複数の蛍光によるインター染色体安定型異常の検出その場でハイブリダイゼーション（mFISH）と照射されたマウスにおけるスペクトル核型分析（SKY）
2017年1月11日
現在のプロトコルは、全身照射への曝露後のマウスの骨髄細胞における染色体間安定異常の同定における多重蛍光in situハイブリダイゼーション(mFISH)およびスペクトル核型分析(SKY)の有用性を説明しています。
この分子細胞創生法の全体的な目標は、全身放射線に曝露されたマウスの骨髄細胞における染色体間安定異常を観察することです。この方法は、全身放射線に被ばくしたマウスの骨髄細胞に安定した染色体異常を誘発するリスクなど、放射線生物学分野における重要な問題に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マウスの骨髄細胞における放射線誘発性の安定した遺伝的損傷を、多くの細胞世代を通じて伝播させることができることを、ガイド付きで可視化できることです。
マウスの大腿骨および脛骨から骨髄を単離し、テキストプロトコルに従って単一細胞懸濁液を作製した後、細胞懸濁液を等量の骨髄単核細胞分離培地に慎重に重ねます。グラジエントをGの400倍にして室温で30分間遠心分離します。次に、残りの層を乱さずにバフィーコートを慎重に収集し、溶液を新しい15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。
中期細胞スプレッドを調製するには、バフィーコートを含むチューブに10ミリリットルのPBSを追加します。次に、チューブを室温で400倍Gで5分間遠心分離します。次に、上清を慎重に取り除き、チューブを軽くたたいて細胞ペレットを砕きます。
次に、10ミリリットルのPBSを追加し、懸濁液を再度遠心分離します。細胞ペレットを乱さずに上清を取り除きます。ペレットを分割し、穏やかで一定の振とうをしながら、予め温めた低張性0.075モル塩化カリウム溶液を4ミリリットルずつ滴下します。
細胞懸濁液を摂氏37度で水浴中で20分間インキュベートします。次に、チューブに等量の固定剤を加え、チューブを反転させて穏やかに混合します。チューブを遠心分離し、上清を取り除きます。
次に、細胞ペレットを砕き、新しい固定剤を加えます。紡糸と固定剤の添加をさらに5回繰り返します。細胞を400〜600マイクロリットルの固定液に再懸濁した後、30マイクロリットルの固定細胞を45度の角度で傾けた事前に洗浄された湿ったスライドに落とし、スライドを一晩で完全に風乾させます。
mFISHによるマウス染色体ペインティングを行うには、中期細胞を広げたスライドを室温で2X SSCに2分間置く。次に、スライドを70%80%および100%エタノールで2分間連続エタノール洗浄することにより、スライドを脱水します。ガラスコプリンジャー内の変性溶液40ミリリットルを摂氏70度に30分間予熱します。
次に、スライドを予熱した溶液に移し、サンプルを1〜1 1/2分間インキュベートして染色体を変性させます。すぐに氷冷した70%エタノールを使用してスライドを2分間急冷し、変性プロセスを停止し、変性した染色体が再アニーリングするのを防ぎます。次に、80%エタノールで始まるエタノールシリーズを使用してスライドを2分間脱水します。
次に、スライドを100%エタノールに2分間入れます。その後、スライドを室温で完全に乾かします。プローブを変性させるには、メーカーから提供されたプローブ混合物を短時間遠心分離し、次に10マイクロリットルを500マイクロリットルのスナップキャップ遠心チューブに移し、チューブを摂氏80度の水浴で7分間インキュベートします。
次に、変性プローブの入ったチューブを摂氏37度のウォーターバスに10分間入れます。次に、変性した染色体を含むスライドにプローブ混合物を塗布します。18 mm x 18 mm のガラス カバースリップで領域を慎重に覆い、カバースリップをスライドに非常に優しく押し付けて、目に見える気泡を取り除きます。
ゴムセメントを使用して、カバーガラスの4面すべてをシールします。そして、スライドを暗所で摂氏37度の加湿チャンバーで12〜16時間インキュベートします。ハイブリダイゼーション後、ゴムセメントとカバーガラスを慎重に取り除き、スライドを予熱した摂氏74度の0.4X SSCに5分間置きます。
次に、スライドを洗浄液に3回、2分間移します。DAPIカウンターステイン入りの退色防止封入剤20マイクロリットルをスライドに加え、ガラスカバースリップで覆います。ラボティッシュペーパーを使用してカバースリップをそっと押し、気泡や余分な取り付け液を取り除きます。
次に、マニキュアを使用してカバーガラスの端をシールします。適切なフィルターを装備した蛍光顕微鏡を使用してスライドを表示します。マウス染色体のスペクトル核型解析では、プローブを変性染色体上にハイブリダイズし、サンプルをテキストプロトコルに従って洗浄した後、80マイクロリットルのSY5染色試薬をスライドに塗布します。
サンプルの上に24 x 60 mmのプラスチック製カバースリップを置き、37°Cの加湿チャンバー内で暗所で40分間インキュベートします。スライドを予熱した洗浄液3が入ったガラス製のコプリンジャーに浸し、摂氏45度の水浴中で2分間振とうしながらインキュベートします。洗濯を3回繰り返します。
サンプルに80μLのSY5.5染色試薬を塗布し、24×60mmのプラスチックカバースリップで覆い、37°Cの加湿チャンバー内で暗所で40分間インキュベートします。予熱した洗浄液3を使用してスライドを3回洗浄し、スライドをペーパータオルに対して傾けた状態で保持し、余分な液体を排出します。20マイクロリットルの退色防止DAPI試薬をサンプルに加え、気泡が入らないようにガラスカバースリップを慎重に上に置きます。
マニキュアを使用してエッジをシールし、空の画像をキャプチャするために装備された落射蛍光顕微鏡でサンプルを観察します。この図は、マウス染色体ペアが正常、2、3の正常および異常な中期細胞の広がりを示しています。これは、染色体1が関与する安定した収差で、染色体1の一部が非塗装DAPI染色体に統合され、別の部分が非中心フラグメントを形成しています。
この例では、2番染色体の一部が非塗装染色体に統合されています。この安定な異常には、3番染色体が関与しています。この中期スプレッドでは、3つの塗装染色体すべてが関与する安定収差が見られます。
ここに示されているのは、正常な雌マウスのspectro核型分析の例です。このパネルは、4番染色体と12番染色体が関与する安定した収差を表しています。最後に、このパネルの安定した染色体異常には、7番染色体と10番染色体が関与しています。
このテクニックを習得すると、適切に行えば48〜72時間以内に行うことができます。この手順を試みる際には、増殖している細胞のみを使用する必要があることを覚えておくことが重要です。この手順に従い、バンドなどの他の方法を使用して、照射された細胞に染色体間安定異常が存在するかどうかなどの追加の質問に答えることができます。
その開発後、この技術は、分子細胞遺伝学の分野の研究者が遺伝的異常とさまざまな疾患との関連を探求する道を開きました。このビデオを見た後、染色体間安定収差を決定する方法がより明確になるはずです。コルヒチンは発がん性物質であるため、コルヒチンの使用は非常に危険であり、この実験を行う際には常に手袋を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
このプロトコルは、総身放射線照射後のマウスの骨髄細胞における染色体間安定異常を識別するために、複数蛍光in situハイブリダイゼーション（mFISH）とスペクトル核型分析（SKY）の適用を概説しています。この方法は、放射線被曝の遺伝的影響を理解する上で重要です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 放射線生物学
- 細胞遺伝学
- 分子生物学
背景
- 安定染色体異常は放射線被曝によって誘発される可能性があります。
- 骨髄細胞は遺伝的損傷の研究に重要です。
- これらの異常を理解することは放射線リスクを評価するのに役立ちます。
- mFISHとSKYは遺伝的変化を視覚化する高度な技術です。
研究の目的
- 骨髄細胞における染色体間安定異常を観察すること。
- 総身放射線照射による安定染色体損傷のリスクを評価すること。
- 遺伝的損傷のガイド付き視覚化の方法を提供すること。
使用された方法
- マウスの股関節と脛骨から骨髄の分離。
- 単一細胞懸濁液の調製。
- 骨髄単核球分離培地の使用。
- 分析のためのバッフィーコートを収集するための遠心分離。
主要な結果
- 被曝細胞における安定染色体異常の同定。
- mFISHとSKY技術の有効性の実証。
- 細胞世代を超えた遺伝的損傷の伝播に関する洞察。
- 放射線誘発遺伝リスク理解への貢献。
結論
- mFISHとSKYは放射線影響を研究するための価値あるツールです。
- 安定異常は複数の細胞分裂を通して追跡できます。
- この研究は放射線被曝の長期的影響を評価するのに役立ちます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Detection of stable chromosomal aberrations in irradiated bone marrow cells provides critical data for assessing long-term genetic risks in preclinical radiation safety studies. The mFISH and SKY techniques enable visualization of inter-chromosomal translocations that persist across cell generations, supporting mechanistic de-risking in target validation pipelines. This approach enhances predictive confidence by linking radiation exposure to stable genomic alterations relevant to carcinogenesis and therapeutic response modeling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of radiation-induced genomic instability as a biomarker for DNA repair pathway efficacy.
- Operational Value: Provides a reproducible method to detect stable aberrations that may correlate with oncogenic transformation risk.
- Predictive Value: Supports assessment of compound-induced genotoxicity by visualizing chromosomal translocations in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of stable aberration frequency per cell, enabling dose-response modeling.
- Operational Value: Standardized chromosome painting protocols allow inter-laboratory comparability in genotoxicity screening.
- Scalability: Metaphase spread preparation and hybridization steps can be adapted for high-content imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Tracks propagation of stable aberrations through multiple cell divisions, informing clonal evolution models.
- Operational Value: Enables longitudinal monitoring of genetic damage in bone marrow-derived cell populations.
- Translational Continuity: Aberration patterns observed in mice can inform human-relevant radiation biodosimetry frameworks.
Pipeline & Workflow Integration
The mFISH and SKY methods integrate into preclinical safety assessment workflows following in vivo irradiation studies, bridging phenotypic observation with molecular cytogenetic analysis. These techniques are positioned post-exposure and pre-analytical validation to confirm genomic integrity of bone marrow-derived cells used in downstream functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding radiation-induced chromosomal rearrangements and their persistence in stem/progenitor cell compartments.
- Screening: Delivers assay-ready metaphase spreads with quantifiable aberration counts for compound library profiling.
- Analytics: Generates karyotype-specific imaging data and DAPI counterstained images enabling automated translocation scoring.
- Translational Research: Connects murine cytogenetic endpoints to human-relevant biomarkers of genomic instability in radiation-exposed tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cytogenetic platform for evaluating genotoxic potential across radiation modifiers, radioprotectors, and DNA damage response inhibitors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly visualizing stable inter-chromosomal exchanges undetectable by conventional staining.
- Operational Value: Enables standardization of chromosome preparation, hybridization, and imaging across multiple sites.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing evidence of chromosomal translocations that may indicate leukemogenic risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on low-aberration profiles in irradiated bone marrow models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromosome spreading, fluorescence microscopy, and spectral imaging analysis.
- Dependent on access to mFISH/SKY probe sets, epifluorescence or spectral microscopy systems, and antifade mounting reagents.
- Necessitates standardization of bone marrow isolation, metaphase arrest, and slide preparation across user groups.
- Adaptation to alternative tissue types (e.g., spleen, lymph nodes) may require optimization of hypotonic treatment and fixation steps.
- Limited to proliferating cells; quiescent or non-dividing populations require alternative methods to assess stable aberrations.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Isolation of Bone Marrow Mononuclear Cells by Density Gradient Centrifugation and Preparation of Metaphase Cell Spreads
3:04
Mouse Chromosome Painting by mFISH
6:07
Spectral Karyotyping of Mouse Chromosomes
7:45
Results: Inter-chromosomal Stable Aberration Analysis by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization and Spectral Karyotyping
9:02
Conclusion
