免疫調節化合物のスクリーニングのための人工リンパ球を用いた蛍光ベースのアッセイ

トランスジェニックマウス由来Tリンパ球の懸濁液を含む蛍光適合マルチウェルプレートから始めます。

これらのリンパ球は、T細胞受容体または免疫調節化合物とのTCR結合によって制御される緑色の蛍光タンパク質またはGFP発現カセットを含んでいます。

異なる電位を持つ免疫調節化合物を含む溶液で各ウェルを処理します。

インキュベーション中、免疫調節化合物はTリンパ球上のTCRと相互作用します。

刺激化合物とのTCR相互作用は、遺伝子カセットの活性化を引き起こし、GFP発現を上昇させます。

対照的に、阻害化合物とのTCR相互作用は遺伝子カセットを阻害し、GFP発現を減少させます。

次に、細胞に核酸蛍光色素を重ねて核を染色します。

プレートを遠心分離して細胞を沈降させ、正確な蛍光測定を行います。

蛍光顕微鏡下では、生Tリンパ球は細胞核と緑色蛍光タンパク質に対応する2つの蛍光シグナルを示します。

緑

色蛍光の強化は T リンパ球の刺激が成功したことを意味し、細胞内かすかな緑色蛍光シグナルは T リンパ球に対する免疫調節化合物の阻害効果を確認します。

低分子ハイスループットスクリーニングの場合は、384ウェルプレートにウェルあたり40マイクロリットルの細胞をプレートし、細胞培養インキュベーターで希望の処理期間、選択した薬物またはビヒクルで適切なウェルを処理します。

GFP分析の30分前に、適切な濃度のヘクスト溶液で細胞を染色し、穏やかなピペッティングで染色を完全に分散させます。すべてのウェルが染色されたら、プレートを遠心分離してウェルの底に細胞を集め、細胞を室温で15分間休ませます。

製造元の指示に従ってプレートをロードします。次に、対物レンズを40倍以上に設定します。UVランプにカメラ番号4を設定し、レーザー488にカメラ番号1を設定します。プレートをハイコンテントスクリーニングシステムにロードします。次に、自動共焦点ハイコンテントスクリーニングシステムを、ウェルあたり6〜10フィールドを読み取り、488ナノメートルとUV光でフィールドごとに2つの

連続読み取りを行うように設定します。