Microtissue安定化のためのマイクロ流体デバイスの層ごとのコラーゲン沈着

この手順の全体的な目的は、マイクロ流体デバイス内の細胞上に薄いコラーゲンアセンブリを堆積させることです。これは、まず酸性化した天然コラーゲンをメチル化し、正の正味電荷を持つコラーゲン分子を作成することで達成されます。第二のステップは、酸性化した天然コラーゲンを修飾して、負の正味電荷を持つコラーゲン分子を作成することです。

次に、マイクロ流体デバイスを準備し、肝細胞を播種して、一晩置いて細胞を接着・伸展させます。最終ステップとして、正電荷および負電荷を帯びたコラーゲン溶液に細胞を交互にさらすことでコラーゲンアセンブリを堆積させ、細胞層の上に10層のコラーゲン二層膜を形成します。最終的に、位相差顕微鏡および免疫蛍光顕微鏡による観察、ならびにアルブミンおよび尿素のアッセイを用いて、細胞極性と分泌機能の発達および維持を示します。

この手法の主な利点は、20年以上にわたってプレート培養に適用されてきた手法と同様の技術を用いて、マイクロデバイス内での肝細胞培養が可能になることです。複雑なデバイス設計は不要であり、堆積させたマトリックスは100 nmオーダーと非常に薄いのが特徴です。私たちは、従来の細胞培養技術をプレートからマイクロ流体デバイスへどのように移行させるかを検討していた際に、初めてこの手法を考案しました。

コラーゲンサンドイッチ法はオープン・トップの顕微鏡システムで機能しますが、使用されるハイドロゲルは、チャネル高さが制限されている密閉型マイクロデバイスとは適合しません。天然の酸性コラーゲン溶液100 mgを、氷冷した滅菌水で0.5 mg/mLの濃度に希釈し、凝集を防ぐために溶液を氷上に置きます。次に、1 Nの水酸化ナトリウムを数滴加え、コラーゲン溶液のpHを9から10の間に調整し、室温で30分間緩やかに撹拌します。

コラーゲンが沈殿し、溶液が濁り始めます。沈殿したコラーゲン溶液を 3000 ×g で 25 分間遠心分離します。その後、チューブの底に透明なゲル状の沈殿物が確認できるはずです。上清を吸引し、沈殿したコラーゲンを 0.1 N 塩酸を含む 200 mL のメタノールに再懸濁します。室温で 4 日間撹拌し、メチル化反応を進行させます。メチル化後、溶液を 3000 ×g で 25 分間遠心分離してメチル化コラーゲンをペレット化し、酸性メタノール上清を吸引して廃棄します。次に、メチル化コラーゲンを 25 mL の滅菌 PBS に溶解し、溶液を 60 µm のセルストレーナーでろ過します。

1 N 水酸化ナトリウムを 20 µL ずつ加え、溶液の pH を 7.3 から 7.4 に調整します。市販のラットコラーゲン ELISA キットまたはヒドロキシプロリンアッセイキットを用いて、コラーゲン溶液の濃度を測定します。その後、滅菌 PBS を用いて溶液を 3 mg/mL に希釈します。

メチル化コラーゲン溶液をねじ蓋付きのガラス瓶に移し、滅菌します。クロロホルム 3 mL を瓶の底に慎重に層状に重ね、4 °C で一晩静置します。翌朝に操作を行います。

無菌的に、上層のメチル化コラーゲン層を取り除きます。メチル化コラーゲンは4°Cで保存し、1か月以内に使用してください。別途100 mgの天然酸性コラーゲン溶液を、氷冷した滅菌水を用いて0.5 mg/mLの濃度に希釈し、前述のように凝集を防ぐために溶液を氷上に置きます。水酸化ナトリウムでコラーゲン溶液のpHを調整し、室温で溶液を攪拌してコラーゲンを沈殿させます。

次に、40 mgのsix cynic anhydrideを10 mLのアセトンに溶解させます。攪拌しながら、溶液のpHを継続的にモニタリングしつつ、この混合液を0.5 mLずつゆっくりとコラーゲン溶液に加えます。pHが9.0に近づいた際に1 Nの水酸化ナトリウムを1〜2滴加え、pHを9.0以上に維持しながら、室温で120分間連続的に攪拌します。

6種類のシニカおよびヒドリド溶液をすべて添加した後、コハク酸コラーゲンが溶解して混合液が透明になることを確認し、pHが9.0以上に維持されているか定期的にチェックし続けます。コハク酸コラーゲンがすべて溶解したら、1 N塩酸を20 µLずつ加えて、溶液のpHを4.0に調整します。コハク酸コラーゲンが沈殿し、溶液が再び白濁することを確認してください。

次に、溶液を3000 ×gで25分間遠心分離します。コハク酸コラーゲンをペレット化し、反応していないコハク酸無水物を含む酸性上清を除去した後、滅菌PBS 25 mLを加え、繰り返しピペッティングしてコハク酸コラーゲンを溶解させ、最終濃度を約3 mg/mLにします。その後、溶液を60 µmのセルストレイナーでろ過し、溶液のpHを7.3から7.4の間に調整します。

1Nの水酸化ナトリウムを20 µLずつ加え、市販のラットコラーゲンELISAキットまたはヒドロキシプロリンアッセイキットを用いて溶液の濃度を評価します。その後、溶液を3 mg/mLに希釈します。滅菌済みのPBSを使用し、この処理済みコラーゲン溶液をメチル化コラーゲン溶液と同様の方法で滅菌します。

まず、標準的な手法を用いて、細胞成長用のチャネル（高さ 100 microns、幅 0.4 ～ 1.5 millimeters、長さ 1 ～ 10 millimeters）を備えた細胞培養チャンバーを持つマイクロ流体デバイスを作製します。プラズマクリーナーを使用して、デバイスの表面とガラススライドを酸化させます。その後、両者を圧着して接合させます。

デバイスをUV光に30分以上さらして滅菌した後、チャンバーに15 µg/mLのフィブロネクチンを含む滅菌PBSを満たし、37 °Cで45分間インキュベートします。次に、付属のテキストプロトコルに従って、デバイスに細胞を播種します。

ラミナーフロー式組織培養フード内で、各デバイスにつき各溶液10回分に相当する十分な量のメチル化コラーゲン溶液および非メチル化コラーゲン溶液と、数ミリリットルの培地を用意します。これらの溶液は氷上で保持してください。デバイスを、20 µLのメチル化コラーゲン溶液と非メチル化コラーゲン溶液で交互に洗浄します。

各回の適用間に1分間待機します。溶液ごとに計10回、デバイスをフラッシュします。コラーゲンの層を形成させる間、細胞が培地なしで置かれる時間を最小限にするため、迅速に作業してください。マイクロ流体デバイスの入口と出口にコラーゲンがゆっくりと蓄積していく様子が観察されます。

流体の流れに対する抵抗が増加した場合は、デバイスを培地で1〜2回フラッシュし、その後積層を続けてください。すべての層を適用した後、デバイスを新鮮な培地で2回洗浄し、インキュベーターに戻します。メチル化およびアセチル化により、コラーゲン分子の電荷特性が変化します。

アセチル化により正に帯電した基が除去され、負に帯電した基に置換され、メチル化により負に帯電した基が除去されて正に帯電した分子が形成されます。これにより、細胞などの帯電した表面上に2種類のコラーゲン変異体を層層的に堆積させることが可能になります。マイクロ流体デバイス内のフィブロネクチンでコーティングされたガラス上に播種された初代肝細胞に、この層層的なコーティングを施すことができます。コラーゲンマトリックスの構築において、細胞上に10層のバイレイヤーを堆積させると、約140ナノメートルのコラーゲン層が形成されます。これは、上層に層層的なコラーゲン層を持たない肝細胞と比較した結果です。

マトリックスは、時間の経過とともに分化した表現型を失い、収縮してマイクロ流体デバイスの表面から剥離します。対照的に、極薄のコラーゲンアセンブリで被覆された肝細胞は、14日間にわたって分化した形態、90%以上の生存率、および極性を維持します。細胞の生存率、形態、極性に加えて、ここで示されるように、コラーゲン・レイヤーバイレイヤー法は初代肝細胞の機能を回復させ、安定させます。このビデオを視聴することで、コラーゲンをメチル化およびコハク酸エステル化して正電荷および負電荷を持つコラーゲン溶液を作成する方法と、それらをレイヤーバイレイヤー堆積に用いてマイクロ流体デバイス内の細胞上に薄いコラーゲンアセンブリを形成する方法について、十分に理解できるはずです。