Name: 無水物ナノ粒子のハイスループット糖鎖の合成と機能化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: 学ぶ自動化された溶液相合成法によるオリゴ糖のハイスループット合成と、ポリアンヒドリドナノ粒子への糖鎖修飾技術。この手法は抗原提示細胞への標的薬物送達システムの開発に貢献します。

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著者らは、財政支援のために米陸軍医学研究および資材コマンド（＃W81XWH-10-1から0806を付与）と国立衛生研究所（グラント＃U19 AI091031-01とグラント＃1R01GM090280）に感謝したいと思います。 BNは化学と生物工学のBalloun教授職を認識しNLBPは、学際的な工学のウィルキンソン教授職を認めるものです。我々は、ナノ粒子の機能化実験を行うには彼女の援助のためにジュリア·ベラに感謝します。

1。ハイスループット糖鎖合成<ol><li>前のdimannosideの自動合成に、適切に保護された糖供与体、通常はトリクロロと、アクセプターは、主にアルケニルフルオラスアルコールは、ベンチの上に合成される。 </li><li>プログラムはdimannosideの自動合成のために書かれています。基本的な自動化手順の概略図を図2に示されています。プログラムでは、プロモーターを添加する前に、ドナーとアクセプターの混合物を少なくとも30分間攪拌することが保証される。 </li><li>合成ドナー、アクセプターとtrimethylsilyltrifluoromethanesulfonateの溶液をジクロロメタンで作られています。トルエン、ジクロロメタンは、グリコシル化反応のために最も頻繁に使用されています。 </li><li>また、80％メタノール、100％メタノールで一時的な保護基の脱保護するための試薬の溶液を調製する。 </li><li>プログラムの開始前に、確実にそのrelat客室内にIVEの湿度が自動化チャンバ内の30％以上低くなっています。高湿度では、グリコシル化反応のために有害である。 </li><li>プログラムが開始されると、ロボットアームを順次反応バイアルにドナーとアクセプターのソリューションを転送します。その後、混合物を30分間撹拌する。 </li><li> -20のような低い温度は、°Cを達成することができる一般的に混合物にロボットアームの転送trimethylsilyltrifluoromethanesulfonateの0.2から0.3当量を、室温で次が。反応混合物を30分間撹拌する。 </li><li> 30分後、反応を停止し、小アリコートは、反応の進行状況を監視するために削除されます。完了していない場合は、反応を継続することができ、最終的に必要な時間は変更することができます。 </li><li>反応が完了したら、反応混合物を精製するためのC 8 F 17で修飾されたシリカゲルを含むフルオラス固相抽出（FSPE）カートリッジに転送されます。 </li><li>カート尾根​​は、最初の非フルオラス分を取り除くために80％メタノール - 水混合物（8 mL）で洗浄されています。 </li><li>その後、カートリッジが望ましいフルオラス·タグ付きの製品を得るために100％メタノールで洗浄されています。追加の精製が必要な場合は、マシンが停止し、反応生成物（s）は、追加の手段によって精製するために削除することができます。 </li><li>精製サイクルの後、ロボットアームを反応バイアルにナトリウムメトキシドを分配します。反応は、2時間撹拌した。完了していない場合は、この反応は、再び長い期間継続することができ、最終的に必要なプログラムされた時間を変更することができます。 </li><li>反応終了後、製品はFSPEにより精製された後、残留水を除去するために蒸発させ、無水トルエンに溶解に供した。 </li><li>所望の鎖長が標的分子について得られるまで、このサイクルは、（ステップ6から13から）が繰り返されます。 </li><li>自動化から得られた保護された製品は番目です。本発明は、さらに精製し、完全にそのような核磁気共鳴（NMR）分光法などの技法を特徴とする。それは、通常、爆発性の水素ガスとパラジウムが含まれるため、最終的な標的分子の完全な脱保護（残りのすべての保護基の除去）は、ルールとしてオートメーションプラットフォームの外で完了します。最後の脱保護工程は、オートメーション·プラットフォームの外にベンチ上で行った。最初のステップは、カルボン酸の生成したアルデヒドの酸化に続いてフルオラスタグの二重結合のオゾン分解であった。生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製した。最後のステップでは、パラジウム触媒の水素化によってベンジルエーテル基の脱保護した。製品は、純粋な最終製品を得るためにパラジウムを取り除くためにセライトパッドに通した。 </li></ol> 2。ハイスループットナノ粒子表面の機能化<ol><li>ハイスループットポリマーの合成とナノ粒子の製造は同じPR以下の実施されotocolとロボットは、最大ピーターセンら 19で説明した設定します。粒子の製造に使用される共重合体システムは、セバシン酸（SA）と1,6 -ビス（ パラ -カルボキシフェノキシ）ヘキサン（CPH）、1,8 -ビス（に基づいています。 パラ -カルボキシフェノキシ）-3,6 -ジオキサオクタン（CPTEG）とCPH。利用ロボットの蒸着装置の概略図は図1bに示されています。 </li><li>ナノ粒子の作製に続いて​​、ナノ粒子のライブラリを使用してチューブを含むホルダはリニアアクチュエータ、ステージに再接続されています。 </li><li>無水物粒子の表面に炭水化物の添付ファイルでは、2つの連続した反応から成るアミン-カルボン酸カップリング反応20が実行されます。 </li><li>最初の反応は、最初のプログラマブルシリンジポンプのシリンジが10当量の（式）（粒子表面の平均モルのカルボン酸濃度の当量）で満たされている1 - エチル-3 - （3 - ジメチルアミノプロピル）-CArbodiimide塩酸塩（EDC）と10当量。水溶液中でエチレンジアミン、第プログラマブルシリンジポンプのシリンジは、12式がロードされている。水溶液中でN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）の。 </li><li> LabVIEWプログラムを使用して、試薬の懸濁液は、ナノ粒子のライブラリ*に堆積される。 </li><li>次に、各サンプルは超音波処理されている（40 Hzで30秒）と、チューブホルダーは、ロボットプラットフォームから切り離されます。 </li><li>ナノ粒子懸濁液を4℃で一定の回転で9時間**をインキュベートする</li><li>反応時間が完了した後、チューブを遠心（5分間12000×gで）と二つの洗浄手順を実行するロボットステーションに返されます。 </li><li>第2シリンジポンプのシリンジを冷たい水で満たされている間に洗浄するために、注射器は空になり、最初のプログラマブルシリンジポンプにロードされたままになります。各チューブの上清は、空の注射器と第2ポンプ預金冷たい水の中に撤回されています。 </li><li>ナノの均質化ステップ2.6で説明したように粒子懸濁液が実行されます。チューブを遠心分離されている（5分間12000×g）で、ステップ2.9で説明されているように第二洗浄工程が実行されます。 </li><li>第二の反応は、2つの成膜工程が使用されます。第一の蒸着工程においては、12式。 EDCの一つのポンプと12式で読み込まれます。 NHSの第二のポンプがロードされます。 </li><li>第2の堆積工程は、10当量が含まれています。第一および第二ポンプ（すなわち、ガラクトース、ラクトースまたはジ-マンノース）***と10当量の第3ポンプ上の特定の糖の。のグリコール酸（コントロールとして使用****）。 </li><li> 4℃ステップ2.6で記述され、一定の回転で9時間インキュベートしたとして、ナノ粒子懸濁液を均質化される</li><li>反応時間が完了した後、手順2.8、2.9および2.10で説明したように、洗浄工程が実行されます。 </li><li>官能ナノ粒子のライブラリは、少なくとも2時間乾燥させ、真空チャンバ内に配置されています。 </li><li>官能性ナノ粒子は、その後の文字です。X線光電子分光法は、それぞれ表面組成と糖の濃度を決定するためのハイスループットフェノール硫酸アッセイによって特徴づけ。電子顕微鏡法と動的光散乱をスキャンすると粒子サイズ、サイズ分布、表面電荷を決定するために利用されています。 </li></ol>注：*沈着量が各チューブに含まれるナノ粒子の質量によって異なります。 第一および第二反応の**反応時間は、最終的な糖濃度を調整するために変更することができます。 ***各糖は、目的のグループに応じて試験管に堆積される。 脱糖は既にナノ粒子表面にさらに添付ファイルを可能にする共有結合し、この分子を持っているので、****炭水化物の結合のため、本研究で用いられる特定の反応については、グリコール酸は、リンカーの制御として使用されます。 3。代表的な結果 FUL図2に示すように、LY保護dimannosideは、自動化プラットフォームを用いて合成した。合成した化合物は、溶媒としてCDCl 3を用いてVXR 400 MHzの分光計で1 H NMRによって特徴付けられた。 NMRスペクトルを図3に示します。 無水物のハイスループットナノ粒子の作製と機能化を利用すると、本明細書に記載のナノ粒子は、dimannose、ラクトースおよびガラクトースの添付ファイルが正常に10、11に行われている。このセットを使用して、最適な反応条件（すなわち、反応温度と時間）は、所望のナノ粒子の機能化と形態を達成するために、同定された。反応は4℃で行った時°Cの代わりに室温で、ナノ粒子凝集の低下をSEMで観察した（データは示さず）。表1は、官能50:50 CPTEGの特性の代表的な結果を示しています。ジ-マンノースのいずれかでCPHナノ粒子または4で合成された乳糖、℃データは、官能基による平均粒子径の小さな増加を示している。非官能化ナノ粒子は約負のゼータ電位を有した。 -20 mVの、官能粒子は、ナノ粒子表面の正常な機能化を示す、正のゼータ電位値を示した。乳糖およびジ-マンノースは、両方の中性糖であるが、エチレンから遊離アミングループは、糖類を添付するために使用リンカは正のゼータ電位の責任があるかもしれませんジアミン。 反応時間は、ナノ粒子の最終的な形態と達成された砂糖の添付ファイルの程度の両方に影響を与える可能性があり、別の変数です。反応時間を調整することにより、ナノ粒子表面に付着し、最終的な糖濃度は、 図4Aに示すように制御することができます。予想通り、50:50 CPTEGの表面上のdimannoseの濃度：CPHは、ナノ粒子と共に増加反応の合計時間および18時間後に最大に達した。 24時間の総反応時間で官能ナノ粒子がマウス骨髄由来の樹状細胞（DC）上のCLRを対象とする彼らの能力を評価するために使用された。フローサイトメトリーは、2 CL受容体（すなわち、CIRE（CD209、DC-SIGN）とマンノース受容体（CD206））非官能で刺激した後、乳糖およびジ-マンノース官能性ナノ粒子（ 図4B）の発現を評価するために使用されていました。細胞は、乳糖およびジ-マンノースの官能ナノ粒子の両方を刺激したときに効果的なターゲティングを示している両方の受容体の高い発現は、得られた。しかし、ジ-マンノース官能粒子が研究された受容体は、このリガンドの特異性を示す発現の高いレベルを示した。 <table border="1"><tbody><tr><td> ナノ粒子の種類 </td><td> 平均粒子径（nm）の </td><td> アベニュー激怒粒子ζ-電位（mV） </td></tr><tr><td>非官能</td><td> 162±43 </td><td> -20±0.6 </td></tr><tr><td>乳糖</td><td> 235±34 </td><td> 26±2.4 </td></tr><tr><td>ジ-マンノース</td><td> 243±32 </td><td> 30±4.2 </td></tr></tbody></table> 表1。ナノ粒子のキャラクタリゼーション。非官能、官能は、準弾性光散乱とゼータ電位の測定によって特徴付けられた。粒度のデータは平均値±3つの独立した実験で収集された動的光散乱データの標準偏差（SD）を表す。ゼータ電位のデータは平均値±3の独立した測定値のSDを表しています。 CPHナノ粒子表面：ゼータ電位の符号の変化は、砂糖が50:50 CPTEGに効率的に結合させたを示しています。 <img alt="図1" src<html> = &quot;/ files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg&quot; /&gt; 図1糖無水物ナノ粒子の機能化と説明したハイスループットなアプローチで設計することができる官能基ナノ粒子のライブラリの例を追求したアプローチの（A）グラフィカルな表現。 （B）自動化された蒸着装置の模式図は、（i）3 NE千ポンプで構成されて粒子の機能化、のために利用し、（ii）ロボットのステージでは、2つのアクチュエータ（Zaber）によって統合された：x方向の運動のためのものと他のy方向の移動のための、3アクチュエータから成る二つの隣接するラック（チューブやキュベットに適した）、各方向に1つ（x、y、およびz）と（ⅲ）第二段階のロボット。ポンプとアクチュエータ5の合計は、直列に接続されています。アクチュエータとポンプは、LabVIEWソフトウェアを使用してコンピュータによって運営されています。この図は、スケールにはありません。arge.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig2.jpg" /> 図2の例としてマンノースを使用して、炭水化物の自動反復合成のグラフィカル表現です。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig3.jpg" /> 図3。保護dimannosideの1 H NMR。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig4.jpg" /> 図4（A） 糖鎖のナノ粒子表面濃度の反応時間の影響。示されたデータでは、50:50 CPTEG：CPHナノ粒子は、異なる反応時間でdimannoseで官能され、反応は4℃で行った二つの独立した官能の実験の平均と標準誤差が示されています。 （B）乳糖およびジ-マンノース官能性ナノ粒子得られた発現と比較してCPHナノ粒子：骨の官能50:50 CPTEGによる刺激後にこれらの2つのマーカーの発現増強によって示されるように骨髄由来樹状細胞上で効果的にターゲットDC-SIGN（CIRE、CD209）とマンノース受容体（CD206）非官能化粒子と。

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NLBPは、共同設立者であり、炭水化物会社LuCellaバイオサイエンス株式会社の株式を保持している

免疫細胞に直接ナノ粒子の相互作用に薬剤を標的として炭水化物の効果は以前に10、11に実証されている。私たちの研究室でこれまでの研究では、それによってさらにT細胞の活性化10、11のために重要であるかもしれない免疫細胞の活性を高め、無水物ナノ粒子に接続された特定の糖鎖は抗原提示細胞（APC）上で異なるのCLRをターゲットにすることができることが示されている。しかし、最適なターゲットにいくつかのパラメータ - このような無水物の化学的性質、サイズなどを達成するために、砂糖または表面の砂糖の種類を最適化する密度必要がありますので、このようなマルチパラメトリックシステムに関連付けられている発掘複雑に製造方法でスループットを向上させる大きな値になります。加えて、バイオセンシング、酵素固定化し、foodbの検出などの研究の他の関連分野への大きな値の場合の官能ナノ粒子の使用オルヌ病原体。 炭水化物の説明したハイスループット合成を利用することにより、炭水化物の分子の再現性の合成における課題を軽減することができます。同じ砂糖の自動並列反応は、必要に応じて材...

<table border="1"><tbody><tr><td> 名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>電動XYZステージ：3倍T-LSM050A、軸ごとに50ミリメートルの旅行</td><td> Zaberテクノロジーズ</td><td> T-XYZ-LSM050A-KT04 </td></tr><tr><td> NE-1000シングルシリンジポンプ</td><td>新しい時代のポンプシステム</td><td> NE-1000 </td></tr><tr><td>パイレックス* Vista *のリムレス再利用可能なガラスの培養試験管</td><td>コー​​ニング</td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td> ASW 1000年</td><td> Chemspeedテクノロジーズ</td><td></td></tr><tr><td> LabVIEWの</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td> 776671から35 </td></tr><tr><td> SGEガスタイトシリンジ、ルアーのLoc </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 509507 </td></tr><tr><td> XL-2000ソニケーター</td><td> Qsonica </td><td> Q55 </td></tr><tr><td>ミニチューブローテーター</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 05-450-127 </td></tr></tbody></table>

無水物ナノ粒子のハイスループット糖鎖の合成と機能化

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

そのような材料設計、ナノテクノロジー、化学、免疫学などの分野を含む学際的なアプローチが合理的に有効なワクチンキャリアを設計するために使用する必要があります。ナノ粒子ベースのプラットフォームでは、ワクチンの免疫原性1を向上させることがワクチン抗原の持続性を延長することができます。いくつかの生分解性ポリマーは、ワクチンの送達媒体1として研究されている、特に、無水物粒子は、安定したタンパク質抗原の徐放性を提供し、抗原提示細胞を活性化し、免疫応答の2-12を変調する能力を実証した。 これらのワクチンキャリアの分子設計、ポリマー特性の合理的な選択と同様に適切な標的剤の取り込みを統合する必要があります。リガンドとの官能粒子を標的とのハイスループット自動化された製造は、広いrを勉強する能力を向上させる強力なツールです。プロパティのアンジュと再現性のワクチン送達デバイスの設計につながるだろう。 10,11,13 C型レクチン受容体（のCLR）が上に存在する炭水化物を認識するパターン認識受容体（PRRS）は、免疫細胞上の特定の受容体により認識されることができる標的リガンドを加え調節することが示されており、合わせて免疫応答病原体の表面。のCLRを介した免疫細胞の刺激は、抗原、さらにT細胞の活性化14,15の後続のプレゼンテーションの強化された内在化が可能になります。したがって、炭水化物分子が免疫応答の研究に重要な役割を果たしているが、これらの生体分子の使用は、しばしば構造的によく定義されており、純粋な炭水化物の可用性の欠如に苦しんでいる。液相反応を反復に基づいて自動化プラットフォームでは、有意に低いbを使用して、これらの合成に挑戦分子の迅速かつ制御された合成を有効にすることができます従来の固相方法16,17よりもブロックの数量をuilding。 ここに我々はこのような中間精製用フルオラス固相抽出とマンノースベースの標的リガンドとして糖鎖の自動化された液相合成のためのプロトコルを報告します。炭水化物ベースの標的化剤を作るための自動化手法の開発後、我々は以前に10を説明したようにLabVIEWで動作し、自動ロボットのセットを採用した無水物ナノ粒子の表面に、その添付ファイルの方法について説明します。炭水化物と表面官能はのCLRの10,11をターゲットに 、マルチパラメトリックシステムに関連付けられている複雑さが大きな価値（ 図1a）になります発掘に製造方法のスループットを増加させる効果を示している。

この記事では、ハイスループット法は、抗原提示細胞上の特定の受容体を標的のさらなる使用のための無水物ナノ粒子の表面に糖鎖とその添付ファイルの合成のために提示されます。

材料設計、ナノテクノロジー、化学、免疫学などの分野を包含する超域的なアプローチを活用して、～を合理的に設計する必要があります。

このビデオ記事では、オリゴ糖の自動溶液相合成およびポリ無水物ナノ粒子の機能化のための、新しいハイドロプットプロトコルについて解説します。これらの糖鎖ベースの標的剤を用いるため、まず、固相合成装置ではなく溶液相合成を利用する自動化システムを用いて糖質分子を合成します。次に、得られたオリゴ糖中間体を、Florescent Solid Phase Extraction（FSPE）による固相抽出で精製します。合成された糖鎖分子をNMRで特性評価した後、カルボヒドラジド結合によりポリアンヒドリドナノ粒子に結合させます。最後に、糖鎖機能化ナノ粒子をX線光電子分光法およびヒドロキシルフェニル硫酸アッセイによって特性評価します。最終的に、ここで説明したヒドロキシル化手法を用いることで、ナノ粒子の形態および粒子表面の糖鎖密度を最適化するための反応条件が得られました。固相オリゴ糖合成などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、ビルディングブロックの使用量を大幅に削減できることです。本手法では、通常10～20当量の代わりに2～3当量を使用します。我々がこの手法を考案したきっかけは、抗炎症細胞上のCEACAM受容体を標的とするために多糖類を用いてポリヒドロキシナノ粒子を機能化し、表面効果の有効性を実証したときでした。その後、これら新規キャリアの作製および応用に関わる複数のパラメータをスクリーニングできる、ハイスループットシステムの設計を目指しました。オリゴ糖の高スループット合成およびポリマー粒子への結合のための自動化プラットフォームの開発は、十分な文書化がなされていない新しい研究領域であるため、本手法を視覚的に実演することは極めて重要です。diano acidの自動合成を行う前に、適切に保護された糖ドナー（通常はtri chloro acetamide）と、主にAlcon、フルオラスアルコールを含むアクセプターをベンチトップで合成し、クロロメタンで調製します。また、trimethyl silo、tri fluoro methane sulfonateをクロロメタン、80%methanol、および100%methanolで調製します。自動化チャンバー内の室内の相対湿度が30%以下であることを確認してください。高湿度は糖鎖付加反応にとって不利に作用します。以下の手順は自動化プラットフォームを用いて行われます。最初の糖鎖付加は、ドナーとフロリストアルコールを用いて実施します。完了後、得られたフロリストタグ糖分子をFSPEで精製します。次に、ナトリウム、メトキシド、およびメタノールを用いて一時的な保護基を除去し、再度、生成物をFSPEで精製します。その後、フロリストタグ糖をアクセプターとして用い、同一のドナーと結合させて二糖体を得ます。この二糖体をFSPEで精製し、準備を完了します。ドナーアクセプタープロモーター、80% methanol水、100% methanol、ナトリウムメトキシドを含む試薬をロボットプラットフォームにセットし、プログラムを開始します。ロボットアームがバイアルからドナー、次いでアクセプターを分注し、反応バイアルへと移送します。その後、ドナーとアクセプターの混合物を30分間撹拌します。30分後、ロボットアームが触媒のtrimethyl silo, tri fluoro, methane sulfonateを混合物に添加します。その後、溶液をさらに30分間撹拌します。撹拌の完了後、プログラムは一時停止します。10 µLのアリコートを分取し、薄層クロマトグラフィー（TLC）で反応が完了したかを確認します。反応が完了している場合、アクセプター分子は検出されません。反応が未完了の場合、TLC上でアクセプターが依然として確認できます。その場合はプログラムを停止し、糖鎖付加のタイミングを約30分にリセットした上で、プロモーターであるトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートを過剰量添加します。反応が完了したら、次のステップに進みます。反応完了後、ロボットが反応混合物を、精製用のC9 F17修飾シリカゲルを含むFSPEカートリッジに転送します。次に、カートリッジを8 mLの80% methanolで洗浄し、続いて8 mLの100% methanolで洗浄します。非floris画分を除去するため、フロースルーをバイアルに回収し、目的のflorisタグ付き生成物を得ます。さらなる精製が必要な場合は、ロボットを停止させ、適切な反応生成物を回収してください。構造によっては、ドナーの反応性が極めて低く、十分なプロモーターを添加した後でも一部のフローリスト受容体分子が残存する場合があります。その場合、FSPEでは精製効率が不十分となるため、ロボットアームが反応バイアルにナトリウムメトキシドを分注して精製を行った後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる追加精製を実施することがあります。その後、ロボットプラットフォーム内で2時間撹拌します。TLCで確認して反応が完結していない場合は、インキュベーション時間を約1時間延長してください。反応完了後、前述と同様にFSPEを用いて生成物を精製します。次に、ロボットから反応生成物を取り出し、ベンチトップ上で無水トルエンに溶解させ、その後、蒸発させて残留水を除去します。サンプルが乾燥したら、FSPEによるグリコシル化精製を含む同一のサイクルでロボットに戻します。目的分子の所望の鎖長が得られるまで、一時的な保護基の深層保護とそれに続く配糖化を繰り返します。自動化によって得られた保護生成物を脱保護するため、ロボットからバイアルを取り出します。手順の最終ステップでは爆発性の水素ガスを使用するため、自動化プラットフォーム外で実施する必要があります。ベンチトップ上で、フロリストタグの二重結合のオゾノリシスを行い、続いて生成したアルデヒドをカルボン酸に酸化させます。得られた生成物を、ジクロロメタンに30%のメタノールを混合した溶媒を用い、ベンチトップでのシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製します。最後に、パラジウム触媒を用いた水素化によりベンゾエーテル基を脱保護するため、生成物をサテライトパッドに通してパラジウムを除去し、純粋な最終生成物を得ます。核磁気共鳴またはNMR分光法を用いて、生成物の完全な特性評価を行ってください。ハイスループットなポリマー合成およびナノ粒子作製は、Petersonらによって記述されたプロトコルに従って行われます。付属文書に記載されている通り、粒子の機能化に使用される自動堆積装置は、3台のne 1000ポンプ、X方向およびY方向の移動用アクチュエータ2基を統合したロボットステージ、およびポンプの各方向に対して1基ずつ計3基のアクチュエータを備えた2つの隣接ラックを持つ第2のロボットステージで構成されており、計5基のアクチュエータが直列に接続されています。アクチュエータとポンプは、LabVIEWソフトウェアを使用したコンピュータによって制御されます。粒子作製に使用される共重合体系は、SEBA酸またはSAと、1,6-ビス(p-カルボキシフェニル)ヘキサン（CPH）および1,8-ビス(p-カルボキシフェニル)-3,6-ジオキサン（CPTeeg）に基づいています。ナノ粒子作製後、ナノ粒子ライブラリーを含む1.7 mL遠心チューブをセットしたラックをリニアアクチュエータステージに配置し、ポリアンハイドライド粒子の表面に炭水化物を結合させます。このため、2つの連続した反応からなる平均カルボン酸カップリング反応を行います。まず1回目の反応として、プログラマブルシリンジポンプのシリンジに、ナノ粒子1 mgあたり2 mgの濃度でEDCを、およびナノ粒子1 mgあたり0.6 mgの濃度でエチレンジアミンの水溶液を満たします。プログラム可能なシリンジポンプの2本目のシリンジに、ナノ粒子サンプル1つあたり計12等量に相当する、2.5 mg/mg粒子のNHSA水溶液を満たします。次に、LabVIEWプログラムを使用して、ナノ粒子ライブラリに試薬懸濁液を分注するようにロボットに指示します。すると、ロボットのアクチュエータがチューブホルダーをプラットフォーム上の正しい位置に移動させ、EDCおよびNHS溶液を分注します。ポリアンヒドリドナノ粒子の表面にあるカルボン酸基を活性化し、平均的なカップリングを可能にします。次に、超音波処理用プローブを各チューブに浸し、各サンプルを40 Hzで30秒間超音波処理します。次のサンプルに移る前に、プローブをアセトンで洗浄してください。すべてのサンプルの充填が完了したら、チューブホルダーをロボットプラットフォームから取り外します。ナノ粒子懸濁液を4°Cで一定速度で回転させながら9時間インキュベートします。最終的な糖濃度を調整するために、第1反応および第2反応の反応時間を変更することが可能です。反応終了後、チューブを12,000 ×gで5分間遠心分離します。低温環境を維持したまま、ロボットステーションに戻します。チューブホルダーをロボットアームに再度取り付け、ロボットプラットフォームの2番目のシリンジを満たします。冷水を使用する場合、最初のシリンジは空のままにしておきます。ロボットを起動します。各チューブの上清が空のシリンジに吸引され、同時に2番目のポンプがチューブに冷水を注入します。この工程は、ナノ粒子懸濁液から未反応の試薬を除去するために行います。次に、以前に示した方法で超音波処理を行い、ナノ粒子懸濁液を均質化します。その後、チューブを12,000 ×gで5分間遠心分離します。ロボット装置を用いて、2回目の反応負荷分に対し、冷水で2回目の洗浄を行います。1ナノ粒子サンプルあたり12当量のEDCを第1ポンプに、12当量のNHSを第2ポンプに充填します。ロボットプラットフォームを始動させ、ナノ粒子を含むチューブに適切な量を分注します。EDCとNHSの存在により、ナノ粒子表面にすでに結合しているエチレンジアミン由来のアミノ基と、保護糖のカルボキシル基との間にアミド結合が形成されます。堆積が完了したら、特定の糖類を10等量ロードします。本例では、乳糖および2台のポンプにあるグリコール酸コントロールを使用しました。各糖類は、各チューブで達成したい機能化に応じて試験管に堆積されます。これは、本研究で採用された特定の反応のためのアクチュエータおよびポンプ機能を動作させるために使用されるLabVIEWプログラムであらかじめ設定されています。炭水化物の結合において、深く保護された糖類には既にこの分子が共有結合しているため、ナノ粒子表面へのさらなる結合を可能にするリンカーコントロールとしてグリコール酸が使用されます。ナノ粒子懸濁液を前述と同様に超音波処理して均質化し、4 °Cで定速回転させながら9時間インキュベートします。インキュベート後、ナノ粒子懸濁液を遠心分離して上清を除去して洗浄し、ペレットを冷水で再懸濁して超音波処理します。機能化ナノ粒子ライブラリを含むチューブを真空チャンバーに入れ、少なくとも2時間乾燥させます。機能化ナノ粒子は、動的光散乱法およびその他の手法を用いて、表面組成、濃度、粒子径、粒度分布、および表面電荷を評価し、特性解析を行います。ここに示されている完全保護されたdiano側鎖は、オートメーションプラットフォームを用いて合成されました。合成された化合物は、VXR 400 megahertz分光計を用いたプロトンNMRにより特性評価されました。CDC 13を溶媒として使用し、いくつかの特性ピークの存在から、産物の生成を確認することができます。プロトンNMR図において、1.79から2.21までの4つのプロトンと3.38の2つのプロトンは、フローリストタグに由来します。2.16のシングレットピークはアセテートピークに対応し、4.94と5.11のピークはアノマープロトンであり、これらは反応時間がナノ粒子の最終的な形態および糖の結合度に及ぼす影響を評価するためのものです。ここに示すように、反応時間を長くすることでナノ粒子の機能化が行われ、50 50 CPT CPHナノ粒子表面のdiano濃度は全反応時間とともに増加し、18時間後に最大値に達しました。24時間の全反応時間で機能化されたナノ粒子を用い、ここに示すようにフローサイトメトリーを使用して、マウス骨髄由来樹状細胞上のCLRを標的とする能力を評価しました。機能化されていないナノ粒子、およびラクトースおよびマンノースで機能化されたナノ粒子による刺激後、C型レクチン受容体に対するDC-SIGNおよびマンノース受容体の発現上昇が観察されました。これは、効果的な標的化が行われたことを示しています。しかしながら、Diano機能化粒子はより高い発現レベルを示しており、このリガンドが研究対象の受容体に対して特異性を持つことが示唆されました。このビデオを視聴することで、オリゴ糖の高スループット自動合成およびポリナノ粒子の機能化の方法について十分に理解できるはずです。これらの糖鎖ベースの標的剤を用いる際、ドナーおよびアクセプターが保護された糖の合成と装置の組み立てを習得すれば、24〜48時間で完了させることができます。当然ながら、所要時間はライブラリーのサイズおよび機能化の時間に依存します。本手法を実施する際は、ナノ粒子の化学的性質に応じて、生分解性ポリヒドロ粒子の機能化における反応条件を最適化できることを覚えておくことが重要です。この手順に従うことで、さまざまな構造の炭水化物を合成し、異なる細胞受容体を標的として免疫学的結果に影響を与えることが可能です。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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無水物ナノ粒子のハイスループット糖鎖の合成と機能化

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