タリイメージベースのメーターを用いたGFPの発現と生存率の評価
November 17th, 2011
このプロトコルは、細胞の生存と距骨イメージベースサイトメーターを用いて蛍光発現アッセイを実行する方法について説明します。
このビデオでは、タリー画像ベースのサイトメーターを使用して、GFPを発現する細胞の生存率を測定する手順を示しています。GFP形質導入細胞は、すべての死細胞をヨウ化プロピジウムで赤く染色するタリー生存率キットデッドセルレッドを使用して染色し、細胞をタリー細胞分析スライドにピペットで移し、サイトメーターにロードして、明視野および赤と緑の蛍光画像を取得して分析します。次に、従来のフローサイトメトリーと比較した場合の細胞数、細胞サイズ、PI蛍光強度、およびGFP蛍光強度を表示するためのヒストグラムが生成されます。
Taliは、細胞の生存率と発現に関して同様のデータを提供できます。しかし、この画像ベースのサイトメトリーは、検査対象の細胞集団に関する追加の視覚情報を提供します。フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡法などの既存の方法と比較した場合、この手法の主な利点は、タリー画像ベースのサイトメーターが細胞サンプルに関する定量的情報と視覚情報の両方を同時に提供できることです。
さらに、このタリー装置は、フローサイトメーターや蛍光顕微鏡よりも使いやすく、安価で、設置面積も小さくなっています。これにより、研究者はベンチトップ上でGFP発現細胞の生存率などの定量的アッセイを迅速に行うことができます。この手順では、10〜6細胞/ミリリットルの1倍の濃度のU2 OS細胞に核標的細胞光GFPウイルスコンストラクトを形質導入し、ヨウ化プロピジウムで死細胞を維持し、細胞懸濁液の100マイクロリットルを新しいマイクロ遠心チューブに移しました。
なお、アッセイには1ミリリットルあたり10〜5〜5〜10×10〜7分の1の濃度が推奨されますが、その濃度は正確である必要はありません。次に、1マイクロリットルのタリーデッドセルレッド試薬を追加します。その後、短時間ボルテックスして混合し、染色試薬と細胞混合物を室温で暗所で1〜5分間インキュベー
トします。インキュベーション後、すぐにタリー画像ベースのサイトメーターでの分析に進みます。この集計には、この装置専用に設計された使い捨てのプラスチック製細胞分析スライドが使用されています。スライドをロードするには、常にスライドの端
を持ってください。25マイクロリットルのサンプルを半月形のサンプルローディングエリアの1つにゆっくりとピペットで移します。ここでは、未染色の非形質導入コントロール細胞をチャンバーAにロードし、染色したGFP発現細胞をチャンバーにロード B.To、GFP発現細胞の生存率アッセイを行い、サイトメーターのホーム画面でG-F-P-R-F-Pをタッチする。その後、アッセイオプションが右側に表示され、GFPと生存率を選択します。
次に、装置は、サンプルシリーズに名前を付けるためにサンプルシリーズに名前を付ける必要があるかどうかを尋ねます。今すぐ名前を押してください。次に、タッチスクリーンを使用してサンプルシリーズの名前を入力し、保存を押すと、タリーサイトメーターは自動的に測定画面に進みます。
次に、背景蛍光を測定するには、このように測定画面の右下半分にある背景タブを押します。デフォルト設定では、セルの 9 つのフィールドが画像化されます。次に、コントロールサンプルを装置の反対側に向けて、スライドをローディングポートに停止するまで挿入します。
背景画面に力を加えないでください、タッチを押して新しい未染色のセルコントロールを挿入します。スライドは自動的に装置に引き込まれ、セルのライブ画像が画面に表示されます。フォーカスノブを使用して、フォーカスしながらセルを適切な視野に持ってきます。
赤いズームボタンを4つのxまたは16つのxにスライドさせます。細胞集団をよりよく見るには、細胞を均一に暗くし、各細胞の周囲に明るいハローを配置する必要があります。ここに示すように、セルの背景とエッジの間の遷移があいまいで、セルの境界が明確に定義されていない場合、セルは過小評価される可能性があります。
セルは、中心が明るく、周囲が暗い場合、過大にカウントされる可能性があります。細胞にピントが合ったら、タッチして押すと、未染色の細胞コントロールが実行されます。バックグラウンド蛍光を測定するために、サイトメーターは自動的に画像をキャプチャし、各視野のサムネイルを表示します。
進行状況バーには、解析の継続的な更新が表示されます。画像キャプチャが完了すると、サイトメーターは自動的にスライドを排出し、キャプチャされた画像の解析からデータを提供します。保存されたデータは、バックグラウンドタブのドロップダウンメニューに表示されます。
バックグラウンドコントロールサンプルには、実験に付けられた名前と同じ名前が割り当てられます。PI染色GFP形質導入サンプルを実行するには、スライドを装置から取り外し、裏返して、形質導入サンプルを装置の反対側に向けて再度挿入します。サンプルタブを押してから、新しいサンプルを挿入するには[プレス]をタッチします。
画像が画面に表示されたら、フォーカスノブを使用してセルに焦点を合わせます。前と同じように、を押してサンプルを実行します。画像キャプチャが完了すると、解析のデータがサンプルタブに表示され、サイトメーターは自動的にスライドを適切に排出します。
タリー細胞解析スライドは廃棄します。バイオハザード廃棄物として、これらのスライドは再利用できません。サンプルを実行すると、サンプルにしきい値を適用できます。
ここで特定の細胞集団を分析するために、閾値を調整して生細胞と死細胞の割合を決定します。サンプルタブのGFP発現細胞では、GFPを発現する細胞とGFP全生存率を発現する死細胞の数と割合が表示されます。平均セルサイズ、カウントされたセル数、およびセル濃度が表示されます。
また、画面下部には、細胞サイズ、緑色蛍光、赤色蛍光を示すヒストグラムプロットが表示されます。セル サイズ ゲートを設定するには、セル サイズのサムネイルをタッチしてセル サイズ ヒストグラムを開き、破片を除外します。青いスライダーバーを動かして、大きなイベントと小さなイベントの両方を除外します。
[適用] をタッチして、ゲート内のセルを含めます。次に、GFP蛍光を解析に追加するには、GFPヒストグラムのサムネイルをタッチします。それを開きます。
青いスライダーバーを動かして、最も暗いピークのすぐ右側にしきい値を設定します。コントロールサンプルをガイドとして使用します。これにより、GFP陽性細胞を解析に含めることができますが、自己蛍光細胞は除外することができます。
自家蛍光は、細胞内の生体分子が優れている場合に頻繁に観察され、タッチを適用して確認し、前の画面に戻ります。サンプルタブの下に表示されるデータには、両方の蛍光チャンネルに設定されたゲートとしきい値が反映されているはずです。次に、PI染色細胞を自家蛍光またはサンプル中に存在する任意のバックグラウンドから分離するために、PIヒストグラムのサムネイルを押して再度開きます。
コントロールサンプルのピークは、ヒストグラムに灰色のピークとして表示されます。赤いピークはサンプルの蛍光です。バックグラウンド蛍光は、この装置ではゼロRFU値に最も近いピークとして表示されます。
PIチャンネルのバックグラウンド蛍光を除去するには、青色のスライダーバーを動かして閾値を調整します。このピークを除外するには、コントロールサンプルの灰色のピークを基準として使用します。PIチャネルのしきい値が適切に設定されている場合、[適用]をタッチして確認し、前の画面に戻ると、タリー機器は再びデータを自動的に再分析し、サンプルタブで結果を更新します。
次に、各セルが正しく割り当てられていることを視覚的に確認するために、ズームタブを押し、画像のサムネイルを押して、キャプチャした視野を選択してレビューします。次に、[レイヤー]タブを押します。次に、GFPまたはPIボタンを押して、そのチャネルでキャプチャされた画像を表示します。
同じボタンをもう一度押して、レイヤーをディスプレイから削除するか、レイヤーを重ね合わせるには、各チャネルに対応するボタンをタッチして、特定のチャネルを通じてセルがどのようにカウントされるかを識別します。タッチサークル 明視野チャネルのみでカウントされた細胞で、蛍光を発現しないものは青色で囲まれます。これは、特定の細胞が緑色チャネルで発現する生細胞であることを示しています。
GFPは、赤のチャネルで発現する緑色のセルで囲まれます。πで染色された細胞は赤で囲まれ、両方でカウントされた死細胞です。赤と緑のチャンネルは黄色で囲まれます。
これは、細胞がGFPを発現しているが、πで染色されているため、死んでいることを示しています。時折、画面に黒い円が表示されます。これらは、識別されたが、セル サイズに基づいて分析から除外されたオブジェクトです。
蛍光を発現している各細胞が適切な色で丸で囲まれるまで、前述の手順を使用して蛍光ヒストグラムのしきい値を微調整し続けます。すべての解析パラメータは、自動的に装置に保存されます。データタップの下。
集計には、500 回のサンプル実行のデータファイルを保存できます。[データ] タブに保存されている各ファイルは、再解析に使用できます。[データ] タブからファイルを選択すると、ファイルが再度開き、すべてのヒストグラムとレイヤーがアクティブになり、データをアーカイブしてレポートが生成されます。
機器に保存されているデータは、USBドライブを使用してコンピューターに転送できます。4つの代表的な細胞型を核標的細胞光で形質導入し、死細胞赤色試薬を使用してタリー生存率キットで染色したGFPウイルスコンストラクトで形質導入し、ここに示すようにフローサイトメーターでタリーによって分析しました。どちらの方法でも、GFPを発現していた各細胞タイプの集団の割合と、生存可能でGFPを発現していた全集団の割合がほぼ同じであることが報告されました。
これらのデータは、Taliサイトメーターが集団における総GFP発現と生集団におけるGFP発現を区別できることを示しています。タリー画像ベースのサイトメーターを使用して、細胞サンプルの蛍光発現と生存率を評価する方法を示しました。この技術は、個々の細胞研究と集団細胞研究の間のギャップを埋めます。
タリー画像ベースのサイトメーターを使用すると、個々の細胞だけでなく、より大きな細胞集団に関する定量的および定性的な視覚情報を収集できます。同じ手順を使用して、アポトーシス、RFP発現、および細胞生存率を含む他のいくつかのアッセイを実施することができる 非発現細胞の場合、潜在的なアプリケーションには、薬物有効性の研究への遺伝子発現の評価が含まれる。
概要
このプロトコルは、Taliイメージベースサイトメーターを使用して細胞生存能と蛍光発現アッセイを実施する方法を説明しています。この方法により、研究者は定量的および視覚的データの両方を使用して細胞集団を分析することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 蛍光顕微鏡法
- サイトメトリー
背景
- Taliイメージベースサイトメーターは、従来のフローサイトメトリーの代替手段を提供します。
- 定量的および視覚的データの同時取得を可能にします。
- この方法はユーザーフレンドリーで費用対効果が高いです。
- GFP発現細胞の分析に適しています。
研究の目的
- GFP発現細胞の細胞生存能を評価すること。
- イメージベースサイトメトリーが従来の方法に比べて有利であることを実証すること。
- Taliイメージベースサイトメーターを使用するための詳細なプロトコルを提供すること。
使用された方法
- GFPによるU2 OS細胞の導入。
- Tali Dead Cell Red試薬による染色。
- サンプルをTali細胞分析スライドにロードすること。
- 分析のためにTaliイメージベースサイトメーターを使用する。
主要な結果
- 細胞生存能とGFP発現に関する定量的データ。
- 細胞集団の視覚的表現。
- 細胞サイズと蛍光強度を表示するヒストグラム。
- 従来のフローサイトメトリーとの比較結果。
結論
- Taliイメージベースサイトメーターは細胞生存能の評価に効果的です。
- 細胞集団に関する追加の視覚的洞察を提供します。
- この方法は研究設定におけるベンチトップ使用にアクセスしやすいです。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The Tali Image-Based Cytometer bridges the gap between flow cytometry and fluorescence microscopy by delivering simultaneous quantitative and visual data for cell viability and GFP expression assays. This dual-output capability supports early discovery workflows where phenotypic confirmation and mechanistic de-risking require both population-level metrics and single-cell visualization. Its benchtop footprint, lower cost, and simplified operation enable decentralized use across discovery biology and assay development teams, reducing reliance on core facilities and accelerating go/no-go decisions in target validation pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating GFP expression with viability status in live-cell populations.
- Operational Value: Provides visual confirmation of transfection efficiency and protein localization alongside quantitative viability readouts.
- Predictive Value: Supports target confidence by distinguishing total GFP expression from expression in viable cells, reducing false-positive leads.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized histograms for cell size, PI fluorescence, and GFP intensity, enabling threshold-based gating for reproducible population analysis.
- Scalability: Processes thousands of cells per sample with consistent imaging and algorithmic analysis, supporting medium-throughput screening campaigns.
- Workflow Integration: Outputs are compatible with downstream analytics for hit selection and lead optimization in phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains assay consistency from discovery validation to preclinical models by providing comparable viability and expression data to flow cytometry.
- Mechanistic De-risking: Visual layering of brightfield, GFP, and PI signals confirms co-localization of transgene expression and cell death, clarifying mechanism of action.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by quantifying the fraction of live, transgene-expressing cells in heterogeneous populations.
Pipeline & Workflow Integration
The Tali cytometer fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification, where simultaneous viability and reporter gene assessment informs compound effects on cellular health and target engagement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking GFP reporter activity to cell survival, clarifying on-target versus off-target effects.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence and viability outputs with visual validation, enhancing assay reproducibility and hit confirmation.
- Analytics: Provides histogram-based readouts for cell size, GFP intensity, and PI intensity, enabling statistical comparison across conditions and replicates.
- Translational Research: Ensures data continuity with preclinical workflows by mirroring flow cytometry outputs while adding visual context for mechanistic interpretation.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared benchtop platform for multiple assays (viability, GFP/RFP expression, apoptosis), maximizing instrument utilization across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through correlated visual and quantitative data.
- Operational Value: Standardizes assay execution via disposable slides and automated image analysis, improving reproducibility and reducing user variability.
- Strategic Value: Accelerates discovery timelines by enabling rapid benchtop iteration without flow cytometry scheduling constraints.
- Portfolio Impact: Supports risk-based prioritization by quantifying live, transgene-positive cells, improving the quality of advancement candidates.
Implementation Considerations
- Requires basic training in fluorescence microscopy principles and threshold gating for fluorescence and scatter parameters.
- Depends on the Tali Image-Based Cytometer, Tali Cellular Analysis Slides, and Tali Viability Kit - Dead Cell Red reagent for PI-based viability detection.
- Necessitates standardization of staining protocols, incubation times, and focus procedures across users and sites for consistent results.
- Adaptation to other model systems may require optimization of cell concentration and staining conditions due to variations in size and autofluorescence.
- Practical limitations include inability to perform multi-parameter immunophenotyping beyond three channels and incompatibility with adherent cell assays without dissociation.
