ラットの脾細胞からT細胞増殖因子の準備

こんにちは、クリスティン・ビートンです。私は、カリフォルニア大学アーバイン校の生理学・生物物理学部のジョージ・チェン研究室の助手研究員です。そして、次の2日間で、T細胞成長因子の略であるTCGFの作り方をお見せします。

ですから、私たちの日常的な細胞培養では、培地中のサイトカインの組成について正確な知識が必要ない場合、私たちが使用するのはT細胞増殖因子であり、これはSplCY培養からのS上清であり、T細胞の増殖を助けるために必要なサイトカインを含んでいます。ですから、TCGFを準備する方法は、健康なルイラットを殺し、その脾臓を採取し、単一細胞懸濁液を準備し、赤血球を取り除き、その後、単核細胞をコンカーニバルで刺激し、T細胞が成長に必要なすべてのサイトカインを生成するように誘導することです。TCGFを生成するには、セルを活性化する必要があります。

そこで、その方法は、細胞培養にcorona Aと略されるレクチンコンバルを追加することです。ですから、細胞培養にコンクを添加すると、グリコシル化されたT細胞受容体複合体に結合し、同時にいくつかの複合体に結合することで、キャッピングと呼ばれることが可能になります。つまり、細胞の表面にすべての受容体が凝集し、クラスターを作り、それがTリンパ球に活性化シグナルを誘導

つまり、細胞が活性化された後、細胞は爆発するのです。つまり、彼らは肥大し、その後、サイトカインを分泌し始めるのです。ですから、当初はTCGFは主にインターロイキン2だと思っていましたが、今ではそうではないことが分かっています。

また、インターフェロン、ガンマ、TNFアルファ、そしておそらく、48時間後に細胞を生かすために必要な非常に少量のサイトカインも含まれています。そこで、細胞を除去し、細胞を除去して上清だけになったときでも、スナットにはまだ遊離円錐形が残っています。私たちは、T細胞増殖因子を使用してT細胞株を成長させ続けたいと考えているため、これは問題になるでしょう。

そして、そこにコンテナを空けておくと、セルがアクティブになりたくないときにセルが活性化されます。そこで、この問題を回避するために、アテ内のすべての遊離コンクに結合する砂糖を過剰に加えます。そのため、TCGFを培養物に加えると、完全に不活性化され、細胞上の他のグリコシル化受容体に結合しなくなります。

それでは始めましょう。この実験の最初のステップは、安楽死の直後にラットから脾臓を取り出すことです。だから、それが滅菌器具を使ってすぐにやることです。

そして、脾臓を取り出したら、抗生物質を補充したPBSに入れ、抗生物質としてペニシリンとストレプトマイシンを使用します。それでは始めましょう。そこで、私はラットに70%エタノールをスプレーして、私の培養物に背の高い汚染がないことを確認します。

そして、私の器具を使って、ここの皮膚に小さな切り込みを入れます。次に、筋肉の層を取り除くと、脾臓がここに現れます。そこで、他のピンセットを取り、脾臓を傷つけずにそっと引き出します。

このように結合組織を切除します。だから今、私は脾臓を持っています。もちろん、腹腔内の他の部分を傷つけないように細心の注意を払っています。腸にダメージを与えると、すぐに脾臓が汚染

そして、PBSと抗生物質が入ったチューブに脾臓を移します。そして、このチューブは氷の上に置いています。それで、今、私は3匹のネズミから脾臓を収穫しました。

ですから、私たちはこれらの脾臓から単細胞懸濁液を準備する準備ができました。そこで、脾臓を手に入れたので、脾臓を組織培養に持ち込み、70ミクロンのセルトレーナーを使用して、脾臓から単一細胞懸濁液を調製しました。ですから、脾臓から単細胞懸濁液を作るためには、いくつかのものが必要になります。

滅菌器具、鉗子1組、ハサミ1組が必要です。次に、ペトリ皿に滅菌された1ミル注射器のプランジャーがあります。脾臓をPBSと抗生物質に入れるつもりです。

また、別のシャーレでは、10ミリリットルのPBSと抗生物質に70ミクロンのセルストレーナーを入れました。最初のステップは、脾臓がきれいであることを確認することです。なぜなら、ここで見ることができるように、まだ結合組織の小さな断片があり、細胞ストレーナーを非常に速く詰まらせるため、それらを取り除くつもりです。そのために、不要なものを切り取って、ペトリ皿の蓋に捨てるだけです。

だから今、私の脾臓はほとんどきれいになっているので、脾臓を1つずつ取り、セルトレーナーに入れて細かく切り、3つの脾臓すべてを混ぜます。次のステップは、単一細胞懸濁液を作成することです。もちろん、私は何でも欲しいので、セルトレーナーにはまったく触れず、滅菌済みの1ミル注射器のプランジャーを使用して、セルトレーナーを通して脾臓の部分を押します。

そして、セルトレーナーの外側でわかるように、私はシングルセル懸濁液を作っています。だから、初めてのときはまだ脾臓の小さな破片がいくつかあるのですが、すでに単細胞懸濁液を取り出すつもりです。私はすでにそれを氷の上に保存した50ミルのチューブに移しています。

そして、セルストレーナーにさらに10ミルのPBSと抗生物質を補充します。ですから、私はPBSを抗生物質と一緒にさらに約10ミル服用しますが、正確に10分である必要はなく、ただ洗っているだけです。セルストレーナーに入れてから、同じ手順で行います。

シリンジプランジャーに戻り、OCIDをもう少し押し込みます。ですから、もちろん、細胞ストレーナーに残る結合組織や、取り除くことができなかった脂肪の小さな片があるので、すべてを乗り越えることはできません。しかし、あなたは細胞ストレーナーのためにあなたの脾臓の大部分を得るべきです。

そして、先ほどやったことを正確に繰り返します。私は私の単一細胞懸濁液を収穫し、それを同じ歯に加えるつもりです。今では、セルスクリーナーには画面からほとんど何も残っておらず、出てくるPBSははるかに鮮明ですそして、私は単にもう一度洗うつもりです、そして私たちは今頃ほとんどの細胞を取り出しているはずです。

さて、PLE細胞の単一細胞懸濁液ができたので、パレット化するためにスピンダウンします。したがって、8〜10分間回転するだけで十分です。これで、PLE細胞をスピンダウンし、素敵なパレットを手に入れました。

ですから、私がやろうとしていることは、上澄み物を取り除き、次に赤血球を嘘をつくことです。そこで、筋細胞を懸濁させて、塩化アンモニウムを入れます。つまり、SUはOHポイント15モルの塩化アンモニウムの溶液で、脾臓あたり5ミリリットルを使用します。

脾臓が3つあったので、15ミリリットルの塩化アンモニウムを使用し、それを氷の上で行います。赤血球を横たえるために、3分間、赤血球を優しく上下にパイプでつなぎます。さて、ここでは露出の多い方でこのテイクを使用します。

さて、今度は3分間、電気細胞を解析しました。私はPBSで私のチューブをいっぱいにするつもりです、またはあなたはまた媒体を使うことができます。これは、溶液の浸透圧を細胞の正常範囲に戻すためです。

そして、以前と同じように細胞を回転させて、8〜10分間ペレット化します。そして、同じPBSと抗生物質を使って2回洗います。ですから、今では、電気細胞を初期化した後、細胞を下に広げていますが、電気細胞が100%放出されることはない心配はありません。

そのため、パレットはまだ赤くなりますが、上澄みはより明確になります。そして今、私は上澄みを空にし、パレットを壊し、最大50ミルのPBSを追加し、スピンダウンしてそのステップをもう一度繰り返して、2回の洗浄を行い、その後、自分自身を数えることができるようにします。私は筋細胞を2回洗浄し、その後、培地に懸濁し、サイトメーターを使用して数えました。

予想通り。3つの脾臓から約6億個の細胞が得られましたが、これは通常、1つの脾臓から2億から2億5000万個の細胞が得られると予想されています。そこで、これからやろうとしていることは、10%の胎児用血清を添加した培地に、1ミルあたり200万個の細胞を播種することです。

そして、その培地にコンクAのミルあたり2マイクログラムを追加して、細胞を刺激します。その後、細胞をインキュベーターに48時間入れるだけです。細胞はインキュベーターに48時間置かれており、これからお見せするように、かなりよく成長しています。

メディウムがオレンジ色に変わりました。さて、TCGFの準備を終える準備が整いました。覚えていると思いますが、私は細胞を活性化するために、細胞懸濁液にコンカーニバルを追加しました。

つまり、aのコンカーニバルはレクチンです。T細胞のすべての受容体の糖に結合し、それらすべての細胞を人工的に活性化します。私たちが今抱えている問題は、細胞S上清の中に、まだaにcon carnavalの一部があることです。

また、他のT細胞培養ではスナットを使用して細胞を増殖させるため、それらの細胞培養物にコンカーニバルが存在することは望ましくありません。それで、それを取り除くために、私がやろうとしていることは、aのcon navalが結合する過剰な糖を追加することです、そしてそれはここに示されているメチルアルファD細胞です。そして、この砂糖を過剰に加えて完全に溶かします。

そして、それが終わったら、細胞の上清を滅菌フィルターでろ過し、今後数週間または数ヶ月で使用するためにアリの液体を凍結するつもりです。それでは、この最後のステップから始めましょう。そこで、細胞培養の上清を50ミルのチューブに加え、回転させて細胞を除去できるようにしています。

ですから、必要な数のチューブを充填するだけで、培養フードではそうはしませんが、最終的には溶液をろ過する方法が必要なので、無菌ではない砂糖を加えているので、ベンチでそれを行います。その方が簡単です。私は今、すべての細胞と上清を50ミルのファルコンチューブに注ぎました。

そこで、遠心分離機に持って行き、約10分間回転させます。そして、それらを回転させる唯一の理由は、細胞をペレット化して、透明な上清を得るためです。細胞が下に広がっているので、上清がはっきりしていて、それが私が収集したかったものです。

そこで、すべての上澄みをきれいな150平方センチメートルのフラスコに集めます。そして、このフラスコに砂糖を加えます。そこで、細胞がスピンダウンしている間に、上清液1mlあたり15ミリグラムを追加するのに十分な砂糖の重さを量りました。

完全に溶かして溶かし、その後、上澄みを滅菌ろ過します。だから今、私は上澄み液のmlあたり15ミリグラムの砂糖を加えるつもりです。キャップを元に戻し、無菌状態で作業していないので、キャップに食べ物が入っても問題ないので、砂糖がすべて溶けるまで混ぜます。

これはかなり速いはずです。はい、砂糖はすべて溶解しました。だから、私がしなければならないのは、滅菌フィルターが上清であり、それからそれを分注するつもりです。

ですから、通常、私はマイナス20度で保管する10〜15ミルのアリコートを行います。そのようなアリコートは数ヶ月間保存することができます。TCGFを冷蔵庫に保管することもできますが、その後10〜15日以内に使用します。

この2日間で、T細胞成長因子の調製方法をお見せしましたが、この上清は非常に簡単に作ることができ、非常に安価に調製できます。そのため、研究室では、高価なサイトカインカクテルを購入することなく、T細胞株を培養で維持するために非常に頻繁に使用しています。だから、あなたの実験で頑張ってください。