無水物ナノ粒子のハイスループット糖鎖の合成と機能化

このビデオ記事では、オリゴ糖の自動溶液相合成とポリアンヒナノ粒子の機能化のための新しいハイドロプットプロトコルについて説明します。これらの糖鎖ベースの標的化剤では、固相合成装置の代わりに溶液相合成を利用した自動システムを使用して、まず糖分子を合成します。次に、オリゴ糖中間体を花屋、固相抽出、またはFSPEで精製します。

生成された炭水化物分子はNMRによって特徴付けられ、次にcarbo IDE結合によってポリ無水物ナノ粒子に結合されます。最後に、炭水化物官能基化ナノ粒子は、X線光電子分光法およびハイドロプットフェニル硫酸アッセイによって特徴付けられます。最終的に、ここで述べたハイドロプット法を利用して、粒子表面上のナノ粒子の形態と糖密度を最適化する反応条件が得られました。

固体表面オリゴ糖合成のような既存のものに対するこの方法の主な利点は、この方法では、我々は大幅に少ない量のビルディングブロックを使用することです この方法では、通常、10〜20の同等物ではなく、2〜3つの同等物を使用します。この方法のアイデアは、表面効果の有効性、ポリハイドロナノ粒子の機能化、炭水化物を使用して抗へこみ細胞のceep受容体を標的とすることを示すときに最初に思いつきます。次に、これらの新しいキャリアの製造と応用に関与する複数のパラメーターをスクリーニングできるハイスループットシステムを設計したいと考えました。

オリゴ糖のハイスループット合成とポリマー粒子への結合のための自動化プラットフォームの開発は、ジアノ酸の自動合成に先立って多くのドキュメンテーションが利用可能で、新しい研究分野であるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。適切に保護された砂糖供与体は、通常、アルコンで主にアクセプターであるトリクロロアセトアミド、フルオロアルコールはベンチトップで合成され、クロロメタンで調製され、また、クロロメタン、80%メタノールおよび100%メタノール中のトリメチルサイロ、トリフルオロメタンスルホン酸塩を調製します。自動化チャンバー内の部屋の相対湿度が30%以下であることを確認してください。

高湿度はグリコシル化反応に悪影響を及ぼします。次の手順は、自動化プラットフォームを使用して行われます。最初のグリコシル化は、ドナーと花屋のアルコールで行われます。

一旦完了すると、得られた花屋タグ糖分子はFSPEによって精製されます。その後、一時的な保護基をナトリウム、メタキシド、メタノールで除去し、再度FSPEで精製します。その後、花屋の札の砂糖はアクセプターとして使用され、二糖類を得るために同じドナーに結合され、二糖類はFSPEによって精製されます。

ドナーアクセプタープロモーター、80%メタノール水、100%メタノール、メトオキシドナトリウムなどの試薬をロボットプラットフォームにセットし、プログラムを開始します。ロボットアームは、ドナーを引き出し、次にアクセプターをバイアルから引き出し、反応バイアルに移します。次に、ドナーとアクセプターの混合物を30分間攪拌します。

30分経過後。ロボットアームは、触媒的なトリメチルサイロ、トリフルオロ、メタンスルホン酸を混合物に移します。次いで、溶液をさらに30分間撹拌し、攪拌が完了した後、プログラムは一時停止する。

10マイクロリットルのアリコートを取り出して、薄層クロマトグラフィーで反応が完了しているかどうかを確認します。反応が完了すると、アクセプター分子は見えなくなります。反応が完了していない場合でも、TLC上のアクセプターはまだ見えます。

その場合は、プログラムを停止し、グリコシル化のタイミングを30分前後でリセットし、プロモーターであるトリメチルシロ、トリフルオロ、メタンスルホン酸を過剰に追加してください。反応が完了したら、次のステップに進みます。反応が完了すると、ロボットは反応混合物をC nine F 17修飾シリカゲルを含むFSPEカートリッジに移して精製します。

次に、カートリッジを80%メタノールの8ミリリットルで洗浄し、続いて8ミリリットルの100%メタノールで洗浄します。非フローリス画分を除去するために、フロースルーをバイアルに集めて、目的のフローリストタグ付き製品を取得します。追加の精製が必要な場合は、ロボットを一時停止して、適切な反応生成物を取り出します。

構造によっては、ドナーは非常に反応性がなく、十分なプロモーターを添加した後でも花屋のアクセプター分子が残ります。この場合、FSPEは精製に十分な効率が得られず、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる追加の精製は、ロボットアームが反応バイアルにメトキシドナトリウムを分注した後に実行できます。次いで、反応をロボットプラットフォーム内で2時間攪拌し、TLCが決定したように完了していない場合は、インキュベーション期間を約1時間延長する。

反応終了後、生成物は以前と同様にFSPEによって精製されます。次に、ロボットから反応生成物を取り出し、無水トルエンに溶解させたベンチトップ上で、蒸発させて残留水分を除去します。サンプルが乾燥したら、FSPEによるグリコシル化精製を含む同じサイクルでロボットに戻します。

一時的な保護基の深い保護とそれに続くグリコシル化は、標的分子が自動化から得られた保護された製品を保護するために所望の鎖長が得られるまで繰り返され、バイアルをロボットから取り出します。手順の最終ステップは爆発性水素ガスを利用し、自動化プラットフォームの外部で実行する必要があります。ベンチトップオンスでは、花屋タグの二重結合の溶解が起こり、生成されたアルデヒドがカルボン酸に酸化されます。

得られた生成物を、ジクロロメタン中の30%メタノールの混合物を使用して、ベンチトップ上のシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製します。最後に、パラジウム触媒水素化によってベンゾエーテル基を保護するために、製品をサテライトパッドに通してパラジウムを取り除き、純粋な最終製品を得る。核磁気共鳴またはNMR分光法を使用して、製品を完全に特性評価します。

高スロープットポリマー合成およびナノ粒子作製は、Petersonらによって記載されたプロトコルに従って行われる。添付の文書で参照されているように、粒子の機能化に使用される自動堆積装置は、3つのne 1000ポンプ、2つのアクチュエータによって統合されたロボットステージ、1つはX方向への移動用、もう1つはY方向への移動用、および2つのロボットステージは3つのアクチュエータからなる2つの隣接するラックで構成されています。 各方向に1つずつ、ポンプと合計5つのアクチュエータが接続されています。直列アクチュエータとポンプは、ラボビューソフトウェアを使用してコンピュータによって操作されます。

粒子製造に使用される共重合体システムは、SEBA酸またはSAと1つの6ビス、パラICカルボキシ、オキシルヒーンまたはCPHおよび1つの8BISパラカルボキシフェノキシ36ジオキサンまたはCPティーグに基づいています。ナノ粒子作製に続いて、ナノ粒子ライブラリーをリニアアクチュエーターステージに含んだ1.7ミリリットル遠心分離管を収納したラックをリニアアクチュエーターステージに取り付け、ポリアンヒ粒子の表面に炭水化物を付着させ、最初の反応として2つの連続した反応からなる平均カルボン酸カップリング反応を行います。プログラム可能なシリンジポンプ内のシリンジに、EDCとエチレンジアミンの水溶液を、ナノ粒子1ミリグラムあたり2ミリグラムおよびナノ粒子1ミリグラムあたり0.6ミリグラムの濃度で満たします。

プログラム可能なシリンジポンプで2番目のシリンジに、ナノ粒子サンプルあたり合計12当量のNHSA粒子、水溶液1ミリグラムあたり2.5ミリグラムを満たします。次に、ラボビュープログラムを使用して、試薬懸濁液をナノ粒子ライブラリに堆積するようにロボットに指示します。その後、ロボットアクチュエーターは、チューブホルダーをプラットフォーム内の正しい位置に移動し、溶液、EDC、NHSの分注を行います。

ポリ無水物ナノ粒子の表面上のカルボン酸基を活性化し、平均結合を可能にします。次に、超音波処理プローブを各チューブに沈め、各サンプルを40ヘルツで30秒間超音波処理します。次のサンプルに移動する前に、プローブをアセトンで洗浄してください。

すべてのサンプルが満たされると、チューブホルダーがロボットプラットフォームから取り外されます。ナノ粒子懸濁液を4°Cで一定回転させながら9時間インキュベートします。1次反応と2次反応の反応時間を変更して、最終糖の濃度を調整することができます。

反応が完了したら、チューブを12, 000倍Gで5分間遠心分離します。寒い環境では、ロボットステーションに戻ります。チューブホルダーをロボットアームに再度取り付け、ロボットプラットフォームの2番目のシリンジを満たします。

冷水では、最初の注射器は空のままにする必要があります。ロボットを起動します。各チューブの上清は空のシリンジに引き込まれ、2番目のポンプはチューブに冷水を沈殿させます。

このステップは、ナノ粒子懸濁液から非反応性試薬を除去するために実行されます。次に、前に示したように超音波処理によりナノ粒子懸濁液を均質化します。次に、チューブを12, 000倍Gで5分間遠心分離します。

第2の反応には、ロボット装置を使用して冷水で2回目の洗浄を行い、EDCのナノ粒子サンプルあたり12相当を第1のポンプに、NHSのナノ粒子サンプルあたり12相当を第2のポンプに負荷します。ロボットプラットフォームを起動して、ナノ粒子を含むチューブに適切な量を分注します。EDCとNHSの存在により、ナノ粒子表面にすでに付着しているエチレンダイトのアミン基と、深部保護糖のカルボン酸基との間にアミド結合が形成されます。

堆積が完了したら、特定の糖類の10相当量をロードします。この場合、ラクトースを使用し、グリコール酸を2つの利用可能なポンプで制御しました。各糖類は、各チューブで達成するために所望の機能化に応じて試験管に堆積され、これは以前にラボビュープログラムでプログラムされ、使用される特定の反応のためのアクチュエータおよびポンプ機能を作動させるために利用される特定の反応のためのこの研究では、グリコール酸は、深く保護された糖類がすでにこの分子を共有結合しているので、リンカー制御として使用される。 これにより、ナノ粒子表面へのさらなる付着が可能になります。

ナノ粒子懸濁液を前と同様に超音波処理により均質化し、次いで摂氏4度で一定回転させながら9時間インキュベートする。ナノ粒子懸濁液を遠心分離機でインキュベート洗浄し、上清を除去した後、Resusはペレットを冷水に懸濁し、官能基化ナノ粒子ライブラリーを含むチューブを真空チャンバーに音波で置き、少なくとも2時間乾燥させます。官能基化ナノ粒子は、動的光散乱法などにより、表面組成、濃度、粒子サイズ、サイズ分布、表面電荷を評価する方法が特徴です。

ここに示されている完全に保護されたダイアノ側は、自動化プラットフォームを使用して合成されました。合成された化合物は、VXR 400メガヘルツ分光計のプロトンNMRによって特徴付けられました。CDC 13を溶媒として使用すると、いくつかの特徴的なピークの存在から生成物の形成を確認できます。

陽子NMR図では、1.79から2.21までの4つの陽子と3.38の2つの陽子は花屋タグからのものです。2.16の一重項ピークは4.94のアセテートピークピークに対応し、5.11はナノ粒子の最終形態に対する反応時間の影響と達成される糖結合の程度を評価するためのアノマープロトンです。ナノ粒子は、ここに示すように反応時間が長くなるにつれて官能基化され、50 50 CPT CPHナノ粒子の表面上のジアノ濃度は、反応の合計時間とともに増加し、18時間後に最大に達した。

次に、合計24時間の反応時間で官能基化されたナノ粒子を使用して、ここに示すようにフローサイトメトリーを使用してマウスの骨髄由来樹状細胞上のCLRを標的とする能力を評価しました。DCサインとマノ受容体のC型レクチン受容体への発現増加は、非官能基化ナノ粒子、ラクトースナノ粒子、ダノ官能基ナノ粒子による刺激後に観察されました。これは、効果的なターゲティングを示しています。

しかし、Diano官能基化粒子はより高い発現レベルを示し、このリガンドが研究対象の受容体に対して特異性を示すものでした。このビデオを見れば、オリゴ糖のハイスループット自動合成とポリナノ粒子の機能化の方法についてよく理解できるはずです。これらの糖質ベースをターゲティング剤で使用し、ドナーアクセプター保護糖の合成を習得すれば、装置の組み立ても24〜48時間で行うことができる。

もちろん、時間の長さはライブラリのサイズと機能化時間によって異なります。この方法に参加する際には、ナノ粒子の化学的性質に応じて、生分解性ポリハイドロ粒子の機能化の反応条件を最適化できることを覚えておくことが重要です。この手順に従うことにより、炭水化物のさまざまな構造を合成して、免疫学的結果に影響を与えるさまざまな細胞受容体を標的にすることができます。