Name: 生きた ショウジョウバエ の翼の想像ディスクにおけるサイトーンメームによって媒介される細胞間接触を評価するためのGFP相補性ベースの二重発現システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-22T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学ぶGFP相補性法によるショウジョウバエ翼想像ディスクのサイトーンメーム媒介細胞間接触の可視化手法。生体イメージングで組織成長制御メカニズムを解明する。

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nubbin-GAL4ドライバーは、DPの翼袋領域で特異的にCD4-spGFP1-10を発現するために使用されます(図1A)。PerM-LexAドライバー21は、PerMにおいてCD4-spGFP11を特異的に発現させるために使用されます(図1A)。これら2つの発現系は互いに独立しており、DPおよびPerMにおける異なる導入遺伝子の同時かつ特異的な発現を可能にします(図1B、C)。
基本的な遺伝スキームには、ハエを交配して遺伝子型 nub-GAL4 / UAS-CD4-spGFP1-10の幼虫を生成することが含まれます。PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11。陰性対照として、 LexAop-CD4-spGFP11 導入遺伝子を除外します。他の導入遺伝子(例えば、タンパク質コード、二本鎖RNA)は、DP層( UAS 配列の制御下)またはPerM( LexAオペレーターの制御下)で必要に応じて発現できます。
これは、中断できないライブイメージングプロトコルです。材料の準備は~10分と推定されます。解剖は、イメージング前に一度に 20 分以上実行しないでください。イメージングには~30分かかり、~1時間以上続くことはありません。複数の条件または多数のサンプルの場合、最良の結果を得るために手順を複数のラウンドで実行する必要があります。
1. 材料の準備
<ol>
	<li>解剖に先立って、ピンセット、9ウェルガラスくぼみスポットプレート(または幼虫の収集と洗浄に適したその他の容器)、および70%エタノールで解剖に使用される再利用可能なシルガード(シリコン)コーティングされたペトリ皿をきれいにします。</li>
	<li>70%エタノール洗浄を行い、乾燥したスライドに イメージングスペーサー を貼り付けて、顕微鏡スライドを調製します。はさみで8ウェルストリップから個々のウェルを切り取り、半分に切ります(図2A)。各半分の片側から保護バッキングを取り外し、スペーサーをスライドに貼り付け、ディスクが配置される中央に保護されたスペースを作成するために少し間隔をあけて貼り付けます(図2B)。 注:私たちの経験では、スライドに移される媒体の正確な量がそれほど重要ではないため、これによりサンプルの取り付けが簡素化されます。少量の余剰量は、カバースリップ時に隙間から流出します。比較的短い時間(通常~1時間)しか撮影しなかったため、中程度の乾燥では問題はありませんでした。</li>
	<li>ライブイメージング培地(凍結10 mLアリコートで保存されたサプリメントなしのシュナイダーショ ウジョウバエ 培地)を解凍し、アイスバケツに簡単にアクセスできるようにします。</li>
	<li>2 mLの微量遠心チューブで、1.5 mLの培地を20 μLの200 μg/mLのHoechst 33342(最終濃度2.7 μg/mL)と混合します。チューブを氷の上に置いてください。 注:この特定の形態のヘヒスト色素は、膜透過性が高いため使用されます。注意: Hoechst 33342 を取り扱うときは、手袋を使用する必要があります。工具は使用後に洗浄する必要があります。</li>
</ol>
2. 翼椎間板の解剖とスライドの準備
<ol>
	<li>遺伝的交配と25°Cでの飼育に続いて、チューブからさまよう3齢の幼虫を摘み取り、9ウェルガラスのくぼみスポットプレート内の冷たいライブイメージング培地で洗浄します。 注:サイトーンムは非常に壊れやすいです。次の手順では、椎間板と解剖ツールが直接接触しないように、椎間板の周囲の組織を操作するように注意する必要があります。いくつかの椎間板に損傷を与えることは避けられず、これはイメージングステップ中にのみ顕著になる可能性があるため、一度に3〜4匹の幼虫を準備します。</li>
	<li>解剖顕微鏡下で、幼虫をシリコンでコーティングされたペトリ皿上のライブイメージング培地の滴に移し、2つの解剖鉗子を使用して解剖を開始します。これを行うには、まず、体長の約3分の1(前部から)で1対の鉗子で幼虫をつまんで、頭と体の前部を安定させます。2番目の鉗子を使用して、最初の鉗子のすぐ後ろで体をつまみます。次に、幼虫の後部を引き離して、前部の「半分」を分離します。</li>
	<li>切断端の両側に1対のピンセットで固定し、もう一方のピンセットで頭を押し込み(靴下を裏返すように)、想像上の椎間板、気管、唾液腺、脂肪体、腸などの内部構造を露出させて、前半分を反転させます。</li>
	<li>唾液腺、脂肪体、腸を慎重に取り除き、翼の円盤の上に横たわって保護する気管の外側幹を乱さないように注意します。</li>
	<li>鉗子を使用して、翼ディスクが取り付けられた洗浄された前半分を、準備されたスライドのスペーサーの間に配置されたHoechstを含むクリーンなライブイメージング培地の滴に慎重に移します(図2C)。解剖鉗子の片方の刃または解剖針ホルダーに取り付けられた細いタングステンワイヤーを使用して、椎間板に接続する気管の細い枝から翼ディスクをそっと鈍く解剖することにより、翼ディスクを残りの組織から分離します。残りの枝肉は捨てます。</li>
	<li>解剖鉗子またはタングステンワイヤー解剖針の片方の刃を使用して、ディスクの向きを変えます。平らな涙滴のような形状のため、翼ディスクはDPまたはPerMのいずれかを上に向けて落下します。このプロトコルでは、すべてのディスクをPerM側を上にして向きを変えます。</li>
	<li>必要に応じて培地を追加または除去することにより、ウェルを完全に満たすように培地の容量を調整し、イメージングスペーサーのレベルよりわずかに上にします。各イメージングスペーサーの半分の上側から保護バッキングを取り外し、カバーガラスをサンプルの上に慎重に下げます。カバーガラスがイメージングスペーサーに接触する場所(解剖鉗子の丸みを帯びた端など)をそっと押して、カバーガラスがスペーサーに付着していることを確認します。 注:気泡を閉じ込めないように、中程度のレベルはスペーサーの高さよりわずかに上にする必要がありますが、カバーガラスを下げたときに大きな流れを発生させるほど高くしないでください。</li>
</ol>
3. イメージング
<ol>
	<li>40x/1.30 NA油浸レンズと顕微鏡ソフトウェアを備えた共焦点顕微鏡(GFPは波長488 nmのアルゴンイオンレーザー、Hoechstは波長350 nmのUVレーザー)を使用して、室温でサンプルを画像化します。PerMの最高レベル(ヘクスト蛍光が減少する場所)のすぐ上からDPの基底側まで、通常スタックあたり100枚以上の画像に及ぶ1μmのステップサイズの画像スタックを取得します。繰り返し画像スタックを取得して、タイムラプスムービーを生成します。 注:スライドを~1〜2時間以内で画像化します。</li>
	<li>顕微鏡ソフトウェアの設定では、 8ビットコーディング、 ライン平均 化 2、 検出器ゲイン (一般的に 650 〜 750)、および信号のブリードスルーを減らすために分離されたチャネルトラックを使用して画像を取得します。すべての条件で同じレーザーと検出器の設定を使用し、事前に各条件でテストを実行することで事前に決定します。 注:40倍の倍率では、画像の解像度は5.0386ピクセル/μm(ピクセルサイズ:0.1985 x 0.1985 μm2)です。私たちのセットアップでは、最適な共焦点顕微鏡設定には、可能な限り多くの信号をキャプチャすると同時に、飽和をほとんどまたはまったく得られない、可能な限り最高のレーザー強度(組織に損傷を与えることなく)が含まれていました。また、検出器のオフセットと取得速度(必要な場合)を下げることで達成される、ネガティブコントロールで評価された可能な限り低いノイズ。通常、レーザー出力は 5% 未満で、最大スキャン ヘッド速度は [Zen ソフトウェア設定では '9') を使用します。通常、1つの画像スタックの取得には~1分45秒かかり、タイムラプス分析のために画像は2〜3分ごとに撮影されます。</li>
</ol>
4. 画像解析
<ol>
	<li>ImageJソフトウェアパッケージの 最大強度投影 機能を使用したプロジェクトスタック(画像をクリック |スタック |Zプロジェクトで、メニューで 最大強度 を選択します)。</li>
	<li>MIP画像で、 ポリゴン選択を使用して、翼ディスクの折り畳みパターン(Hoechstチャネルを使用)に基づいて翼袋の面積を決定します。GFPチャンネルで同じ選択を Clear Outside機能 で使用します( Edit |[外側をクリア]) を使用して、すべての外側ピクセル値を 0 に設定します。</li>
	<li>MIP 画像では、Hoechst チャネルを使用して GFP 画像をクリーンアップし、特に、関連するピクセル値を 0 に設定して、両方のチャネルに表示される人工スポットを削除します ( [ポリゴン選択]、[編集 ] | [クリア] の順にクリックします)。</li>
	<li>クリーニングされたMIP画像で、 ヒストグラム 関数を使用します( [分析] |ヒストグラム |List)を使用して、すべてのピクセル値のリストを取得し、スプレッドシートのテーブルにコピーします。</li>
	<li>ネガティブコントロールのバックグラウンドシグナルの分析に基づいて しきい値 を設定します(その後、他のサンプルで検証されました。</li>
	<li>次の式を使用して、GFP陽性表面の割合を計算します。 %GFP 陽性表面 = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68411/68411eq01.jpg" style="margin: auto;"> × 100</li>
	<li>各値を参照条件の平均 (1 に設定されている) で割って、最後にデータを正規化します。 注: 有効なピクセル = 値が 1 ≥ピクセルで、値が 0 に設定された削除されたピクセルは事実上無視されます。ピクセル値 0 は自然に発生しません。</li>
	<li>再構成されたGFPシグナルがディスク内のどこに局在するかを決定するには、画像スタックのXZリスライスを使用して、ディスク上皮の根尖基底軸を調べます。フィジーで補間なしで再スライスを実行し、双線形補間を伴う スケール 関数を使用して Z 軸の画像の高さを増やし、視認性を向上させます。</li>
</ol>

<ol><li>Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+basis+of+pattern+formation+during+vertebrate+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development.</a> Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).</li>
<li>Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes+and+the+dispersion+of+morphogens%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytonemes and the dispersion of morphogens.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (6), 445-463 (2014).</li>
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<li>Chen, W., Huang, H., Hatori, R., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+basal+cytonemes+take+up+Hedgehog+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Essential basal cytonemes take up Hedgehog in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 144 (17), 3134-3144 (2017).</li>
<li>Huang, H., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+cytonemes+mediate+Wg+signaling+from+the+wing+imaginal+disc+and+Delta-Notch+signaling+to+the+air+sac+primordium%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Myoblast cytonemes mediate Wg signaling from the wing imaginal disc and Delta-Notch signaling to the air sac primordium.</a> Elife. 4, e06114(2015).</li>
<li>Hatori, R., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+produced+by+the+Drosophila+wing+imaginal+disc+induces+distinct+responses+in+three+target+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog produced by the Drosophila wing imaginal disc induces distinct responses in three target tissues.</a> Development. 147 (22), dev195974(2020).</li>
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<li>Gibson, M. C., Lehman, D. A., Schubiger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumenal+transmission+of+decapentaplegic+in+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Lumenal transmission of decapentaplegic in Drosophila imaginal discs.</a> Dev Cell. 3 (3), 451-460 (2002).</li>
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<li>Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+interactions+between+squamous+and+columnar+epithelia+of+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling interactions between squamous and columnar epithelia of the Drosophila wing disc.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3363-3370 (2005).</li>
<li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+superfolder+and+split+fluorescent+protein+detection+systems+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Development and applications of superfolder and split fluorescent protein detection systems in biology.</a> Int J Mol Sci. 20 (14), 3479(2019).</li>
<li>Panneton, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+catalytic+and+non-catalytic+functions+of+the+Drosophila+Ste20+kinase+Slik+by+activation+segment+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of catalytic and non-catalytic functions of the Drosophila Ste20 kinase Slik by activation segment phosphorylation.</a> J Biol Chem. 290 (34), 20960-20971 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ディスカバリーV12解剖顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td>解剖顕微鏡</td></tr><tr><td>デュモン #55 鉗子、生物学のヒント</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11255-20</td><td>解剖鉗子</td></tr><tr><td>EP-Slik (slik20358)</td><td>BDSCの</td><td>Panneton et al. 2015&nbsp;</td><td>スリックを発現するためのフライひずみ</td></tr><tr><td>フィジー</td><td></td><td>シンデリン、J. et al. (2012)&nbsp;</td><td>画像解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>ヘクスト 33342&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>H3570&nbsp;</td><td>ライブイメージング核染色&NBSP;</td></tr><tr><td>LexAop-CD4-spGFP11&nbsp;</td><td>BDSCの</td><td>93018</td><td>ハエひずみ</td></tr><tr><td>LSM 700共焦点顕微鏡&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td></td><td>共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>nub-GAL4</td><td>ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(BDSC)</td><td>86108</td><td>ハエひずみ</td></tr><tr><td>PerM-LexA</td><td></td><td>ランボー、ジョセフ他、2025</td><td>ハエひずみ</td></tr><tr><td>PYREX 9-くぼみガラススポットプレート販売</td><td>コーニングライフサイエンス</td><td>7220-85</td><td>幼虫の採取・洗浄用</td></tr><tr><td>シュナイダーショウジョウバエの培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21720024</td><td>ライブイメージング媒体</td></tr><tr><td>SecureSealイメージングスペーサー、8ウェル、厚さ0.12mm&nbsp;</td><td>グレース・バイオ・ラボ</td><td>654008</td><td>スペーサー</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 シリコンエラストマーキット</td><td>シルガード</td><td>3097358-1004</td><td>解剖プレート製作用</td></tr><tr><td>UAS-CD4-spGFP1-10&nbsp;</td><td>BDSCの</td><td>93017</td><td>ハエひずみ</td></tr><tr><td>ゼンブラック</td><td>ツァイス</td><td></td><td>取得ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

生きた ショウジョウバエ の翼の想像ディスクにおけるサイトーンメームによって媒介される細胞間接触を評価するためのgfp相補性ベースの二重発現システム

A GFP Complementation-based Dual-expression System for Assessing Cell-Cell Contact Mediated by Cytonemes in Live Drosophila Wing Imaginal Discs

DP細胞とPerM細胞間の接触を測定するためのGRASP手順の有用性をテストするために、4つの異なる遺伝子型の翼ディスクを調べました:GFPチャネルの自家蛍光のバックグラウンドレベルのみを表示する野生型陰性対照ディスク(遺伝子型: w1118)。DP層でCD4-spGFP1-10を発現するが、GFP1-10単独で生成される蛍光のレベルを示すCD4-spGFP11導入遺伝子を欠いています(GFP1-10は蛍光を発しないはずなので、無視できると予想していました26)。CD4-spGFP1-10およびCD4-spGFP11がそれぞれDPおよびPerMで発現するディスク(図3A)は、DP-PerM接触の「正常な」レベルを明らかにします。CD4-spGFP1-10 および CD4-spGFP11 に加えて、 UAS 制御下の DP 細胞で Ser/Thr プロテインキナーゼ Slik も発現するディスク。DP細胞におけるSlik発現はPerM細胞の非自律増殖を促進する<sup cla...

生きた ショウジョウバエ の翼の想像ディスクにおけるサイトーンメームによって媒介される細胞間接触を評価するためのGFP相補性ベースの二重発現システム

Embryonic tissue growth and patterning are largely controlled by signals exchanged locally between cell populations within the tissues themselves. ...

a-gfp-complementation-based-dual-expression-system-for-assessing-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ここでは、GFPタグ付きのグリア細胞とペアライブ顕微鏡分析を使用して開発をショウジョウバエの眼にグリア細胞の遊走を調べるためのプロトコルについて説明します。...

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。...

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

SACは、姉妹染色分体の有糸分裂分離を監視し、その信号を開始する場所を動原体である。方法は、染色体の動きと動原体タンパク質とその調整のいずれかの採用と離職率を可視化するために記述されている...

リビングでの動的動原体タンパク質の挙動と染色体の動きを図解して有糸分裂チェックポイントを勉強<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;合胞体胚

このビデオでは、グリア細胞のシングルセルイメージングのためのトランスジェニックショウジョウバエ脳の免疫蛍光染色を実演しています。脳は、グリア特異的な組換え酵素システムの制御下で、抗原性エピトープのさまざまな組み合わせと融合した膜標的タンパク質を発現します。単離および固定された脳は、抗原エピトープに特異的な一次抗体で染色され、続いて蛍光色素標識二次抗体で染色されます。この標識により、さまざまな脳領域にわたる異なるグリア細胞亜集団の同時イメージングが可能になります。...

グリア細胞のシングルセルイメージングのためのショウジョウバエ脳の免疫蛍光染色

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。...

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

ショウジョウバエの成体構造は、虚数円盤と呼ばれる袋のような構造に由来します。これらのディスクの解析により、組織決定、コンパートメント境界の確立、細胞増殖、細胞運命の仕様、平面細胞の極性など、多くの発生過程に関する洞察が得られます。このプロトコールは、光/蛍光顕微鏡用の架空ディスクを調製するために使用されます。...

解剖や成虫の免疫染色からキイロショウジョウバエ

このプロトコルは、生きたショウジョウバエの蛹の眼神経上皮をイメージングするための効率的な方法を提供します。この方法は、組織の動きと不均一なトポロジーを補正し、複数のGFPタグ付き接合タンパク質を使用して細胞境界の視覚化を強化し、簡単に組み立てられるイメージングリグを使用します。...

のライブイメージングショウジョウバエ蛹アイ

細胞は異なる形態を表示し、様々 な彼らの隣人との相互作用を確立します。このプロトコルでは、単一細胞の形態を明らかにする、老舗の Gal4/UA...

多色 FlpOut 技術の高分解能単一細胞の形態とショウジョウバエにおけるグリア細胞の細胞間相互作用の研究への応用

ここでは、ショウジョウバエの卵巣ニッチにおける生殖幹細胞(GSC)の非対称分裂のライブイメージングを行うための詳細なプロトコルを提供します。私たちは、スペクトロソームタンパク質Par-1の緑色蛍光タンパク質(GFP)融合を遍在的に発現するトランスジェニックラインを使用しています。...

雌のショウジョウバエ・メラノガスター生殖幹細胞ニッチの長時間のライブイメージング

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)は、拡大顕微鏡法と蛍光in...

Expansion-assisted iterative Fluorescence In Situ Hybridizationを用いたInsact Drosophila Brainにおける遺伝子発現のマルチプレックス検出

本記事では、試薬を節約し、少数の想像椎間板を取り扱いやすくする効率的な幻想椎間板解剖および抗体染色プロトコルについて説明します。...

ショウジョウバエ・メラノガスターからの眼触角および翼の想像円板の小規模解剖および抗体染色

学ぶGFP相補性法によるショウジョウバエ翼想像ディスクのサイトーンメーム媒介細胞間接触の可視化手法。生体イメージングで組織成長制御メカニズムを解明する。

生きたショウジョウバエの翼の想像ディスクにおけるサイトーンメームによって媒介される細胞間接触を評価するためのGFP相補性ベースの二重発現システム

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