Name: Microtissue安定化のためのマイクロ流体デバイスの層ごとのコラーゲン沈着 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 学ぶ マイクロ流体デバイスにおける層ごとのコラーゲン沈着法。ヘパトサイトの表現型安定化と極性維持を実現する組織工学技術を探索する。極薄マトリックスによる細胞機能の長期保持が可能となる。

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この研究は、国立トランスレーショナルサイエンス推進センター（UH2TR000503）からの微生理学的システムコンソーシアム助成金、ルース・L・キルシュシュタイン国立研究サービス賞ポスドクフェローシップ（WJMのF32DK098905）、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所の自立への道賞（ABのDK095984）を含む、国立衛生研究所からの助成金によって支援されました。

ネイティブ可溶性コラーゲン溶液の調製<ol><li>準備または私は1-3ミリグラム/などPiez らによって報告され、標準の単離プロトコルを使用してML 15でラットの尾からコラーゲン酸性化し、可溶性、タイプの200 mgの購入</li><li>修正されたコラーゲン溶液の所望の最終容積に基づいて、出発物質の量をスケーリングします。約可溶性天然コラーゲンを200mgから、3 mg / mlの時に25〜30のメチル化のml及びスクシニルコラーゲン溶液の25〜30ミリリットル、それぞれを行います。 </li></ol> 2.コラーゲンのメチル化<ol><li>氷冷たい滅菌水でミリリットルの0.5mg /の濃度にネイティブ、酸性化（pHは2-3）コラーゲン溶液100mgを希釈し、ゲル化を防止するために氷の上にソリューションを続けます。 </li><li> 1 N NaOHを数滴の9-10のコラーゲン溶液のpHを調整し、室温で30分間攪拌します。白濁するために溶液を引き起こし、コラーゲン沈殿物を観察します。 </lI&gt; <li> 25分間3000×gで沈殿したコラーゲン溶液をスピンダウン。明確な、ゲル状の沈殿物がチューブの底に表示されるはずです。吸引し、適切に上澄み液を廃棄。 </li><li> 0.1 N HClで200mlのメタノールで沈殿コラーゲンを再懸濁し、メチル化反応を4日間室温で撹拌しながら発生することを可能にします。コラーゲンは溶解しないが、解決策は曇りになります非常に小さく見える片にばらばらにする必要があります。 </li><li>メチル化した後、遠心分離器25分間3000×gでソリューションは、メチル化コラーゲンを沈殿させます。吸引除去は、酸性化メタノール上清を処分。 </li><li>繰り返しのピペッティングで約3 mg / mlでの濃度を与える、無菌PBS 25ml中のメチル化コラーゲンを溶解し、60μmの細胞ストレーナーを通して溶液を濾過します。 1 N NaOHを20μlの増分を用いて7.3から7.4への溶液のpHを調整します。 </li><li> concentratioを評価商業ラットコラーゲンELISAキットまたはヒドロキシプロリンアッセイキットを使用して溶液をN。 3ミリグラム/ミリリットル滅菌PBSでの解決策を希釈します。 </li><li>慎重にボトルの底にクロロホルム3mlのを積層、スクリューキャップ付きガラス瓶に移すことにより、メチル化コラーゲン溶液を滅菌、ボトルを4℃でO / Nを設定し、無菌的に除去して保存することを可能にしますメチル化コラーゲンであるトップ層、。 </li><li> 1ヶ月以内に使用するために4℃で溶液を保管してください。 </li></ol> 3.コラーゲンスクシニル<ol><li>氷冷たい滅菌水でミリリットルの0.5mg /の濃度にネイティブ、酸性化（pHは2-3）コラーゲン溶液の他の100ミリグラムを希釈し、ゲル化を防止するために氷の上にソリューションを続けます。 </li><li> 1 N NaOHを数滴の9-10のコラーゲン溶液のpHを調整し、室温で30分間攪拌します。コラーゲンは白濁するソリューションを引き起こして、沈殿させる必要があります。 </li><li> SUCの40 mgの溶かします（コラーゲン溶液の体積番目の 1/20）をアセトン10ml中cinic無水物（コラーゲン1mg当たり0.4ミリグラム）。ゆっくりと（約0.5ミリリットルずつ）を連続的にpHをモニターしながら、攪拌しながら、コラーゲン溶液に、この混合物を追加します。 pHが9.0に近づくにつれて1 NのNaOHの1または2滴を添加することにより9.0を超えるpHを維持します。 </li><li>アセトン中の無水コハク酸のすべてを追加した後、120分間室温で撹拌し続けます。スクシニル化コラーゲンが溶解するよう明確になるために解決策を確認します。定期的にそれが9.0を超えたまま確保するためのpHを確認してください。 </li><li> 1 N HClを20μlの刻みを4.0に溶液のpHを調整します。スクシニル化コラーゲン沈殿物として、再び濁った溶液を観察します。 </li><li>スクシニル化した後、スクシニル化コラーゲンをペレット化するために25分間3000×gで遠心分離ソリューション。未反応の無水コハク酸を用いて酸性化上清を吸引除去し、廃棄してください。 </li><li>スクシニル化コラーゲンを溶かします無菌PBSの25ミリリットル、60ミクロンセルストレーナーを通して溶液をピペッティングを繰り返すと、ミリリットル/約3ミリグラムの濃度を与え、フィルターインチ1 N NaOHを20μlの増分を用いて7.3から7.4への溶液のpHを調整します。 </li><li>商業コラーゲンラットELISAキットまたはヒドロキシプロリンアッセイキットを用いて溶液の濃度を評価します。 3ミリグラム/ミリリットル滅菌PBSでの解決策を希釈します。 </li><li>慎重にボトルの底にクロロホルム3mlのを積層、スクリューキャップ付きガラス瓶に移すことによって、スクシニル化コラーゲン溶液を滅菌、ボトルを4℃でO / Nを設定し、無菌的に除去して保存することを可能にしますスクシニル化コラーゲンであるトップ層、。 </li><li> 1ヶ月以内に使用するために4℃で溶液を保管してください。 </li></ol>コラーゲン修正4.検証<ol><li> 、ネイティブのメチル化、およびスクシニル化コラーゲン溶液のそれぞれから1ミリリットルのサンプルを準備し、濃に希釈します水素イオン滴定のための滅菌純水でミリリットルを0.1mg /のentration。また、少なくとも4時間ごとに、10kDaのカットオフmembraneusing 3溶液の変化を介して水に対して透析によってバッファ、少なくとも1000倍に希釈。 </li><li> NaOHおよびHClを少量の7.3に溶液のpHを調整します。天然のメチル化、およびスクシニル化コラーゲン溶液のための滴定曲線を作成するために、タンフォード16で説明したように任意の基準として、pHが7.3を使用して、試料のそれぞれに水素イオン滴定を行います。 </li><li>バインドされたH +分子当たりのイオン数に対する酸の添加量あたりのpHの変化をプロットします。高pH「アミノ」の範囲は、中性点に向かってスクシニル化コラーゲンのシフト（アミン基の損失）を示すべきであり、低pH、「カルボキシル」の範囲は、メチル化コラーゲン中左シフト（カルボキシル基の損失を示す必要があります）およびスクシニル化コラーゲンの右シフト（カルボキシル基のゲイン秒）、天然コラーゲンと比較しました。 </li><li>標準的なプロトコール17,18以下、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBA）比色法を用いて、スクシニル化によって置き換え天然コラーゲンでのアミノ基の％を決定することによって、サクシニル化反応の有効性を評価します。 </li></ol> 5.マイクロ流体デバイスの作製と細胞播種<ol><li>標準的な方法9を使用して 、マイクロ流体デバイスを製造。 100μmで、背の高い0.4〜1.5ミリメートル幅の広い、および細胞増殖のための長いチャンネル1〜10ミリメートルで、マイクロ流体細胞培養室を作成するために、フォトリソグラフィを使用して定義されたシリコン上にSU-8マスターからPDMSのレプリカ成形を使​​用してください。 </li><li>デバイスとスライドガラスの表面を酸化するためにプラズマクリーナーを使用し、さらに結合を一緒に押します。少なくとも30分間、UV光に露光することによって、デバイスを滅菌した後、滅菌PBS中の50μg/ mlのフィブロネクチンでチャンバを充填し、45分間37℃でインキュベートします。 </li&gt; <li>表現型または分化状態の安定化のためのコラーゲンゲルを必要とするような初代ラットやヒト肝細胞などの細胞、を備えたデバイスをシード。私たちは、デバイスあたり14×10 6細胞/ mlで播種新たに単離した初代ラット肝細胞7,19または市販の凍結保存された初代ヒト肝細胞の20μLを使用しています。 </li><li>細胞は4-6時間アタッチした後、付着していない細胞を洗い流すと、増殖培地でメッキメディアを交換できるようにします。拡散フルセルを確保し、細胞のコンフルエントな単層を作成するために、O / Nインキュベートします。 </li></ol> 6.レイヤー・バイ・レイヤーコラーゲン沈着<ol><li>層流の組織培養フードでは、デバイスごとに各溶液の10アプリケーションのためのメチル化およびスクシニル化コラーゲン溶液の十分なボリュームだけでなく、メディアのいくつかのMLSを準備します。氷の上で解決策をしてください。私たちは、デバイスごとに1層当たりのコラーゲンの20μlの（10〜15回総デバイス・ボリューム）を使用します。 </li><li>うメチル化された20μlのデバイスをフラッシュメチル（ポリカチオン）溶液に、代替と綿繰りし、各アプリケーションとの間で1分を待って、コラーゲン溶液をスクシニル。デバイスに約20分を取る必要があります解決策につき10回、の合計をフラッシュします。細胞は、培地なしている時間の量を最小にするためにすぐに働きます。 </li><li>ゆっくりとその大きさに応じて、入口/出口に蓄積コラーゲンを守ってください。流体の流れが増加に対する耐性は、メディアに一度か二度のデバイスをフラッシュし、場合には、階層化を続けます。 </li><li>全ての層を適用した後、新鮮な培地で二回デバイスをすすぎ、インキュベーターに戻します。細胞の種類に応じて、そのような肝細胞で強化された偏光のような細胞外マトリックスにより誘導される形態学的変化は、数時間以内に表示されるはずです。 </li><li>コラーゲンマトリックスの存在を確認するために、標準的な方法9を用いて 、透過型電子顕微鏡のための代表的な装置を準備培養細胞の上に組み立て。 </li></ol>細胞の表現型および機能の安定化7 <ol><li>画像の細胞型のための標準的な方法を用いて細胞の形態、生存率、および極性。肝細胞は、コラーゲン沈着の効果を実証するために、頂端の偏光に対する位相顕微鏡、生存のためにLIVE / DEAD染色し、CMFDA色素を使用して、14日間に渡って画像を収集。 </li><li>細胞形態学のために、リンス20μlのPBS、及び画像位相差顕微鏡を使用してデバイスを注入するためにPBS20μlをピペットで注入口を介してデバイスを洗い流します。 </li><li> LIVE / DEAD染色のために、すすぎ、製造元の指示に従って調製し、DAPIでLIVE / DEAD染色溶液20μlを注入する20μlのPBSでピペットで注入口を介してデバイスをフラッシュし、37℃で30分間インキュベートし、すすぎデバイスを再び20μlのPBS、及び画像蛍光顕微鏡を用いた装置です。 </li><li>胆汁カナリについてCuLi等の染色、DAPIで2μMCMFDA染色溶液20μlを注入、すすぐために20μlのPBSをピペットで注入口を介してデバイスをフラッシュするには、製造元の指示に従って調製し、37℃で30分間インキュベートし、再びデバイスをすすぎます20μlのPBS、及び画像蛍光顕微鏡を使用してデバイス。 </li><li>使用済み培地を収集し、細胞機能を決定するための培養期間にわたって、適切な時点での細胞代謝産物を測定します。肝細胞の場合は、使用済み培地中のアルブミンおよび尿素の量を測定します。 </li><li>このような酵素活性レベル、抗体染色、またはRNA分析を評価するように細胞自体上のエンドポイント機能解析を実行します。肝細胞は、誘導し、シトクロムP450酵素活性または第II相抱合酵素グルタチオンSトランスフェラーゼを測定します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

極薄純粋なコラーゲンアセンブリが​​変更されたコラーゲンのレイヤーバイレイヤー堆積を用いて帯電した細胞または材料表面上に堆積することができます。この研究の結果は、メチル化及び天然コラーゲンのスクシニル化は、細胞（ 図2）上の極薄コラーゲンマトリックスアセンブリを堆積させるために層ごとの手法で使用することができる（ 図1）または他の荷電したポリカチオンとポリアニオン性コラーゲン溶液を作成することを実証材料表面。このような極薄マトリックス層は、肝細胞（ 図3）、その機能と同様に、マイクロ流体デバイス内に播種した後（ 図4）のような細胞の形態、生存能力、及び偏光を安定化させることができます。 極薄コラーゲン層の堆積のために成功し、メチル化およびスクシニル化コラーゲンを生成する改質反応が重要です。カルボキシル基のメチル化反応が良好でないためコラーゲンメチル化反応はル・シャトリエの原理に基づいて、正反応を駆動するために、酸性化メタノール中で行われなければなり...

マイクロ流体工学は細胞微小環境の絶妙な制御を可能にしますが、マイクロ流体デバイス内で細胞、特に初代細胞を培養することは困難な場合があります。組織培養プレートで培養する際に細胞機能を維持および安定化するために、多くの従来の細胞培養技術が開発されてきましたが、これらの技術をマイクロ流体デバイスに変換することはしばしば困難です。
そのような技術の一つは、生理学的3D細胞環境のモデルとして、コラーゲンゲル上に細胞を挟み込んだ細胞の培養です。1 I型コラーゲンは、細胞外マトリックスに遍在し、天然存在量、堅牢な細胞接着部位、および生体適合性があるため、バイオマテリアルアプリケーションに最も頻繁に使用されるタンパク質の1つです。2 コラーゲンを用いた3D培養は、がん細胞3,45、微小血管内皮細胞6、肝細胞7など、多くの細胞が恩恵を受けています。コラーゲンゲルは、組織培養プレートなどのオープンフォーマットでは容易に使用できますが、マイクロ流体デバイスのチャネル寸法が限られており、密閉性があるため、チャネル全体をブロックせずにゲル化する液体の使用は実用的ではありません。
>jove_content<この問題を解決するために、私たちはマイクロ流体デバイスで培養された細胞の上に極薄のコラーゲン集合体を作成するために、天然のコラーゲン溶液の化学修飾と層ごとの堆積技術8を組み合わせました。これらの層は、細胞の形態を安定させ、コラーゲンゲルと同様に機能させることができ、重合マトリックスでチャネルを塞ぐことなく、マイクロ流体デバイスの細胞上に堆積させることができます。この方法の目標は、天然コラーゲンを修飾してポリカチオン性およびポリアニオン性コラーゲン溶液を作製し、薄いコラーゲンマトリックス集合体を細胞上に沈着させることにより、マイクロ流体培養で細胞を安定化させることです。この技術は、マイクロ流体デバイスにおける初代肝細胞の形態と機能を安定化するために使用されてきました。9
天然および合成の高分子電解質10を用いて、プレート培養11,12の肝細胞を覆うための層ごとの堆積が以前に報告されており、マイクロ流体デバイス13,14の肝細胞の播種層として報告されていますが、この方法は、3Dコラーゲン培養技術を模倣して、肝細胞の上に純粋なコラーゲン層を堆積させるものです。このプロトコルでは、3Dコラーゲン層を使用して維持できる細胞を例として肝細胞を使用します。コラーゲン中での3D培養の恩恵を受ける他の多くの種類の細胞も、極薄コラーゲンマトリックスアセンブリを層ごとに堆積させた後の培養から同様に利益を得る可能性があります。

<table><tbody><tr><td>コラーゲンI型、ラットテール</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ<td>A1048301</td><td>濃縮ラットテールコラーゲン</td></tr>コラーゲン<tr><td>I型オプション、ラットテール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>濃縮ラットテールコラーゲン</td></tr>コラーゲン<tr><td>I型オプション、ラットテール</td><td>EMDミリポア</td><td>08-115</td><td>濃縮ラットテールコラーゲン</td></tr>コラーゲン<tr><td>I型オプション、ラットテール</td><td>R%Dシステム</td><td>3440-100-01</td><td>濃縮ラットテールコラーゲン</td></tr>コ<tr><td>ハク酸無水物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239690-50G</td><td>サクシニル化試薬</td></tr><tr><td>無水メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-100ML</td><td>メチル化試薬</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>pH 沈殿試薬</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td>pH沈殿試薬</td></tr><tr><td>ラットコラーゲンI型 コラーゲン</td><td>含有量を検出するための</td>ELISA <td>Chondrex</td><td>6013</td>オプション</tr><tr><td>ヒドロキシプロリンアッセイキット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK008-1KT</td><td>コラーゲン含有量検出オプション</td></tr><tr><td>ヒドロキシプロリンアッセイキット</td><td>Quickzyme Biosciences</td><td>QZBtotcol1</td><td>コラーゲン含有量検出オプション</td></tr></tbody></table>

microtissue安定化のためのマイクロ流体デバイスの層ごとのコラーゲン沈着

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

マイクロ流体工学は細胞の微小環境を絶妙に制御しますが、マイクロ流体デバイス内で細胞を培養challenging. 3Dすることは、コラーゲンI型ゲルでの細胞の培養が細胞の形態と機能を安定させるのに役立ち、これはマイクロデバイスでマイクロ流体組織モデルを作成するために必要です。組織培養プレートの従来の3D培養技術をマイクロ流体デバイスに変換することは、チャネルの寸法が限られているため、しばしば困難です。この方法では、ネイティブI型コラーゲンを修飾してポリカチオン性およびポリアニオン性コラーゲン溶液を生成し、層ごとに堆積してマイクロ流体デバイスで培養した細胞上に極薄コラーゲンアセンブリを形成できる技術について説明します。これらの薄いコラーゲン層は、初代肝細胞を例に示して示されるように、細胞の形態と機能を安定させ、マイクロ流体デバイスでの微小組織の長期培養を可能にします。

天然コラーゲンは、層ごとの堆積に使用するためのポリカチオンおよびポリアニオンコラーゲン溶液を作成するために、メチル化及びスクシニルを使用して変更することができます。サクシニル化は、スクシニル基を有する天然コラーゲンのεアミノ基を変更して、メチル化は、メチル基（ 図1A）と天然コラーゲンのカルボキシル基を修飾します。コラーゲンタンパク質のアミノ酸側鎖のこれらの修飾は、ソリューションのpH滴定曲線を変化させます。メチル化は、アミノ基に影響を及ぼさないし、カルボキシル基の数を減少させながら、スクシニル化は、天然コラーゲン（ 図1B）と比較して、アミノ基の数を減少させ、カルボキシル基の数を増加させます。これらの修飾は、コラーゲン分子の電荷特性を変化させます。サクシニル化は、正に荷電した基を除去し、負に帯電した基に置き換え、およびメチル化は、負に帯電した基を除去し（ 図1C &lt;/強いです&gt;）。 メチル化およびスクシニル化コラーゲン溶液（COL LBL）の層ごとの堆積は、そのような...

マイクロ流体デバイス内での機能的な微小組織の作成には、従来の細胞培養技術をマイクロデバイスの限られた空間次元に適応させることにより、細胞表現型の安定化が必要です。コラーゲンを改質することで、肝細胞などの初代細胞をマイクロ流体組織モデルとして安定化させることができる極薄のコラーゲン集合体を層ごとに堆積させることができます。

Microtissue安定化のためのマイクロ流体デバイスの層ごとのコラーゲン沈着

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

この手順の全体的な目的は、マイクロ流体デバイス内の細胞上に薄いコラーゲンアセンブリを堆積させることです。これは、まず酸性化した天然コラーゲンをメチル化し、正の正味電荷を持つコラーゲン分子を作成することで達成されます。第二のステップは、酸性化した天然コラーゲンを修飾して、負の正味電荷を持つコラーゲン分子を作成することです。次に、マイクロ流体デバイスを準備し、肝細胞を播種して、一晩置いて細胞を接着・伸展させます。最終ステップとして、正電荷および負電荷を帯びたコラーゲン溶液に細胞を交互にさらすことでコラーゲンアセンブリを堆積させ、細胞層の上に10層のコラーゲン二層膜を形成します。最終的に、位相差顕微鏡および免疫蛍光顕微鏡による観察、ならびにアルブミンおよび尿素のアッセイを用いて、細胞極性と分泌機能の発達および維持を示します。この手法の主な利点は、20年以上にわたってプレート培養に適用されてきた手法と同様の技術を用いて、マイクロデバイス内での肝細胞培養が可能になることです。複雑なデバイス設計は不要であり、堆積させたマトリックスは100 nmオーダーと非常に薄いのが特徴です。私たちは、従来の細胞培養技術をプレートからマイクロ流体デバイスへどのように移行させるかを検討していた際に、初めてこの手法を考案しました。コラーゲンサンドイッチ法はオープン・トップの顕微鏡システムで機能しますが、使用されるハイドロゲルは、チャネル高さが制限されている密閉型マイクロデバイスとは適合しません。天然の酸性コラーゲン溶液100 mgを、氷冷した滅菌水で0.5 mg/mLの濃度に希釈し、凝集を防ぐために溶液を氷上に置きます。次に、1 Nの水酸化ナトリウムを数滴加え、コラーゲン溶液のpHを9から10の間に調整し、室温で30分間緩やかに撹拌します。コラーゲンが沈殿し、溶液が濁り始めます。沈殿したコラーゲン溶液を 3000 ×g で 25 分間遠心分離します。その後、チューブの底に透明なゲル状の沈殿物が確認できるはずです。上清を吸引し、沈殿したコラーゲンを 0.1 N 塩酸を含む 200 mL のメタノールに再懸濁します。室温で 4 日間撹拌し、メチル化反応を進行させます。メチル化後、溶液を 3000 ×g で 25 分間遠心分離してメチル化コラーゲンをペレット化し、酸性メタノール上清を吸引して廃棄します。次に、メチル化コラーゲンを 25 mL の滅菌 PBS に溶解し、溶液を 60 µm のセルストレーナーでろ過します。1 N 水酸化ナトリウムを 20 µL ずつ加え、溶液の pH を 7.3 から 7.4 に調整します。市販のラットコラーゲン ELISA キットまたはヒドロキシプロリンアッセイキットを用いて、コラーゲン溶液の濃度を測定します。その後、滅菌 PBS を用いて溶液を 3 mg/mL に希釈します。メチル化コラーゲン溶液をねじ蓋付きのガラス瓶に移し、滅菌します。クロロホルム 3 mL を瓶の底に慎重に層状に重ね、4 °C で一晩静置します。翌朝に操作を行います。無菌的に、上層のメチル化コラーゲン層を取り除きます。メチル化コラーゲンは4°Cで保存し、1か月以内に使用してください。別途100 mgの天然酸性コラーゲン溶液を、氷冷した滅菌水を用いて0.5 mg/mLの濃度に希釈し、前述のように凝集を防ぐために溶液を氷上に置きます。水酸化ナトリウムでコラーゲン溶液のpHを調整し、室温で溶液を攪拌してコラーゲンを沈殿させます。次に、40 mgのsix cynic anhydrideを10 mLのアセトンに溶解させます。攪拌しながら、溶液のpHを継続的にモニタリングしつつ、この混合液を0.5 mLずつゆっくりとコラーゲン溶液に加えます。pHが9.0に近づいた際に1 Nの水酸化ナトリウムを1〜2滴加え、pHを9.0以上に維持しながら、室温で120分間連続的に攪拌します。6種類のシニカおよびヒドリド溶液をすべて添加した後、コハク酸コラーゲンが溶解して混合液が透明になることを確認し、pHが9.0以上に維持されているか定期的にチェックし続けます。コハク酸コラーゲンがすべて溶解したら、1 N塩酸を20 µLずつ加えて、溶液のpHを4.0に調整します。コハク酸コラーゲンが沈殿し、溶液が再び白濁することを確認してください。次に、溶液を3000 ×gで25分間遠心分離します。コハク酸コラーゲンをペレット化し、反応していないコハク酸無水物を含む酸性上清を除去した後、滅菌PBS 25 mLを加え、繰り返しピペッティングしてコハク酸コラーゲンを溶解させ、最終濃度を約3 mg/mLにします。その後、溶液を60 µmのセルストレイナーでろ過し、溶液のpHを7.3から7.4の間に調整します。1Nの水酸化ナトリウムを20 µLずつ加え、市販のラットコラーゲンELISAキットまたはヒドロキシプロリンアッセイキットを用いて溶液の濃度を評価します。その後、溶液を3 mg/mLに希釈します。滅菌済みのPBSを使用し、この処理済みコラーゲン溶液をメチル化コラーゲン溶液と同様の方法で滅菌します。まず、標準的な手法を用いて、細胞成長用のチャネル（高さ 100 microns、幅 0.4 ～ 1.5 millimeters、長さ 1 ～ 10 millimeters）を備えた細胞培養チャンバーを持つマイクロ流体デバイスを作製します。プラズマクリーナーを使用して、デバイスの表面とガラススライドを酸化させます。その後、両者を圧着して接合させます。デバイスをUV光に30分以上さらして滅菌した後、チャンバーに15 µg/mLのフィブロネクチンを含む滅菌PBSを満たし、37 °Cで45分間インキュベートします。次に、付属のテキストプロトコルに従って、デバイスに細胞を播種します。ラミナーフロー式組織培養フード内で、各デバイスにつき各溶液10回分に相当する十分な量のメチル化コラーゲン溶液および非メチル化コラーゲン溶液と、数ミリリットルの培地を用意します。これらの溶液は氷上で保持してください。デバイスを、20 µLのメチル化コラーゲン溶液と非メチル化コラーゲン溶液で交互に洗浄します。各回の適用間に1分間待機します。溶液ごとに計10回、デバイスをフラッシュします。コラーゲンの層を形成させる間、細胞が培地なしで置かれる時間を最小限にするため、迅速に作業してください。マイクロ流体デバイスの入口と出口にコラーゲンがゆっくりと蓄積していく様子が観察されます。流体の流れに対する抵抗が増加した場合は、デバイスを培地で1〜2回フラッシュし、その後積層を続けてください。すべての層を適用した後、デバイスを新鮮な培地で2回洗浄し、インキュベーターに戻します。メチル化およびアセチル化により、コラーゲン分子の電荷特性が変化します。アセチル化により正に帯電した基が除去され、負に帯電した基に置換され、メチル化により負に帯電した基が除去されて正に帯電した分子が形成されます。これにより、細胞などの帯電した表面上に2種類のコラーゲン変異体を層層的に堆積させることが可能になります。マイクロ流体デバイス内のフィブロネクチンでコーティングされたガラス上に播種された初代肝細胞に、この層層的なコーティングを施すことができます。コラーゲンマトリックスの構築において、細胞上に10層のバイレイヤーを堆積させると、約140ナノメートルのコラーゲン層が形成されます。これは、上層に層層的なコラーゲン層を持たない肝細胞と比較した結果です。マトリックスは、時間の経過とともに分化した表現型を失い、収縮してマイクロ流体デバイスの表面から剥離します。対照的に、極薄のコラーゲンアセンブリで被覆された肝細胞は、14日間にわたって分化した形態、90%以上の生存率、および極性を維持します。細胞の生存率、形態、極性に加えて、ここで示されるように、コラーゲン・レイヤーバイレイヤー法は初代肝細胞の機能を回復させ、安定させます。このビデオを視聴することで、コラーゲンをメチル化およびコハク酸エステル化して正電荷および負電荷を持つコラーゲン溶液を作成する方法と、それらをレイヤーバイレイヤー堆積に用いてマイクロ流体デバイス内の細胞上に薄いコラーゲンアセンブリを形成する方法について、十分に理解できるはずです。

layer-layer-collagen-deposition-microfluidic-devices-for-microtissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、細胞の捕獲と文化を可能にすることができるマイクロ流体デバイスの作製のためのプロトコルについて説明します。このアプローチではこのようなマイクロ流体チャネル内の溝のようなパターン化された微細構造は、セルがドッキングすることができる内に低せん断応力領域を作成するために使用されています。...

細胞挙動を研究するための溝パターンを用いたマイクロ流体デバイス

埋め込まれた細胞とその表面を含むモジュールと呼ばれる円筒状のコラーゲンゲルを、使用して、ミクロ組織の作成は、内皮細胞で被覆されている。...

コラーゲンゲル含有する細胞のモジュールを使用してマイクロ組織の作製

このモデルシステムは、非破壊における内因性コラーゲン（再）組織実時間を研究するために使用することができる筋線維芽細胞にポピュレートフィブリンゲルから始まる。モデル系は、それが別のセルソース、媒体添加剤と共に使用することができるように、非常に可変であり、特定のニーズに容易に適合させることができる。...

エンジニアリングフィブリンベースの組織の筋線維芽細胞と制約の適用からの構築と細胞とコラーゲン（再）組織を誘導するためにひずみ

この研究では、コラーゲン、平滑筋細胞、内皮細胞を直接培養することにより、生体血管組織を迅速に作製する技術を紹介します。さらに、人工血管組織の機械的特性評価のための新しいプロトコルについて説明します。...

エンジニアリング3D細胞化血管組織再生のためのコラーゲンゲル

私たちは、PDMS基質上にパターン化されたゲニピンとフィブロネクチンをマイクロ流体で堆積させる方法を提示します。これにより、血管平滑筋の細胞密度の高い組織の生存能力が延長されます。この組織作製法は、従来の血管筋薄膜技術と組み合わされ、疾患に関連する時間経過における血管の収縮性を測定する。...

マイクロパターン血管筋薄膜の拡張文化ためのマイクロ流体ゲニピン堆積技術

コラーゲンは、ECMのコアコンポーネントであり、移行からの分化・増殖に至るまで、いくつかの細胞プロセスに不可欠な手がかりを提供します。 3Dコラーゲンハイドロゲル内の細胞を埋め込むためのプロトコル、およびPDMSマイクロチャネルを使用して、ランダム化または整列コラーゲンマトリックスを生成するための、より高度な技術がここに提供します。...

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

この原稿は、内皮の生理学的特性を再現微小血管を設計するための射出成形方法を提供します。マイクロ流体ベースのプロセスは、このような流れ、細胞組成、幾何学、および生化学的勾配などの調整可能な条件、との特許の3D血管ネットワークを作成します。製造プロセスと潜在的な用途の例について説明します。...

微細と3D微小血管の組立

この記事では、軟骨細胞圧縮のための空気作動性マイクロ流体デバイスを製造し、特徴付けるための詳細な方法を提供します。...

動的圧縮で軟性細胞を刺激するマイクロ流体プラットフォーム

このプロトコルの目的は、生体整血、コラーゲンベースのヒドロゲル、心臓組織工学、薬物スクリーニング、および疾患モデリングにおける応用のために、心臓線維芽細胞(CF)と共培養された幹細胞由来心筋細胞で構成される、高度に整列したヒト心臓組織の三次元(3D)微小流体モデルの開発を説明し、実証することである。...

マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発

このプロトコルは、流体の流れ方向に沿って形状を変化させるマイクロ流体チャネルを使用して、3Dコラーゲンヒドロゲル(厚さ&lt;250 μm)内の繊維を整列させるための伸長ひずみ(伸張)を生成する方法を示します。結果として得られるアライメントは数ミリメートルにまたがり、伸張ひずみ速度の影響を受けます。...

長距離繊維配向によるマイクロエンジニアリング3Dコラーゲンヒドロゲル

ここでは、上皮組織恒常性の電気機械的調節を研究するために、独自の2層マイクロ流体デバイスを製造するためのプロトコルを提示します。この装置は、組織面に垂直な静的な生理学的電流を印加し、細胞間の接着、増殖、および押し出しに影響を与えます。生細胞イメージングと機械的ストレス測定により、これらのプロセスのメカニズムが明らかになります。...

2層マイクロ流体デバイスを用いた組織恒常性の電気機械制御の解明

学ぶ マイクロ流体デバイスにおける層ごとのコラーゲン沈着法。ヘパトサイトの表現型安定化と極性維持を実現する組織工学技術を探索する。極薄マトリックスによる細胞機能の長期保持が可能となる。

Microtissue安定化のためのマイクロ流体デバイスの層ごとのコラーゲン沈着

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