生きた ショウジョウバエ の翼の想像ディスクにおけるサイトーンメームによって媒介される細胞間接触を評価するためのGFP相補性ベースの二重発現システム

そのため、私たちの研究は、組織内の離れた場所にある細胞がどのように相互に通信するかを理解することに焦点を当てています。私たちは、ショウジョウバエの翼の想像ディスクをモデルシステムとして使用して、シチジンがどのように形成され、どのように機能し、組織の成長を局所的に制御する上でシチジンがどのような役割を果たすかを理解しようとしています。研究によると、成長因子は、標的細胞に送達されるために、サイトトームと呼ばれるアクチンベースのシグナル伝達糸状偽発などの特殊な細胞突起を通って移動することが多いことが示唆されています。

サイトネムは非常に薄くて壊れやすい構造であり、固定プロトコルによって簡単に破壊されます。それらを観察するには、発現した蛍光タグ付きタンパク質を使用した専用のライブイメージングアプローチを使用する必要があります。これにより、それらを調査するために使用できるツールとアプローチが大幅に制限されます。

私たちは、サイトーンムの生合成に関与するSlikと呼ばれるプロテインキナーゼを特定しました。翼の想像上の椎間板の 1 つの硬膜外層における Slik の発現は、椎間板内腔を横切るサイトーンムの形成を引き起こし、隣接する上皮層の細胞の増殖を刺激します。将来的には、Slikの下流に作用してサイトーンム形成を促進するタンパク質を特定し、このサイトーンムを介して穿孔を促進するリガンドを特定し、組織成長の制御におけるこのメカニズムの生理学的重要性をより深く理解したいと考えています。

まず、はさみを使用して8ウェルストリップから個々のウェルを切り取り、各ウェルを半分に切ります。各半分の片側から保護バッキングを取り外し、スペーサーを顕微鏡スライドに貼り付け、わずかに離してディスクを配置するための保護された中央スペースを作成します。遺伝的交配と摂氏25度でのインキュベーションの後、飼育チューブからさまよう3齢幼虫を摘み取ります。

解剖顕微鏡下で、幼虫をシリコンコーティングされたペトリ皿上の生きたイメージング媒体の滴に移します。2つの解剖鉗子を使用して、幼虫を前部から体の長さの約1/3で1対の鉗子でつまんで安定させることから解剖を開始します。2番目のペアでは、最初の点のすぐ後ろで体をつまみ、引っ張って後半分を分離し、前部を分離します。

切断端の両側をピンセットでつかみ、2番目のペアを使用して頭を押し込み、裏返して前半分を反転させます。これにより、想像上の椎間板、気管、唾液腺、脂肪体、腸などの内部構造が露出します。鉗子を使用して唾液腺、脂肪体、腸を取り除き、翼の円盤を覆う外側気管幹を乱さないように注意します。

鉗子を使用して、翼ディスクが取り付けられた洗浄された前半分を、スライドスペーサーの間にフックを配置したクリーンなライブイメージングメディアの滴に移します。翼ディスクを分離するには、解剖鉗子の片方の刃または解剖針ホルダーに取り付けられた細いタングステンワイヤーを使用して、細い気管枝から翼ディスクを優しく解剖します。残りの枝肉は捨てます。

解剖鉗子の刃またはタングステン針を使用して、足周囲膜側が上を向くように翼ディスクの向きを合わせます。スペーサーレベルより少し上にウェルがいっぱいになるように、中程度の音量を調整します。イメージングスペーサーから上部の保護バッキングを取り外し、サンプルの上にカバースリップをゆっくりと下げます。

鉗子の丸みを帯びた端を使用してスペーサーの接触点でカバースリップを押し、適切な接着を確保します。画像スタックを ImageJ に投影するには、[画像]、[スタック]、[Z プロジェクト]の順に選択し、メニューから [最大強度] を選択します。最大強度投影画像では、フックチャネルとポリゴン選択ツールを使用して、翼ディスクの折り畳みパターンに基づいて翼ポーチ領域を特定します。

同じ選択を GFP チャンネルに適用し、[編集]を選択してから[外部をクリア]を選択して、選択した領域の外側のノイズを除去します。最大強度投影画像のフックチャネルを使用して、GFP画像内のアーティファクトスポットを識別します。次に、ポリゴン選択ツールを使用して領域を選択します。

[編集] をクリックし、[クリア] を選択します。クリーンアップされた最大強度投影画像で、[分析]、[ヒストグラム]の順に選択し、[リスト]を選択してすべてのピクセル値を取得します。このリストをスプレッドシートの表にコピーします。

しきい値を設定するには、ネガティブコントロールサンプルのバックグラウンドシグナルを分析し、他のサンプル画像を使用してこの値を確認します。しきい値を超えるピクセル数を有効なピクセルの総数で割り、結果に 100 を掛けて、GFP 陽性表面の割合を計算します。最後に、計算された各値を、1に設定された参照条件の平均で割った後、正規化します。

両方の分割されたGFP成分を欠く野生型ディスクでは、翼袋の中心付近で最小限の粒状GFP自家蛍光のみが観察され、このベースラインシグナルを使用して蛍光閾値を定義しました。ディスク固有層でCD4分割GFP1-10のみを発現したディスクは、野生型と区別がつかない蛍光レベルを示し、GFP1-10単独の非蛍光性を確認しました。CD4 split GFP1-10 in the disc proper and CD4spGFP11 in peripodial membrane of the con-expression to the disc lumen is distinct increase in disc lumen and bright GFP spots in the disc lumen and found in discelet bright growth growth in displeescent positive area than threshold than threshold.

ディスク自体でのSlikの発現は、足周囲膜核密度の大幅な増加と、翼袋領域全体のGFPシグナル強度の劇的な上昇を引き起こし、Slikによって誘導されたサイトネームが足周囲膜細胞との接触の強化を確立することを示唆しています。