Microtissue安定化のためのマイクロ流体デバイスの層ごとのコラーゲン沈着

この手順の全体的な目標は、マイクロ流体デバイスの細胞に薄いコラーゲンアセンブリを沈着させることです。これは、まず酸性化された天然コラーゲンをメチル化によって修飾し、正味の正に帯電したコラーゲン分子を作成することによって達成されます。2番目のステップは、酸性化された天然コラーゲンをイオンによって修飾し、正味の負に帯電したコラーゲン分子を作成することです。

次に、マイクロ流体デバイスを調製し、肝細胞を播種し、肝細胞を付着させて一晩で広げます。最後のステップは、細胞を正と負に帯電したコラーゲン溶液に交互にさらすことにより、コラーゲンアセンブリを沈着させ、細胞層の上に10個のコラーゲン二重層を作成することです。最終的には、相顕微鏡法、免疫蛍光顕微鏡法、アルブミンおよび尿素アッセイを使用して、細胞の極性と分泌機能の発達と維持を示します。

この技術の主な利点は、20年以上にわたってプレート培養に適用されているのと同様の技術を使用して、マイクロデバイスで肝細胞培養を可能にすることです。複雑なデバイス設計を必要とせず、堆積マトリックスは100ナノメートルのオーダーと非常に薄いです。この手法のアイデアを思いついたのは、クラスCapy細胞培養技術をプレートからマイクロ流体デバイスに変換する方法についてブレインストーミングを

コラーゲンサンドイッチ法はオープントップの顕微鏡系で機能しますが、使用されるハイドロゲルは、チャネルの高さが限られているクローズドマイクロデバイスとは互換性がありません。天然の酸性化コラーゲン溶液100ミリグラムを氷、冷水、滅菌水で0.5ミリグラム/ミリリットルの濃度に希釈し、溶液を氷の上に置いてアレーションを防ぎます。次に、1滴の正常水酸化ナトリウムでコラーゲン溶液のpHを9〜10に調整し、溶液を室温で30分間穏やかに攪拌します。

コラーゲンが沈殿すると、溶液は濁り始め、Gの3000倍に沈殿したコラーゲン溶液を25分間スピンダウンします。その後、透明なゲル状の沈殿物がチューブの底に見えるはずで、スナットを吸引し、次に沈殿したコラーゲンを200ミリリットルのメタノールに再懸濁し、0.1の通常の塩酸でメチル化遠心分離機の後4日間室温で攪拌しながらメチル化反応を起こすことができます。メチル化遠心分離機の4日間、メチル化コラーゲンをペレット化するために25分間Gの3000倍Gの溶液で溶液を攪拌しながらメチル化反応が起こるようにします。 次に、酸性化メタノールスーピネートを吸引して廃棄します。次に、メチル化コラーゲンを25ミリリットルの滅菌PBSに溶解し、60ミクロンのセルストレーナーで溶液をろ過します。

1つの通常の水酸化ナトリウムを20マイクロリットル刻みで使用して、溶液のpHを7.3〜7.4に調整します。.市販のラットコラーゲンELIZAキットまたはヒドロキシプロリンアッセイキットを使用して、コラーゲン溶液の濃度を評価します。次に、滅菌PBSで溶液を1ミリリットルあたり3ミリグラムに希釈します。

メチル化コラーゲン溶液をスクリューキャップ付きのガラス瓶に移して滅菌します。ボトルの底に3ミリリットルのクロロホルムを慎重に重ね、ボトルを摂氏4度で一晩セットします。翌朝。

無菌的に、上部のメチル化コラーゲン層を取り除きます。メチル化コラーゲンは摂氏4度で保存し、1か月以内に使用します。さらに100ミリグラムの天然酸性化コラーゲン溶液を氷、冷水、滅菌水で0.5ミリグラム/ミリリットルの濃度に希釈し、溶液を氷の上に置いて前述したようにデートを防ぎ、コラーゲン溶液のpHを水酸化ナトリウムで調整し、溶液を室温で攪拌してコラーゲンを沈殿させます。

次に、40ミリグラムの6つの無水皮酸を10ミリリットルのアセトンに溶解します。この混合物を0.5ミリリットル刻みでコラーゲン溶液にゆっくりと加え、攪拌しながら溶液のpHを継続的に監視します。pHが9.0に近づくにつれて、1滴または2滴の通常の水酸化ナトリウムを追加し、室温で120分間連続的に攪拌することにより、pHを9.0以上に維持します。

6つの皮肉と水素化物の溶液をすべて加えた後、コハク酸コラーゲンが溶解するにつれて混合物が透明になるのを観察し、pHが9.0を超えるままであることを確認するために定期的にチェックし続けます。コハク酸コラーゲンがすべて溶解したら、1つの正常な塩酸を20マイクロリットル刻みで使用して、溶液のpHを4.0に調整します。.溶液を観察し、コハク酸コラーゲンが沈殿するにつれて再び濁ります。

次に、溶液をGの3000倍で25分間遠心分離します。コハク酸コラーゲンをペレット化し、酸性化したスナットを非反応性の無水スニックで処分するには、コハク酸コラーゲンを25ミリリットルの滅菌PBSに繰り返しピペッティングして溶解し、最終濃度を1ミリリットルあたり約3ミリグラムにします。次に、60ミクロンのセルストレーナーで溶液をろ過し、溶液のpHを7.3〜7.4に調整します。

1つの正常水酸化ナトリウムを20マイクロリットル刻みで使用して、市販のコラーゲンラットELIZAキットまたはヒドロキシプロリンアッセイキットを使用して溶液の濃度を評価します。.次に、溶液を1ミリリットルあたり3ミリグラムに希釈します。滅菌PBSを使用して、この酸化コラーゲン溶液をメチル化コラーゲン溶液と同じ方法で滅菌します。

まず、高さ100ミクロン、幅0.4〜1.5ミリメートル、細胞増殖用のチャネルが1〜10ミリメートルの細胞培養チャンバーを備えた標準的な技術を使用してマイクロ流体デバイスを作製することから始めます。プラズマクリーナーを使用してデバイスの表面を酸化し、スライドガラスを使用します。次に、2つを一緒に押して結合を形成します。

少なくとも30分間紫外線にさらしてデバイスを滅菌した後。チャンバーに1ミリリットルあたり15マイクログラム、フィブロネクチンを滅菌PBSで満たし、摂氏37度で45分間インキュベートします。次に、付属のテキストプロトコルで説明されているように、セルを備えたデバイスを確認します。

層流組織培養フードでは、デバイスごとに各溶液を10回塗布するのに十分な量のメチル化コラーゲン溶液と、数ミリリットルの培地を準備します。溶液を氷の上に保ちます。20マイクロリットルのメチル化コラーゲン溶液と次に結合コラーゲン溶液を交互にフラッシングします。

各アプリケーションの間に 1 分間待機します。溶液ごとに合計10回デバイスをフラッシュします。細胞が培地がない時間を最小限に抑えるために迅速に作業し、コラーゲンの層を成長させながら、マイクロ流体デバイスの入口と出口にゆっくりと蓄積するコラーゲンを観察することができます。

流体の流れに対する抵抗が増加する場合は、デバイスをメディアで1〜2回洗い流してから、レイヤーを続けます。すべての層を適用した後、デバイスを新しい培地で2回すすぎ、インキュベーターに戻します。メチル化とイオン化は、コラーゲン分子の電荷特性を変化させます。

イオンは正に帯電した基を取り除き、負に帯電した基に置き換え、メチル化は負に帯電した基を取り除き、正味の正に帯電した分子を作り出し、細胞などの荷電表面の上に2つのコラーゲンバリアントを層ごとに堆積させることを可能にします。マイクロ流体デバイス内のフィブロネクチン被覆ガラス上に播種された初代肝細胞は、この層ごとに被覆することができる。コラーゲンマトリックスの集合体は、細胞上の10の二重層の沈着は、層ごとに上部コラーゲンなしで約140ナノメートルの肝細胞のコラーゲン層の厚さを作成します。

マトリックスは、分化した表現型の収縮を失い、時間の経過とともにマイクロ流体デバイスの表面から浮き上がります。対照的に、極薄のコラーゲンアセンブリで覆われた肝細胞は、分化した形態を維持し、生存率は90%を超え、14日間にわたって分極します。細胞生存率の形態学と分極に加えて、コラーゲン層ごとの技術は、ここに示されているように一次肝細胞の機能を回復し、安定させます、このビデオを見た後、コラーゲンをメチル化し、コハク酸化して正味の正と負に帯電したコラーゲン溶液を作成する方法と、マイクロ流体デバイスの細胞の上に薄いコラーゲンアセンブリを作成するために層ごとにそれらを使用する方法についてよく理解する必要があります。