複数の蛍光によるインター染色体安定型異常の検出

この分子細胞遺伝学的手法の全体的な目的は、全身照射を受けたマウスの骨髄細胞における染色体間安定異常を観察することです。本法は、全身放射線に曝露したマウスの骨髄細胞において安定的な染色体異常が誘発されるリスクなど、放射線生物学分野における重要な疑問の解決に寄与します。この技術の主な利点は、多くの細胞世代にわたって受け継がれる、放射線誘発性の安定的な遺伝的損傷を、マウスの骨髄細胞において視覚的に確認できることです。

テキストプロトコルに従ってマウスの大腿骨および脛骨から骨髄を分離し、単一細胞懸濁液を作製した後、細胞懸濁液を同量の手法による骨髄単核細胞分離用培地の上に慎重に重層します。この密度勾配を室温で400 ×gにて30分間遠心分離します。その後、他の層を乱さないようにバフィーコートを慎重に回収し、その溶液を新しい15 mL遠心チューブに移します。

メタフェース細胞分散標本を調製するには、バフィーコートを含むチューブに10 millilitersのPBSを加えます。次に、チューブを室温で400 times Gで5分間遠心分離します。続いて、上清を慎重に取り除き、チューブを軽く叩いて細胞ペレットを分散させます。

次にPBSを10 milliliters加え、懸濁液を再び遠心分離します。細胞ペレットを乱さないように上清を除去してください。ペレットを分散させ、穏やかに絶えず振盪しながら、あらかじめ加温した0.075 molar塩化カリウム低張溶液4 millilitersを滴下して加えます。

細胞懸濁液をウォーターバスを用いて37°Cで20分間インキュベートします。次に、等量の固定液をチューブに加え、チューブを転倒させて緩やかに混ぜ合わせます。チューブを遠心分離し、上清を除去します。

次に、細胞ペレットを分散させ、新鮮な固定液を加えます。遠心分離と固定液の添加をさらに5回繰り返します。細胞を400～600 µLの固定液に再懸濁した後、固定した細胞 30 µLを、45度の角度に傾けた洗浄済みで湿ったスライドガラス上に滴下し、一晩かけて完全に自然乾燥させます。

mFISHによるマウス染色体ペインティングを行うため、中期細胞を分散させたスライドを2X SSCに浸し、室温で2分間置きます。次に、70%、80%、100%のエタノールで順次2分間ずつ洗浄し、スライドを脱水します。40 mLの変性溶液をガラス製コプリンジャーに入れ、70 °Cで30分間予熱しておきます。

次に、スライドをあらかじめ温めておいた溶液に移し、染色体を変性させるため、サンプルを1分から1分30秒間インキュベートします。直ちに氷冷した70%ethanolを用いてスライドを2分間クエンチし、変性プロセスを停止させ、変性した染色体の再アニーリングを防ぎます。その後、80%ethanolから始まるエタノール系列を用いて、スライドを2分間脱水します。

次に、スライドを100% ethanolに2分間浸します。その後、室温でスライドを完全に乾燥させます。プローブを変性させるために、メーカー提供のプローブ混合液を短時間遠心分離し、10 µLを500 µLスナップキャップ遠心チューブに移し、80 °Cのウォーターバスで7分間インキュベートします。

次に、変性させたプローブが入ったチューブを37°Cのウォーターバスで10分間保温します。その後、プローブ混合液を変性させた染色体が載っているスライドガラスに滴下します。18 mm × 18 mmのガラスカバースリップでその領域を慎重に覆い、カバースリップをスライドに非常にゆっくりと押し付けることで、目に見える気泡をすべて取り除きます。

ラバーセメントを用いて、カバーガラスの4辺すべてを密封します。その後、スライドを湿潤チャンバーに入れ、37 °Cの暗所で12〜16時間インキュベートします。ハイブリダイゼーション後、ラバーセメントとカバーガラスを慎重に除去し、スライドを74 °Cに予熱した0.4X SSCに5分間浸します。

次に、スライドを洗浄液3に2分間浸します。DAPI対比染色の入った抗退色封入剤を20 µLスライドに滴下し、ガラスカバースリップで覆います。ラボペーパーを用いてカバースリップを軽く押し、気泡と過剰な封入剤を取り除きます。

次に、ネイルポリッシュを用いてカバーガラスの縁を封印します。適切なフィルターを備えた蛍光顕微鏡を用いてスライドを観察してください。マウス染色体のスペクトラル核型分析（SKY）の場合、プローブが変性した染色体にハイブリダイズし、テキストプロトコルに従ってサンプルを洗浄した後、80 µLのSY5染色試薬をスライドに塗布します。

24 × 60 mmのプラスチックカバーガラスをサンプルの上に置き、加湿したチャンバー内にて37 °Cで40分間、暗所でインキュベートします。あらかじめ温めておいた洗浄液3を入れたガラス製コプリンジャーにスライドを浸し、45 °Cの水槽で2分間、振盪しながらインキュベートします。この洗浄工程を3回繰り返します。

80 µLのSY5.5染色試薬をサンプルに滴下し、24 × 60 mmのプラスチックカバーガラスで覆い、加湿チャンバー内にて37 °Cで40分間暗所でインキュベートします。あらかじめ加温しておいた洗浄液3を用いてスライドを3回洗浄し、その後、スライドをペーパータオルに対して傾けた状態で保持し、余分な液を切り捨てます。20 µLの抗退色DAPI試薬をサンプルに加え、気泡が入らないように注意しながらガラスカバーガラスを上に被せます。

ネイルポリッシュを使用して端を封入し、スカイ画像をキャプチャするための装置を備えたエピ蛍光顕微鏡でサンプルを観察します。この図は、正常および異常なマウス染色体1番、2番、および3番の代表的な中期細胞の拡げを示しています。ここでは、染色体1番の一部が非染色されたDAPI染色体に組み込まれ、別の部分が無中心性断片を形成している、染色体1番に関与する安定的な転座を示しています。

この例では、2番染色体の一部が非染色（non-painted）染色体に組み込まれています。この安定型転座には3番染色体が関与しています。このメタフェーズ展開では、3本の染色された染色体すべてに関与する安定型転座が見られます。

ここでは、正常な雌マウスのスペクトラカリオタイピングの例を示します。このパネルは、第4染色体と第12染色体に関与する安定的な転座を示しています。最後に、このパネルの安定的な染色体異常は、第7染色体と第10染色体に関与しています。

この手法を習得すれば、適切に行うことで48〜72時間以内に完了させることができます。この手順を行う際は、増殖細胞のみを使用する必要があることに留意することが重要です。本手順およびインバンド法などの他の手法を用いることで、照射細胞に染色体間安定型異常が存在するかどうかなど、さらなる疑問を検討することが可能です。

この技術の開発により、分子細胞遺伝学分野の研究者が、遺伝子異常とさまざまな疾患との関連性を探求するための道が開かれました。このビデオを視聴することで、染色体間の安定的な異常をどのように判定するかについて、より明確な理解が得られるはずです。コルヒチンは発がん性物質であり、取り扱いには極めて危険が伴うため、この実験を行う際は常に手袋を着用するなどの予防策を講じることを忘れないでください。