><li>スライドの各半分の中心にDAPI液20μlを適用し、カバースリップを適用します。 </li><li>蛍光顕微鏡で表示する前に室温で10分間、暗所でインキュベートします。 </li></ul> 5。代表的な結果ふぃぎゅ再3Aは、広場2で正常分裂中期細胞を示しています。 （1） - （3）：染色体8、21、12、赤、緑、青を描いた、テキサスレッド、FITC、それぞれDEACフィルターを通して可視化された、（4）：DAPI / FITCを介して可視化/テキサスレッド、トリプルフィルター。一般的には、青色で塗装染色体はトリプルフィルターを通して明らかになっていない、特定のDEACフィルターの下に表示する必要があります。 図3Bは、白血病に特異的な染色体転座や異数性を持つ代表的な異常細胞を示しています。 （1）：T（8; 21）、急性骨髄性白血病の一般的な染色体転座（2）：21トリソミー、21番染色体の3つのコピー、白血病の一般的な異数性。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3619/3619fig1.jpg" /> 図1。OctoChromeデバイスと期待される染色体ペインティングの結果についての染色体の組み合わせのアレンジメント。 <img alt="図2" src= &quot;/ files/ftp_upload/3619/3619fig2.jpg&quot; /&gt; 図2。OctoChromeデバイス上のサンプルスライドの位置決め。 図3代表的な結果OctoChrome FISH（スクエア2）から得られた。 <img alt="図3A" src="/files/ftp_upload/3619/3619fig3A.jpg" /> 図3A。スクエア2に描かれた染色体8、12、21と正常細胞。 <img alt="図3B" src="/files/ftp_upload/3619/3619fig3B.jpg" /> 図3B。広場2で白血病に特異的な染色体転座や異数性を持つ代表的な異常な細胞。

<ol><li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization: past, present and future.</a> J. Cell. Sci. 116, 2833-2838 (2003).</li>
<li>Zhang, L., Eastmond, D. A., Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+chromosomal+aberrations+detected+in+humans+exposed+to+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The nature of chromosomal aberrations detected in humans exposed to benzene.</a> Crit. Rev. Toxicol. 32, 1-42 (2002).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrations+in+chromosomes+associated+with+lymphoma+and+therapy-related+leukemia+in+benzene-exposed+workers%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Aberrations in chromosomes associated with lymphoma and therapy-related leukemia in benzene-exposed workers.</a> Environ. Mol. Mutagen. 48, 467-474 (2007).</li>
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<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+aneusomy+and+long+arm+deletion+of+chromosomes+5+and+7+in+the+lymphocytes+of+Chinese+workers+exposed+to+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Increased aneusomy and long arm deletion of chromosomes 5 and 7 in the lymphocytes of Chinese workers exposed to benzene.</a> Carcinogenesis. 19, 1955-1961 (1998).</li>
<li>Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+translocations+and+aneusomy+in+chromosomes+8+and+21+among+workers+exposed+to+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Increased translocations and aneusomy in chromosomes 8 and 21 among workers exposed to benzene.</a> Cancer. Res. 58, 2176-2181 (1998).</li>
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<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+aneuploidy+study+%28CWAS%29+in+workers+exposed+to+an+established+leukemogen%2C+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide aneuploidy study (CWAS) in workers exposed to an established leukemogen, benzene.</a> Carcinogenesis. 32, 605-612 (2011).</li>
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<li>Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroquinone%2C+a+benzene+metabolite%2C+increases+the+level+of+aneusomy+of+chromosomes+7+and+8+in+human+CD34-positive+blood+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Hydroquinone, a benzene metabolite, increases the level of aneusomy of chromosomes 7 and 8 in human CD34-positive blood progenitor cells.</a> Carcinogenesis. 21, 1485-1490 (2000).</li>
<li>Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+benzene+health+effects+and+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Public.+Health%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding benzene health effects and susceptibility.</a> Annu. Rev. Public. Health. 31, 133-148 (2010).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

この小説OctoChrome-FISHアッセイは1つが同時に複数のスライド上の単一のハイブリダイゼーションに全24ヒト染色体を調べることができます。 8マスに染色体の組み合わせの配置は、最も一般的な白血病およびリンパ腫の非ランダムな染色体再配列の識別を容易にするために設計されています。したがって、このアッセイは、同時に数値（異数性）だけでなく、構造（転座）染色体の変化を検出することができます。 このアッセイにおいて最も重要なステップは、水浴中でフローティングチャンバー内で一晩ハイブリダイゼーションの間に湿度を制御している。 FISHプローブとハイブリダイゼーションバッファーには、簡単に湿度が低い場合には乾燥、または湿度が高い場合にはあまりにも多くの水分を吸収して希釈になります。どちらかの結果は、結果に悪影響を及ぼす可能性があります。この課題を克服するための可能な変更は、テープでOctoChromeデバイスおよびサンプルスライドを密封し、37℃でハイブリダイズすることです。、暗い晩のCホットプレート。 あまりにも熟成されたサンプ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td><tr><tr><td> OctoChromeキット</td><td> Cytocell株式会社は、英国ケンブリッジ、 </td><td> PMP 803 </td><td></td></tr><tr><td>フィトヘマグルチニン（PHA） </td><td>インビトロジェン株式会社</td><td> 10576-015 </td><td></td></tr><tr><td>コルセミド</td><td>インビトロジェン株式会社</td><td> 15212-012 </td><td></td></tr><tr><td>カルノア固定液</td><td></td><td></td><td>メタノール：氷酢酸= 3：1 </td></tr><tr><td>蛍光マイルcroscope </td><td></td><td></td><td>同時に異なる色を表示するには、DAPI、テキサスレッド、FITC、およびクマリンスペクトル個別DAPI / FITC /テキサスレッドトリプルフィルタを表示するには、フィルタを装備</td></tr><tr><td> Metaferソフトウェア</td><td>メタシステム、Altlussheim、ドイツ</td><td></td><td>異常をすべて分裂を見つけるために、再評価することが容易に</td></tr></tbody></table>

chromosomics：同時に新規octochrome fishアッセイを使用した全24ヒト染色体における数値と構造変化の検出

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

蛍光 in situハイブリダイゼーション （FISH）は細胞核1に中期または間期の染色体上に検出される特定のDNA配列を可能にする技術です。技術は、全体の染色体または特定の染色体領域にハイブリダイズするユニークな配列を有するDNAプローブを使用しており、古典的な細胞遺伝学への強力な補助としての役割を果たします。例えば、多くの以前の研究は、古典的な細胞遺伝学的分析2を使用して 、ベンゼン暴露、ベンゼン中毒の患者、およびベンゼンにさらされる労働者の健康との関連性白血病患者で増加した染色体異常を頻繁に検出を報告した。 FISHを用いて、白血病に特異的な染色体の変化は、ベンゼン誘発性白血病におけるcytogentic変化の重要な役割を示し、ベンゼン3月6日にさらされ、明らかに健康な労働者で上昇することが観察されている。 一般に、単一のFISHアッセイは、1つまたは少数の全体の染色体検査またはスライドごとに特定の遺伝子ので、複数のハイブリダイゼーションは、ヒト染色体のすべてをカバーするために複数のスライドに実施する必要があります。スペクトル核型分析（SKY）は、同時に全ゲノムの可視化が、特別なソフトウェアや機器の制限とその応用7の要件を可能にします。ここでは、新たなFISHアッセイ、我々はこのような染色体全体の異数性試験などの人間研究では、1つのスライド全24ヒト染色体の同時分析（CWAS）としてここで定義Chromosomicsに適用することができるOctoChrome-FISHを、記述し8。 ChromoprobeのマルチプローブシステムとしてCytocellにより市販されている方法の基礎は、3つの異なる全染色体ペイントプローブ（図1）を運び、それぞれが8マスに分割され、OctoChromeデバイスです。 3つのプローブの各々は、直接に異なる色の蛍光体、緑色（FITC）、赤（テキサスレッド）、青（クマリン）が付いています。 OctoChrom上で染色体の組み合わせの配置は、t（15; 17）は、t（8; 21;電子デバイスは、インスタンスt（22 9）は、最も一般的な白血病およびリンパ腫に見られる非ランダム染色体構造変化（転座）の識別を容易にするために設計されています）は、t（14; 18）9。また、染色体の数値の変化（異数性）を同時に検出することができます。対応するテンプレートのスライドは、中期スプレッドがバインドされているその上に8マス（図2）に分割され、OctoChromeデバイス上に配置されています。プローブとターゲットDNAは高温多湿のチャンバー内でハイブリダイズした時に変性し、全24ヒト染色体を同時に可視化することができる。 OctoChrome FISHは、白血病とリンパ腫の臨床診断のために、全ての染色体の異数性を検出するための有望な技術です。我々は、ベンゼンにさらされた中国人労働者のCWAS研究8,10のこの新しい染色体のアプローチを適用している。

新規蛍光<em&gt;その場で</em同時に、特に数値と染色体構造の変化、白血病とリンパ腫に関連付けられた特定の染色体転座の両方を調べて&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）法は、一つのハイブリダイゼーションの単一のデバイス上のすべての24のヒト染色体のうち、記載されています。

Chromosomics：同時に新規OctoChrome FISHアッセイを使用した全24ヒト染色体における数値と構造変化の検出

蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）は、細胞内の分裂期または間期の染色体において、特定のDNA配列を検出することを可能にする手法である。

Octa Chrome Fishアッセイでは、1枚のスライド上の単一のハイブリダイゼーションにより、ヒトの全24本の染色体を同時に検査します。まず、専用の8正方形スライド上に中期分裂像を調製します。次に、サンプルスライドの自動スキャンを行い、すべての中期分裂像の位置特定および、後のすべての細胞画像の再評価を容易にします。次に、8方形スライドをOcta chromeデバイスの上に配置し、プローブをハイブリダイゼーションさせます。得られた結果では、ROデバイス上の染色体組み合わせの配置に基づき、各方形の中に3種類の異なるペイント染色体全体を表示させることができます。私がこのRO FISH法のアイデアを最初に思いついたのは、1990年代初頭にヒト集団研究にFISH法を適用し始めたときでした。その後、私は1994年の年次AACRカンファレンスにおいて、3色染色法および細胞を配置するための8正方形スライドというアイデアを導入しました。従来の染色体曲げ法や最新のスペクトラルキャリブレーションのような既存の手法に対する本手法の主な利点は、より多くの細胞においてヒトの全24本の染色体を容易に解析できることです。まず、コントロールとして、懸濁状態で固定した中期細胞を準備し、細胞をピペットでスライド上に滴下して、適切な密度であることを確認します。次に、8枚の正方形OCクロムに浸し、純エタノールに2分間スライドさせます。細胞の広がりが互いに干渉しないよう、テンプレートスライド上の正方形に交互に5 µLずつ細胞懸濁液を滴下します。隣接するペアをスポットする前に、サンプルを風乾させてください。0.2 µg/mLのDAPI染色液を20 µLずつスライドの各半分の中央に滴下し、カバーガラスを被せます。次に、サンプルスライドの自動スキャンを行い、中期細胞を特定します。すべての中期細胞の位置特定および、後の細胞画像の再評価を容易にするために、metaverseソフトウェアを使用してください。スキャン結果を手動で確認し、メタフェーズ（中期）ではないアーティファクトを削除します。まず、2X SSCバッファーでDPI染色を除去し、続いて一連のエタノール洗浄でサンプルを脱水します。スライドを風乾させた後、37 °Cのホットプレートに5分間置きます。次に、クロマプローブ、マルチプローブハイブリダイゼーションチャンバー、およびハイブリダイゼーションバッファーを、ラベル側を下にして37 °Cのウォーターバスで平衡化します。OCクロマデバイスを37 °Cのホットプレート上に置きます。あらかじめ温めておいたハイブリダイゼーション溶液を、8つの各領域に2 µLずつ加えます。テンプレートを慎重に反転させ、向きを合わせます。OCクロームデバイスの上にスライドさせます。テンプレートスライドがOcta Chromeデバイスに正しく配置されていることを確認してください。次に、スライドをハイブリダイゼーション溶液の液滴の上に慎重に下ろし、軽く均等に圧力をかけて、OCクロームデバイスの各隆起部分の端までハイブリダイゼーション溶液を広げます。ガラススライドの曇りガラス端を持ち上げて反転させ、スライドがOCクロームデバイスの下に来るようにします。37 °Cに設定したホットプレートの上に10分間置きます。その後、75 °Cに設定したホットプレートに5分間置きます。ハイブリダイゼーション工程のためにサンプルを変性させるため、Chroma Probeマルチプローブハイブリダイゼーションチャンバーに移します。蓋を閉め、チャンバーを37 °Cの恒温水槽に浮かべて一晩放置します。デバイスからスライドを慎重に取り出し、72 °Cで2分間、0.4 excess SCで洗浄します。2回目の洗浄を室温で30秒間行います。続いて、スライドの各半分の中央に20 µLのDPIを滴下し、カバーガラスを被せます。蛍光顕微鏡で観察する前に、サンプルを室温の暗所で10分間インキュベートします。Octa chrome fish assayを用いることで、1枚のスライド上の単一のハイブリダイゼーションにより、ヒトの全24本染色体を同時に検査することが可能です。各正方形には、異なる色の蛍光色素で直接標識された3種類の全染色体ペインティングプローブが含まれています。Octa CHROシステムのスクエア2における正常な中期細胞の観察では、染色体 8、21、および 12 がそれぞれ赤、緑、青に染色されています。これらは各フィルターを用いて個別に可視化するか、あるいは DAPI Fitzy、Texas Red トリプルフィルターを通じて同時に可視化することができます。この染色体アプローチは、白血病特異的な染色体転座や異数性を伴う異常細胞の検出に有用です。例えば、t(8;21)は急性骨髄性白血病における一般的な染色体転座です。21トリソミー（21番染色体が3コピー存在すること）は、白血病の発症後によく見られる異数性です。この手法は、分子細胞遺伝学および分子疫学分野の研究者が、白血病やリンパ腫で検出される最も一般的な染色体再構成を探索し、臨床患者または毒性化学物質に曝露した集団における全ヒト染色体の選択的倍数性を調査するための道を開きました。このビデオを視聴することで、Octo Chrome Fishアッセイを用いて、1枚のスライド上の単一のハイブリダイゼーションでヒトの全24本の染色体を同時に検査する方法について十分に理解できるはずです。これを私たちは染色体として定義します。

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